大麥染色體特異IT分子標記的篩選

李紅斌，劉志鵬，徐 濤，肖 進，王秀娥，王海燕

(作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室/JCIC-MCP，南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，南京 210095)

現(xiàn)有小麥品種遺傳基礎(chǔ)日趨狹窄已成為目前小麥育種取得突破性進展的主要瓶頸[1]。小麥近緣種屬蘊藏豐富的抗逆、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)等基因資源，通過遠緣雜交將近緣物種中的優(yōu)良基因?qū)氲狡胀ㄐ←湥峭貙捫←溸z傳基礎(chǔ)、推進小麥育種取得突破性進展的有效途徑之一[2-4]。

大麥屬于小麥族中的大麥亞族(Hordeinae)，其中只有栽培大麥(HordeumvulgareL., 2n = 2x = 14, HH)在小麥育種工作中得以利用。其中大麥所含有的抗黃矮病、抗穗發(fā)芽、早熟、耐冷、耐鹽和耐貧瘠等優(yōu)良性狀，是小麥遺傳性狀改良的重要基因資源[5-11]。為了將大麥中的優(yōu)異基因?qū)氲皆耘嘈←溒贩N中，研究者們從 1896 年開始就進行小大麥雜交試驗，但直到1973 年，丹麥科學(xué)家Kruse首次報道利用六倍體普通小麥給二倍體大麥授粉，得到了小麥-大麥雜種植株[12]。在Kruse研究成果鼓勵下，世界上許多科學(xué)家都開始了大小麥之間的雜交實驗。隨后的研究者相繼創(chuàng)制出了普通小麥中國春-大麥Betzes、普通小麥Mv9kr1-大麥Igri、普通小麥Asakaze-大麥Manas二體異附加系、端體異附加系、小麥-大麥二體異代換系[13-17]。例如Islam等[18]以普通小麥‘中國春’為母本、大麥Betzes為父本創(chuàng)制出除1H染色體異附加系和1HL雙端體異附加系的一整套小大麥整條和雙端體異附加系，研究發(fā)現(xiàn)由于大麥1H染色體長臂上的Shw不育基因可以引起異附加系減數(shù)分裂異常，從而導(dǎo)致植株不育，因此未獲得小-大麥1H異附加系。Yuan等[13]從小麥品種(CS)×大麥品種Betzes(H.vulgareL. cv. Betzes)的雜種后代中獲得了一套能夠穩(wěn)定遺傳的小-大麥異代換系。2016年Türk?si等[19]利用Asakaze/Manas小麥-大麥雜交種創(chuàng)制出一套小麥-大麥雙端體異附加系(包括2HS、2HL、3HS、3HL、4HS、4HL、6HS、6HL、7HS、7HL)，研究發(fā)現(xiàn)普通小麥背景中加入7HL染色體臂可提高小麥的耐鹽性。 在小麥-大麥異附加系和異代換系的基礎(chǔ)上，研究者們進一步利用染色體配對控制體系和殺配子染色體效應(yīng)創(chuàng)制了一系列小麥-大麥易位系[20-22]。另外也有通過自發(fā)產(chǎn)生小麥-大麥易位系的報道[23-24]。這些材料的獲得對于進一步向小麥背景中轉(zhuǎn)移大麥有益基因奠定了堅實的基礎(chǔ)。

