水產品中六溴聯苯測定方法的建立及應用分析

張龍飛，于慧娟，田良良，方長玲，黃冬梅，喬藝飄，史永富,

（1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.中國水產科學研究院東海水產研究所，農業農村部水產品質量監督檢驗測試中心（上海），上海 200090）

六溴聯苯（hexabromobiphenyls，HexaBBs）具有良好的阻燃性質，被廣泛用于電子電器、印刷、建筑等領域[1-2]。環境中的HexaBBs具有親脂性、持久殘留性以及遠距離傳遞等性質[3-8]，被國際癌癥組織機構列為可能會對人體產生致癌、致畸、致突變毒性的2A類有害物質[9]；我國于2014年，在《關于持久性有機污染物的斯德哥爾摩公約修正案》中增加HexaBBs等9 種受控的持久性有機污染物[10]。毒理學研究表明，HexaBBs的半數致死量為5.00 g/kg，可能在多溴聯苯中占有主導地位[11]，長期暴露于HexaBBs環境中，能引起生物體器官（如肝、腎、甲狀腺）功能異常[12-13]。

目前國內對HexaBBs的研究主要集中在浙江、長江三角洲等地的區域性研究上，主要包括電子垃圾、土壤、水鳥等環境和生物樣品[3,14]，多表現為以多溴聯苯醚為主要研究對象，且僅涉及個別HexaBBs單體[2,15-16]，鮮有對HexaBBs在水產品領域中的研究報道[17-18]；而國外的淡水魚[19-21]、海洋生物[1]、甚至在海洋環境介質中均有檢出HexaBBs[22]。國內關于HexaBBs在水生環境中蓄積特征的研究相對缺乏，且HexaBBs在水產品中的蓄積分布特征以及代謝轉化規律等方面的研究處于空白階段；目前國內尚未頒布關于測定環境和生物基質中HexaBBs的標準方法。因此，開發水產品中HexaBBs的分析方法，監測水產品中HexaBBs的殘留水平，對水產品質量安全以及通過飲食攝入HexaBBs所造成的風險進行評估并最終保護公眾健康至關重要。

HexaBBs和多溴聯苯的測定分析，常采用氣相色譜和氣相色譜-串聯質譜法[1,23-24]，而環境和生物基質的復雜性是影響準確定量痕量多溴聯苯的主要因素[25]；且對于大多生物樣品常采用索氏提取[26]、微波輔助萃取[25]、加速溶劑萃取并結合凝膠滲透色譜技術進行提取和凈化[27-28]，無法同時實現高選擇性、高回收率、快速簡單的目的[29]。本實驗對水產品中HexaBBs提取、凈化等樣品前處理條件以及HexaBBs氣相色譜行為進行研究，擬建立水產品中HexaBBs的定性定量方法，并對不同營養級水產品中HexaBBs的殘留水平和蓄積特征進行分析，以期為水產品樣品中HexaBBs的測定標準制定、監測其在水產品中的殘留水平以及評估HexaBBs在水產品質量安全領域中所造成的風險提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PBB153（2,2’,4,4’,5,5’-六溴聯苯）、PBB155（2,2’,4,4’,6,6’-六溴聯苯）、PBB156（2,3,3’,4,4’,5-六溴聯苯）、PBB159（2,3,3’,4,5,5’-六溴聯苯）（以上標準品質量濃度均為35 μg/mL，體積均為1 mL）美國Accustandard公司；PBB154（2,2’,4,4’,5,6’-六溴聯苯）（質量濃度為50 μg/mL，體積為1.2 mL） 美國Wellington公司；正己烷（色譜純） 美國Supelco公司；乙酸乙酯（色譜純） 美國Tedia公司；硅膠柱（500 mg/6 mL） 美國Agela Technologies公司。其他試劑為國產分析純。

1.2 儀器與設備

6890氣相色譜儀（配Ni 63電子捕獲檢測器） 美國Agilent公司；XYC-BDM-24全自動氮空吹掃濃縮儀上海析友儀器有限公司；DOP-B高通量組織研磨儀 上海萬柏生物科技公司；高速冷凍離心機 日本Hitach公司；B5510E-MT超聲波清洗機 美國必能信公司；JA12002天平 上海精天電子儀器有限公司；數顯型旋渦混合器 美國Tallboys公司；Milli-Q超純水系統（Q-Gard1預純化柱） 美國Millipore公司；LG100B理化干燥箱 上海實驗儀器總廠。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