準確高效無誤的鑒定外源染色體身份，對加速小麥種質(zhì)資源創(chuàng)新和利用，提高外源染色體的選擇效率，降低勞動成本具有重要的現(xiàn)實意義。小麥遺傳背景中大麥染色體的檢測手段主要有形態(tài)學(xué)鑒定、細胞學(xué)鑒定(包括染色體核型、帶型分析等)、生化標記鑒定(同工酶和蛋白質(zhì))和基因組原位雜交等技術(shù)，這些技術(shù)不僅難度大、費時費力，而且在鑒定小片段外源染色體方面具有一定的局限性。然而分子標記技術(shù)由于可直接在DNA分子水平上進行檢測，能夠準確鑒定出小麥中外源染色體片段的組成、大小和位置，尤其是高密度的分子標記對于精確鑒定外源染色體的易位身份具有重要意義。2012年以來，國際大麥基因組測序聯(lián)盟陸續(xù)發(fā)表了大麥基因組和泛基因組高質(zhì)量物理圖譜，基因組序列信息的發(fā)布必將提高大麥特異性分子標記開發(fā)的效率[25-26]。目前，用于鑒定小麥背景中的大麥染色質(zhì)常用的分子標記主要有RFLP[27-28]、STS-PCR[29-30]、SSR[31-32]和AFLP[33-36]等，但是分子標記的數(shù)量和密度還較低，利用這些標記來鑒定大量的大麥染色體結(jié)構(gòu)變異體是遠遠不夠的，而且也嚴重阻礙了大麥基因資源在小麥遺傳改良中的應(yīng)用。

IT(intron targeting)分子標記是基于EST(expression sequence tag)序列發(fā)展而來的新型分子標記[37]。IT標記的優(yōu)勢是它的擴增產(chǎn)物包含了變異頻率更大的內(nèi)含子區(qū)域，內(nèi)含子區(qū)域由于不編碼功能蛋白，除少數(shù)是作為順式作用元件，大多是不受選擇，因此保守性差，變異高；同時IT標記是在保守的外顯子上設(shè)計的，因此即保證了標記的通用性，即在大多小麥族染色體組都可以擴增，也保持了標記的高多態(tài)性[38]。相比EST標記具有更高的多態(tài)性、擴增條帶清晰、分辨率高而且這種分子標記在外源物種中具有很好的轉(zhuǎn)移性。 Wang等[39]根據(jù)簇毛麥4VS的染色體分揀以及測序信息，通過與4AL、4BS、4DS以及粗山羊草的4DS的內(nèi)含子區(qū)域進行比較，開發(fā)了359個IT標記，其中232個標記可以在T4VS·4DL易位系上進行特異性擴增，多態(tài)率為64.62%。Zhang等[40]利用簇毛麥survey序列信息和小麥基因組測序信息開發(fā)了1 624個IT標記，其中841個標記定位到簇毛麥1V-7V染色體上，多態(tài)率為51.79%。

簇毛麥與大麥同屬于小麥的三級基因資源庫，它們與小麥具有很好的共線性關(guān)系，因此，本研究充分利用小麥基因組學(xué)和大麥基因組學(xué)的最新成果，結(jié)合比較基因組學(xué)分析，利用實驗室前期基于簇毛麥和普通小麥D亞基因組設(shè)計的2 267個IT分子標記，在普通小麥‘中國春’-Betzes大麥二體異附加系(2H～7H)進行擴增，篩選在大麥各條染色體特異的IT分子標記。本研究篩選到的大麥各染色體特異的分子標記對于大麥優(yōu)異基因向小麥背景中轉(zhuǎn)移和分子標記輔助選擇育種提供快速高效的鑒定手段。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本試驗所用到的材料包括從美國堪薩斯州立大學(xué)小麥遺傳資源中心引進的普通小麥‘中國春’-Betzes大麥二體異附加系DA2H(TA#3698)、DA3H(TA#3699)、DA4H(TA#3670)、DA5H(TA#3671)、DA6H(TA#3672)和DA7H(TA#3697)；普通小麥‘中國春’(T.aestivumcv. Chinese spring，CS)和大麥(Hordeumvulgare，Golden promise)。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物本研究標記來自于Wang等[39]和Zhang等[40]以及實驗室新開發(fā)的IT分子標記總計2 267個，分別分布在簇毛麥的1V(267個)、2V(333個)、3V(211個)、4V(569個)、5V(327個)、6V(360個)和7V(200個)染色體。該類分子標記是基于簇毛麥V基因組與‘中國春’A、B和D亞基因組間同一基因內(nèi)含子間的大小差異開發(fā)的，由上海金唯智生物公司合成。

1.2.2 PCR擴增及電泳檢測PCR擴增反應(yīng)總體系為10 μL，其中1 μL模板80～200 ng/μL DNA，5 μL 2×Master Mix， 3.6 μL 超純水，左右引物各0.2 μL。擴增程序為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，56～60 ℃退火30 s(依據(jù)引物的退火溫度)，72 ℃延伸50 s，共32個循環(huán)；最后72 ℃延伸6 min。

在PCR擴增產(chǎn)物中加入2.0 μL 上樣緩沖液，離心，取1.5～2 μL PCR擴增產(chǎn)物加入8%聚丙烯酰胺凝膠中(39∶1)進行電泳檢測。電泳緩沖液1×Tris-硼酸(TBE)緩沖液，電泳電壓200 V，電泳時間50 min左右。電泳結(jié)束后，參照銀染法對PCR擴增產(chǎn)物進行檢測。銀染方法：用0.1%硝酸銀溶液染10～15 min，用超純水沖洗30 s，再用2%氫氧化鈉和1%甲醛混合溶液染5～10 min后，用自來水沖洗2～3次，置于膠片觀察燈上拍照并進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

1. Marker; 2. ‘中國春’; 3.大麥；4. DA2H; 5. DA3H; 6. DA4H; 7.DA5H; 8. DA6H; 9. DA7H；類型Ⅰ的IT標記從上到下分別是大麥1H-7H染色體特異的分子標記CINAU1748、CINAU1812、CINAU1969、CINAU2247、CINAU1433、CINAU1513、CINAU1599；類型Ⅱ的IT標記從上到下分別是大麥1H-7H染色體特異的分子標記CINAU1710、CINAU1058、CINAU1211、CINAU1347、CINAU2301、CINAU1523、CINAU1581；類型Ⅲ的IT標記從上到下分別是大麥1H-7H染色體特異的分子標記CINAU879、CINAU1099、CINAU1209、CINAU2253、CINAU1382、CINAU1525、CINAU1495。圖2、4的泳道1-9同圖1 IT標記在大麥和大麥異附加系中的擴增結(jié)果1. Marker DNA ladder; 2. Chinese Spring; 3. Barley; 4. DA2H; 5. DA3H; 6. DA4H; 7. DA5H; 8. DA6H; 9. DA7H; The IT markers of type Ⅰ are CINAU1748, CINAU1812, CINAU1969, CINAU2247, CINAU1433, CINAU1513, CINAU1599, specific for barley chromosome of 1H, 2H, 3H, 4H, 5H, 6H and 7H from top to bottom, respectively; The IT markers of type Ⅱ are CINAU1710, CINAU1058, CINAU1211, CINAU1347, CINAU2301, CINAU1523, CINAU1581; The IT markers of type Ⅲ are CINAU879, CINAU1099, CINAU1209, CINAU2253, CINAU1382, CINAU1525, CINAU1495. 1-9 are the same as in Fig.2 and Fig.4Fig.1 The amplification of IT markers in barley and its disomic additional lines

2 結(jié)果與分析

2.1 大麥染色體特異分子標記的分類

利用實驗室前期開發(fā)的2 267個IT分子標記在‘中國春’、大麥和普通小麥-大麥二體異附加系中進行PCR擴增，篩選大麥染色體特異分子標記。分子標記的擴增條帶參照Wang等[39]對IT分子標記的分類，將分子標記分為3種。類型Ⅰ，這類分子標記總共可以擴增出4條帶，其中1條帶是大麥染色體所特異的，另外3條帶分別來自于普通小麥A、B、D 3個亞基因組，這種類型分子標記不僅可以檢測大麥染色體，還可以同時區(qū)分A、B、D 3個亞基因組，這種類型的分子標記稱為共顯性的分子標記；類型Ⅱ，這類分子標記總共可以擴增出3條帶，其中1條帶是大麥染色體所特異的，另外2條帶分別來自于小麥A、B、D 3個亞基因組中的任意2個亞基因組；類型Ⅲ，這類分子標記總共可以擴增出2條帶，其中一條帶是大麥染色體所特異的，另外一條帶來自于小麥A、B、D 等3個亞基因組中的任一個亞基因組、任2個亞基因組或3個亞基因組。圖1展示了部分引物的擴增結(jié)果。