標準溶液的配制：將35 μg/mL的PBB153、PBB155、PBB156、PBB159標準品和50 μg/mL的PBB154標準品用正己烷分別配制成3.50 μg/mL和6.00 μg/mL的標準中間液，密封，4 ℃保存。

混合標準工作液的配制：將5 種HexaBBs的標準中間液用正己烷分別配制成0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 ng/mL的6 種HexaBBs的混合標準工作液，密封，4 ℃保存。

1.3.2 樣品的制備

水產品樣品的預處理參考GB/T 30891—2014《水產品抽樣規范》附錄B：養殖及捕撈水產品的試樣制備[30]。

鯽魚、大黃魚清洗后去頭、骨、內臟，取肌肉、皮等可食部分絞碎混合均勻后備用；小龍蝦清洗后去蝦頭、蝦皮、腸腺，得到整條蝦肉絞碎混合均勻后備用；中華絨螯蟹清洗后取可食部分，絞碎混合均勻后備用；貝類清洗后開殼剝離，收集全部的軟組織和體液勻漿備用。

1.3.3 樣品前處理

稱取（1.00±0.05）g樣品于50 mL圓底塑料離心管中，加入10.0 mL乙酸乙酯，擰緊離心管蓋后于高通組織研磨儀中研磨（60 Hz、30 s），使樣品分散均勻后，超聲提取10 min；于4 ℃、10 000 r/min離心10 min，將有機相轉移至雞心瓶中，離心管的殘渣重復提取1 次，合并有機相；將提取液旋轉蒸發至干，用6.0 mL正己烷分3 次洗滌雞心瓶，洗滌液轉入50 mL圓底塑料離心管中。向離心管中加入3.0 mL濃硫酸，1 500 r/min旋渦混勻8 min；于4 ℃、10 000 r/min離心10 min；移取正己烷層至10.0 mL具塞玻璃離心管；硅膠柱（500 mg/6 mL）用10.0 mL正己烷活化平衡，將正己烷層轉移至活化硅膠柱上，并同時接收流出液，另取2.0 mL正己烷洗滌具塞玻璃離心管，一并上柱，最后進行氮吹至干，用1.0 mL正己烷復溶，待上機分析。

1.3.4 氣相色譜條件

6890氣相色譜儀配Ni 63電子捕獲檢測器，色譜柱為DB-17MS毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度：280 ℃；進樣體積：1 μL；進樣方式：不分流；載氣流速：1.2 mL/min；檢測器溫度：300 ℃；升溫程序：150 ℃保持1 min，以10 ℃/min升至310 ℃，保持8 min，共運行25 min。

1.4 數據處理

在配置有7683自動進樣器的6890氣相色譜儀進行HexaBBs的分析；并使用Agilent ChemStation B.04.02.[96]軟件程序通過外標法對水產品中HexaBBs進行定量，采用Microsoft Excel?軟件進行圖譜和表格的繪制。

2 結果與分析

2.1 色譜柱的優化

PBBs和多溴聯苯醚極性較弱，常采用HP和DB系列的毛細管柱進行色譜分離[15,23,31]。本研究對比HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）和DB-17MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）色譜柱的分離效果。使用HP-5MS色譜柱進行分離時，PBB155、PBB154、PBB153、PBB156、PBB159五種標準物質均出現不同程度的拖尾現象，對稱性較差，且PBB156和PBB159的響應值較低（圖1A），影響后期樣品痕量分析的精確度。而采用DB-17MS的色譜柱，5 種標準物質都能夠達到良好的基線分離，且峰形尖銳對稱（圖1B）；因此，選用DB-17MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）色譜柱能滿足5 種HexaBBs的分析要求。

圖1 10 ng/mL水平下5 種HexaBBs混合標準工作液在2 種色譜柱上的色譜圖Fig.1 Chromatograms of mixed solution of five HexaBB standards at 10 ng/mL on two different columns

2.2 提取試劑的選擇

HexaBBs是結構穩定、極性較弱、脂溶性較強的化合物，可采用多種有機溶劑對其進行提取。魚類中脂肪含量較高[32]，本研究以鯽魚作為代表性樣品，對比正己烷、乙酸乙酯、正己烷-乙酸乙酯（1∶1，V/V）、丙酮試劑在鯽魚樣品中加標量5.0 μg/kg的提取效果，結果見圖2。正己烷與丙酮的提取效果較低；且丙酮因其極性相對較大，能將水產品樣品中的水等強極性雜質提取出來，引入雜質較多，會影響后期固相萃取小柱的凈化效果和定量的準確性。乙酸乙酯和正己烷-乙酸乙酯（1∶1，V/V）對5 種HexaBBs的提取效果較好，且乙酸乙酯作為提取試劑，5 種HexaBBs回收率均在83.90%～100.78%之間，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為1.43%～3.43%，因此從整體和提取試劑的復雜性上分析，本研究采用乙酸乙酯作為HexaBBs的提取試劑。