2.2 大麥各條染色體特異分子標記的篩選

2 267個IT分子標記擴增結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2 095個分子標記在‘中國春’和大麥中都有擴增位點，占總標記數(shù)的92.41%。在這2 095個標記中，有534個IT標記在大麥和普通小麥-大麥二體異附加系中的一個二體異附加系中擴增出相同的條帶，而與‘中國春’和其他二體異附加系中擴增出的條帶不同，那么這個標記就可以作為這個二體異附加系所對應(yīng)的大麥染色體的特異分子標記，約占總標記總數(shù)的23.56%，7個部分同源群的多態(tài)標記比率在18.04%～36.33%之間(表1)。

表1 IT分子標記在普通小麥-大麥二體異附加系中的擴增結(jié)果

由于該套異附加系中沒有涉及大麥1H染色體的二體異附加系，本研究通過排除法來篩選大麥1H染色體特異的IT分子標記。如果該引物在大麥中存在特異性擴增條帶，然而該引物在普通小麥-大麥2H～7H二體異附加系的擴增條帶與‘中國春’都相同，推測該引物擴增出的特異條帶位點來自于大麥1H染色體，該分子標記是大麥1H染色體特異分子標記。按照此思路，第一部分同源群的267個IT標記中，有261個標記在‘中國春’、大麥和大麥異附加系中具有擴增產(chǎn)物，占97.75%；其中96個IT標記在大麥中擴增出與‘中國春’和2H～7H染色體異附加系不同的條帶，推測這些IT分子標記可能為大麥1H染色體的特異分子標記，這些標記數(shù)目占第一部分同源群標記總數(shù)的35.95%；其中類型為Ⅰ的共顯性分子標記、類型Ⅱ和類型Ⅲ分子標記分別為17個、25個和54個，分別占第一部分同源群標記總數(shù)的6.37%、9.36%和20.22%(表1)。

另外還發(fā)現(xiàn)，原來定位于第一部分同源群的標記CINAU1736 和CINAU1691分別在大麥3H和4H二體異附加系中擴增出與大麥相同的特異條帶，因此標記CINAU1736 和CINAU1691分別可以作為大麥3H和4H染色體的特異分子標記(圖2)。

在第二部分同源群的333個IT標記中， 84個IT標記在大麥和普通小麥-大麥2H異附加系中擴增出大小相同的特異條帶，是2H染色體特異分子標記，占第二部分同源群IT分子標記總數(shù)的25.23%。這些2H特異標記中，18個為類型Ⅰ的共顯性分子標記，約占第二部分同源群IT分子標記總數(shù)的5.41%；30個為類型Ⅱ的特異分子標記，約占第二部分同源群IT分子標記總數(shù)的9.01%；36個為類型Ⅲ的特異分子標記，約占第二部分同源群IT分子標記總數(shù)的10.81%(表1)。

第三部分同源群的211個IT標記中，有191個標記在‘中國春’、大麥和大麥3H異附加系中具有擴增產(chǎn)物，占第三部分同源群標記總數(shù)的90.52%；其中60個IT標記是大麥3H染色體的特異分子標記，占第三部分同源群標記總數(shù)的28.44%；其中共顯性分子標記類型Ⅰ為7個，類型Ⅱ和Ⅲ分別有18和35個，分別占第三部分同源群標記總數(shù)的3.32%、8.53%和16.59%(表1)。

第四部分同源群的569個IT標記中，有519個標記在‘中國春’、大麥和大麥異附加系中具有擴增產(chǎn)物，約占第四部分同源群標記總數(shù)的91.21%；其中105個IT標記是大麥4H染色體的特異分子標記，占第四部分同源群標記總數(shù)的18.45%；其中共顯性分子標記類型Ⅰ為24個，類型Ⅱ和Ⅲ分別有35和46個，分別占第四部分同源群標記總數(shù)的4.22%、6.15%和8.08%(表1)。

第五部分同源群的327個IT標記中，310個標記在‘中國春’、大麥和大麥異附加系中具有擴增產(chǎn)物，約占第五部分同源群標記總數(shù)的94.80%；其中59個IT標記是大麥5H染色體的特異分子標記，占第五部分同源群標記總數(shù)的18.04%；其中共顯性分子標記類型Ⅰ為14個，類型Ⅱ和Ⅲ分別有23和22個，分別占第五部分同源群標記總數(shù)的4.28%、7.03%和6.73%(表1)。

第六部分同源群的360個IT標記中，345個標記在‘中國春’、大麥和大麥異附加系中具有擴增產(chǎn)物，約占第六部分同源群標記總數(shù)的95.83%；其中80個IT標記是大麥6H染色體的特異分子標記，占第六部分同源群標記總數(shù)的22.22%；其中共顯性分子標記類型Ⅰ為13個，類型Ⅱ和Ⅲ分別有31和36個，分別占第六部分同源群標記總數(shù)的3.61%、8.61%和10.00%(表1)。

第七部分同源群的200個IT標記中，192個標記在‘中國春’、大麥和大麥異附加系中具有擴增產(chǎn)物，約占第七部分同源群標記總數(shù)的96.00%；其中50個IT標記是大麥7H染色體的特異分子標記，其約占第7部分同源群標記總數(shù)的25.00%；其中共顯性分子標記類型Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ分別有13、17和 20個，分別占第七部分同源群標記總數(shù)的6.50%、8.50%和10.00%(表1)。

2.3 大麥特異IT分子標記物理圖譜的構(gòu)建

為了驗證篩選的大麥各染色體特異分子標記的可靠性，進一步利用小麥族多基因組學(xué)網(wǎng)站(http://202.194.139.32/blast/viroblast.php)，同時利用大麥參考基因組序列(Barley genome，https://www.nature. com/ articles/ nature22043)[25]，通過blastn(版本2.10.1+，設(shè)置E=1)將這些標記對應(yīng)的原始基因序列比對到大麥的參考基因組中，通過人工篩選，挑選出相似度最高的序列的物理位置，構(gòu)建了一張大麥各染色體特異分子標記在大麥全基因組的物理圖譜(圖3)。從圖中可以發(fā)現(xiàn)，在之前篩選到的534個大麥各染色體特異的分子標記中，有531個分子標記所對應(yīng)的基因序列都能比對到大麥同源群對應(yīng)的參考基因組中，進一步說明大麥跟小麥之間具有很好的共線性。其中有3個分子標記(CINAU800、CINAU1734和CINAU1796)所對應(yīng)的基因序列比對不到大麥基因組中，有可能在大麥中不存在此基因的同源基因。在這3個標記中，有2個來自1V染色體(CINAU1796、CINAU1734)，1個來自4V染色體(CINAU800)，并且這3個標記在大麥的1H或4H上均能擴增出特異條帶(圖4)。另外，從圖2中可以看出，之前來自于1V染色體的分子標記CINAU1736 和CINAU1691對應(yīng)的基因序列分別比對到大麥的3H和4H染色體上，進一步說明這兩個分子標記分別可以作為大麥3H和4H染色體的特異分子標記(圖2)。由于本研究中沒有涉及大麥1H染色體的二體異附加系，在篩選大麥1H染色體特異分子標記的時候，運用排除法，通過圖2可進一步證實除了分子標記CINAU1736 和CINAU1691之外，其他篩選到的1H染色體特異分子標記是可靠的。

左圖標記為CINAU1736，右圖標記為CINAU1691圖2 分子標記CINAU1736和CINAU1691在大麥和大麥異附加系中的擴增結(jié)果The marker in left figure is CINAU1736, and the other is CINAU1691Fig.2 The amplification of molecular markers CINAU1736 and CINAU1691 in barley and its disomic additional lines