圖2 4 種提取試劑對5 種HexaBBs的提取效果比較Fig.2 Comparison of extraction efficiencies of four solvents for extraction of five HexaBBs

2.3 乙酸乙酯體積的確定

為研究不同體積乙酸乙酯的提取效果，對水產品鯽魚進行加標回收率實驗，加標量為5.0 μg/kg，在單次提取液乙酸乙酯體積為2.0、3.5、5.0、10.0、15.0、20.0 mL的梯度水平下，對目標物回收率進行研究，結果見圖3。乙酸乙酯體積在2.0～10.0 mL之間，5 種HexaBBs的回收率與其呈正相關；體積為10.0、15.0、20.0 mL時并沒有明顯變化，且在20.0 mL時，各物質的回收率略有下降，可能是因為乙酸乙酯體積增大，旋轉蒸發濃縮時間延長，使得目標化合物在旋蒸過程中的損耗增加，造成目標物的定量結果降低。因此，從有機溶劑的消耗及回收率上分析，在乙酸乙酯體積為10.0 mL時，各目標物的回收率均在87.36%～106.89%之間，RSD為4.88%～6.74%，因此，將HexaBBs的最佳提取體積選定為10.0 mL。

圖3 乙酸乙酯體積對5 種HexaBBs的提取效果比較Fig.3 Comparison of extraction efficiencies of different volumes of ethyl acetate for extraction of five HexaBBs

2.4 凈化優化

2.4.1 濃硫酸凈化

環境和生物基質較為復雜，雜質較多，有效地去除雜質是準確定量痕量多溴聯苯的關鍵[25]，水產品中含有較多的脂肪等雜質，油脂會影響色譜柱固定相的表面活性，降低色譜柱的柱效率，影響峰形及定量結果的準確性。HexaBBs穩定性好，難以通過自然條件下的物理、化學或生物方法快速有效降解，濃硫酸并不能將其破壞[1,33]。因此本實驗采用濃硫酸進行去脂，在去脂的過程中，振搖要輕緩，以免樣品出現乳化現象，造成后期定量結果偏低，且濃硫酸應少量多次加入，直至上清液澄清。

2.4.2 SPE凈化

參考多溴聯苯醚在水產品中的凈化方式[34-35]，對硅膠柱、中性氧化鋁柱、堿性氧化鋁柱、酸性氧化鋁柱、弗羅里硅土柱5 種SPE小柱進行篩選，首先采用SPE小柱富集模式，將混合標準溶液上柱后的流出液、洗滌液以及洗脫液分別進行上機檢測，結果顯示：在洗滌液和洗脫液中并沒有檢測到目標物；這表明，5 種SPE小柱對5 種HexaBBs并沒有明顯的吸附作用，而多溴聯苯醚因含有O元素具有特殊性，比如在采用堿性氧化鋁SPE柱對含有多溴聯苯醚的樣品進行凈化時，其主要原因是O元素可以和柱中的填料形成較強的氫鍵作用而被吸附在柱子中[35]。因此本研究以鯽魚為例，加標量為5.0 μg/kg，采用SPE小柱的除雜模式，對比5 種SPE小柱的凈化效果，操作為：樣品液上柱后，并同時接收流出液，最后采用2.0 mL正己烷洗滌樣品瓶，洗滌液一并上柱，以確保各目標物的回收率。

氧化鋁對目標物保留的主要機制是偶極-偶極作用，可用于去除水產品提取液中極性較強的有機酸類等極性雜質。研究表明（圖4），酸性氧化鋁SPE柱比中性和堿性氧化鋁SPE柱的凈化效果要好，而中性和堿性氧化鋁SPE柱雜質較多，背景值較高；這可能是因為酸性氧化鋁可以進一步去除脂肪等雜質，從而達到更好的凈化效果；但是從圖4可以看出，當酸性氧化鋁SPE柱作為凈化柱時，PBB156的響應值較低，且回收率僅有65.82%，并不適合作為5 種HexaBBs的凈化柱。

圖4 鯽魚樣品固相萃取條件優化（氧化鋁SPE柱）Fig.4 Optimization of SPE conditions for C.auratus samples(using Alumina SPE cartridge)