圖3 大麥染色體特異IT標記的物理位置Fig.3 Physical mapping of IT markers specific to chromosomes of Hordeum vulgare

左圖標記為CINAU1734，中間標記為CINAU1796，右圖標記為CINAU800圖4 不同分子標記在大麥和大麥異附加系中的擴增結(jié)果The marker in left figure is CINAU1734, in the middle is CINAU1796, and in the right is CINAU800Fig.4 Amplification of the different markers in barley and its disomic additional lines

3 討 論

自20世紀以來，將小麥野生近緣物種中的優(yōu)異基因轉(zhuǎn)移到普通小麥是小麥育種的重要策略之一。目前，鑒定小麥背景中的外源染色體及染色體片段主要方法是分子細胞遺傳學(xué)和分子標記。利用分子細胞遺傳學(xué)技術(shù)原位雜交可以有效地檢測小麥背景中的外源染色體身份，但是原位雜交技術(shù)步驟繁瑣、耗時長，分子標記是一種快速、高效且準確的檢測外源染色體的方法，可以彌補分子細胞遺傳學(xué)鑒定的不足，對外源易位材料進行更精細的鑒定。在小麥野生近緣種基因組序列匱乏的情況下，以往野生物種的標記多來自普通小麥，如RFLP、SSR、EST標記等。但這類標記多數(shù)是根據(jù)小麥基因組設(shè)計，向近緣物種的轉(zhuǎn)化效率低，可在近緣物種中利用的標記數(shù)目少，遠不能滿足外源染色質(zhì)追蹤和外源目標基因定位的需求。例如秦丹丹等[41]利用416個小麥SSR標記在157份大麥材料中進行擴增，最終僅發(fā)現(xiàn)有54個SSR標記能擴增出清晰且多態(tài)性穩(wěn)定的條帶，其多態(tài)率為12.98%；Varshney等[42]根據(jù)111 090個大麥EST序列設(shè)計了2 823個EST-SSR分子標記，結(jié)果只篩選到大麥染色體特異的185個EST-SSR標記，多態(tài)率為6.55%。在簇毛麥中，曹亞萍等[43]和Zhao等[44]分別根據(jù)小麥的EST序列，開發(fā)了240個EST-STS分子標記和607個 EST分子標記，最終只篩選到簇毛麥染色體特異的分子標記分別是13個和58個，多態(tài)率分別是5.42%和9.56%。

相對于其他標記，IT標記的優(yōu)勢是它的擴增產(chǎn)物包含了變異頻率更大的內(nèi)含子區(qū)域，具有更高的多態(tài)性和穩(wěn)定性；小麥近緣物種基因組測序信息的釋放，使高通量開發(fā)IT標記成為可能。Wang等[39]在4VS上開發(fā)了359個IT分子標記，其中有232個標記可以擴增出簇毛麥特異性條帶，多態(tài)率達到64.62%；Zhang等[40]利用簇毛麥和小麥基因組測序信息開發(fā)了1 624個IT標記，其中841個標記定位到簇毛麥1V-7V染色體上，多態(tài)率為51.79%。本研究利用此套引物，共篩選到大麥染色體特異的分子標記534個，多態(tài)率為23.56%，也略高于其他大麥分子標記。這些研究結(jié)果表明該套IT標記，不僅能在簇毛麥染色體上具有較高的擴增多態(tài)性，在其他小麥屬的野生近緣種中也具有較高的可轉(zhuǎn)移性。當然，在實際應(yīng)用中，這類標記不僅可以鑒定小麥背景中的外源染色體，同時在比較基因組學(xué)、分類研究和基因分型等方面都具有重要的應(yīng)用價值。因此，可以認為IT標記是一種多態(tài)性高、穩(wěn)定性好、低成本的小麥屬野生近緣種的特異分子標記之一。