弗羅里硅土SPE柱是硅膠鍵合氧化鎂的吸附劑，適合從非極性基質中吸附多環芳烴、多氯聯苯、脂肪等極性化合物。從圖5可以看出，采用弗羅里硅土SPE柱所產生的基質效應較大，其中PBB156的回收率為127.88%；凈化效果差，不僅會影響色譜柱和儀器的壽命，還會對后期定量的準確性產生影響。

圖5 鯽魚樣品固相萃取條件優化（弗羅里硅土SPE柱）Fig.5 Optimization of SPE conditions for C.auratus samples(using Florisil SPE cartridge)

硅膠表面具有一定數量的孤立硅羥基，孤立硅羥基能增加硅膠與極性物質之間的氫鍵作用、離子相互作用和偶極-偶極等相互作用，其數量能夠決定硅膠固相萃取SPE柱的吸附性能[36]。圖6表示采用硅膠SPE柱對5 種HexaBBs的回收率均在70%～110%之間，RSD為7.35%～9.17%，重復性好、背景值低、凈化效果最好，因此選用硅膠SPE柱對其進行凈化。

圖6 鯽魚樣品固相萃取條件優化（硅膠SPE柱）Fig.6 Optimization of SPE conditions for C.auratus samples(using silica SPE cartridge)

2.5 超聲條件的優化

為探究不同超聲時間的提取效果，對鯽魚、大黃魚、小龍蝦、中華絨螯蟹、貽貝5 種水產品樣品在加標量5.0 μg/kg、單次超聲時間為5、10、15、20 min的條件下，結果發現在4 個超聲時間水平下，其回收率并沒有明顯區別，考慮到不同水產品基質復雜的原因，選取超聲時間為10 min。

為探究有無超聲條件對不同水產品基質中HexaBBs的提取效果，對鯽魚、大黃魚、中華絨螯蟹3 種代表性水產品樣品分別加標5.0 μg/kg水平下進行有無超聲的對比實驗，結果見圖7。可以看出3 種水產品樣品在超聲條件下的提取效率都高于無超聲條件下的提取效率，但超聲條件對魚類（鯽魚和大黃魚）HexaBBs提取的影響較為明顯，對中華絨螯蟹的影響較弱，超聲條件下鯽魚、大黃魚以及中華絨螯蟹的加標回收率分別為91.45%～101.20%、92.17%～106.76%以及89.96%～108.92%，RSD分別為0.56%～3.42%、9.55%～13.32%以及5.58%～6.89%。因此，為擴大本方法的適用性，確定采用超聲條件提取水產品樣品中的HexaBBs。

圖7 HexaBBs在3 種水產品中有無超聲條件下的回收率Fig.7 Recoveries of HexaBBs in three aquatic products with or without ultrasonic treatment

2.6 線性范圍與檢出限

按照1.3.4節條件對5 種HexaBBs的6 個質量濃度混合工作溶液進行上機測定，以質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，在0.20～10.00 ng/mL范圍內，5 種HexaBBs的線性良好，線性相關系數均大于0.998。以信噪比RSN≥3和回收率在80%～120%范圍內確定檢出限為0.50 μg/kg，以信噪比RSN≥10和回收率在80%～120%范圍內確定定量限為1.00 μg/kg，各目標物的線性回歸方程、相關系數、檢出限、定量限見表1。

表1 5 種HexaBBs的線性回歸方程、檢出限和定量限Table 1 Linear calibration equations, detection limits and quantitation limits for five HexaBBs

2.7 準確度和精密度實驗結果

魚、蝦、蟹及貝類樣品的基體不同，在相同的前處理條件下，對鯽魚、大黃魚、小龍蝦、中華絨螯蟹、貽貝5 類水產品樣品分別添加相對于樣品中含1.00 μg/kg和5.00 μg/kg的5 種HexaBBs混合標準溶液。然后按照1.3.3節后續步驟平行測定3 個樣品，平均加標回收率及RSD見表2，鯽魚加標1.00 μg/kg和鯽魚空白樣品的5 種HexaBBs色譜出峰結果見圖8。在1.00、5.00 μg/kg水平下加標回收率在77.15%～118.14%之間，RSD在0.56%～13.32%之間。

表2 5 種HexaBBs的平均加標回收率和RSD（n =3）Table 2 Average spiked recoveries and RSD for five HexaBBs (n= 3)

圖8 鯽魚樣品中添加1.00 μg/kg（A）和空白樣品（B）的5 種HexaBBs色譜圖Fig.8 Chromatograms of five HexaBBs at spiked level of 1.00 μg/kg in C.auratus (A) and blank sample (B)

2.8 水產品中HexaBBs定量分析

采用本方法對淡水魚（鯽魚）、海水魚（大黃魚）、蝦（小龍蝦）、蟹（中華絨螯蟹）、貝（貽貝）5 種代表性水產品進行測定。如表3所示，其中鯽魚和中華絨螯蟹水產品中均檢測到PBB153和PBB155，這可能是因為鯽魚和中華絨螯蟹都屬于底層水域的雜食性水生生物，有研究表明，底泥的結構和表面特征被視為天然的吸附劑，持久性有機污染物具有親脂疏水性，底泥是其在水體環境的首要儲集之地[37-38]，鯽魚和中華絨螯蟹可能會通過攝食底層生物、碎屑以及直接接觸底泥環境而增大暴露于HexaBBs的概率。目前大黃魚多以養殖模式進行飼養，且在飼養過程中主要攝食加工的冰鮮魚和野生的蝦等甲殼類水生生物[39]，大黃魚可能會通過攝入被HexaBBs暴露的魚飼料或者通過食物鏈間的傳遞對HexaBBs產生蓄積效應。在小龍蝦和貽貝樣品中并沒有檢出HexaBBs，而中華絨螯蟹中HexaBBs的含量高于魚類（鯽魚和大黃魚），本實驗分析的中華絨螯蟹為性腺發育成熟的成年蟹，性腺中所含的脂肪含量較高，可能會蓄積更多的HexaBBs，這也表明在不同營養級的水產品中可能存在著HexaBBs蓄積差異。在所檢出的中華絨螯蟹、鯽魚和大黃魚水產品中，HexaBBs含量在0.220～0.430 μg/kg范圍內，均小于檢出限；雖然多溴聯苯在全球被較早限用，在魚類、蟹類等水產品中的含量較低，但在相對高等的水生生物中卻有所不同，De Boer等[22]對取自荷蘭北部瓦登海的海豹脂肪中測定出13～61 μg/kg的PBB153，約占總HexaBBs的1/3；Von Der Recke等[1]的研究也表明PBB153在海豚、海豹等生物中的蓄積水平較高，HexaBBs在環境中具有持久殘留性、親脂性等性質，這可能表明HexaBBs能經食物鏈的傳遞產生生物放大效應，特別是脂肪含量較高的水生生物，仍然存在著蓄積隱患，可能會降低水產品的食用安全系數，并增加食物鏈終端人類的暴露風險；馬玉等[17]所報道的加拿大淡水魚中多溴聯苯總殘留量處于0.21～2.40 μg/kg水平。通過對實際水產品樣品的分析說明在水產品中HexaBBs的痕量殘留可能會與不同營養級的水生生物相關。

表3 水產品中5 種HexaBBs的分析結果Table 3 Results of analysis of five HexaBBs in aquatic products

本研究雖分析的樣品數量較少，但包含了魚、蝦、蟹、貝類中的代表性水產品樣品，且在中華絨螯蟹、鯽魚、大黃魚中均檢出HexaBBs，雖然國內并沒有頒布關于水產品中HexaBBs限值相關的法規和標準，但近些年國內外水產品中多次檢出HexaBBs，應當引起重視，并開展相關方面的研究。

3 結 論

本實驗對水產品樣品中HexaBBs前處理和色譜行為等條件進行研究，建立水產品中HexaBBs的定性定量分析方法，確定以乙酸乙酯為提取試劑、超聲10 min，經濃硫酸去脂，硅膠SPE柱凈化；檢出限為0.50 μg/kg，定量限為1.00 μg/kg；并對淡、海水中5 種代表性水產品進行了實際分析，發現不同營養級的水產品中可能存在不同的HexaBBs蓄積特征，對于脂肪含量高且處于底層水域的雜食性水產品可能會有HexaBBs易于富集的趨勢，表明HexaBBs在不同營養級的水產品中可能存在殘留隱患。HexaBBs在多溴聯苯中具有較高的毒理效應，選取5 種代表性HexaBBs進行不同營養級水產品樣品的研究分析，為多種多溴聯苯在大批量水生生物樣品的測定及多溴聯苯在不同水域、不同營養級水生生物中的蓄積分布特征研究提供了參考；本研究建立的方法可以為水產品中HexaBBs的殘留水平進行測定、監測以及評估HexaBBs在水產品質量安全領域中所造成的風險提供技術支持。