金線蓮花藥發育中的鈣離子分布特征

陳育青，李秋靜，賴鐘雄，林美珍*

(1 漳州衛生職業學院 藥學系，福建漳州 363000；2 福建農林大學 園藝植物生物工程研究所，福州 350002)

金線蓮(Anoectochilusroxburghii)是蘭科(Orchidaceae)多年生草本植物，主產于福建、浙江、云南等地。金線蓮具有祛風利濕、平衡陰陽、扶正固本、消炎解毒、清熱涼血等功效，民間常煲湯、泡茶、煎煮等做成藥膳，用于潤肺止咳、保肝降脂、降血糖血壓、抗腫瘤及提高免疫力等治療，是一種經濟價值較高的功能性藥食兩用植物[1]。目前市場上產業化栽培金線蓮均是組培苗繁殖，導致物種退化。探索金線蓮有性繁殖特性是保護金線蓮種質資源、發展金線蓮產業的關鍵研究基礎。然而，有關金線蓮的有性繁殖研究極少報道，大多數基礎研究集中在其藥效成分和藥理作用。

鈣是植物生命中的基本元素，調控許多重要的生理代謝活動[2-3]。鈣離子在植物細胞中的生理功能已有報道[4-6]，高等植物有性生殖過程中鈣離子的分布特征和生理功能也有報道[7]。花藥是植物雄性器官，結構復雜，其發育是一個精確調控的生物學過程。大多數植物的花藥壁由4層藥壁細胞組成，它們緊密相連，但形態、結構和功能不同。花粉(雄配子體)的發育伴隨著一系列細胞形態和結構的變化，有些變化顯示出鈣離子參與調控花藥發育，但因植物種類不同而異。前期作者團隊已對金線蓮花藥發育的結構特征進行了研究[8]，本研究對金線蓮花藥發育中鈣離子的分布特征及其生理功能進行分析討論。

1 材料和方法

實驗材料來自于福建省漳州市南靖草本養生生物科技有限公司的二年生組培苗，經鑒定為蘭科金線蓮(Anoectochilusroxburghii)。金線蓮常在11-12月開花，總狀花序由2～6朵花組成，每星期取樣1次，共取樣8次，每次采集約20個花藥。先將花藥固定在由0.1 mol/L的磷酸緩沖液配制的2.5%(V/V)戊二醛固定液中[固定液中還加入1%焦銻酸鉀(K2H2Sb2O7·4H2O)固定鈣離子]。組織細胞中的鈣定位原理是銻可與鈣結合形成焦銻酸鈣沉淀顆粒，在電子顯微鏡觀察中，電子束不能穿過沉淀顆粒而形成黑色斑點[9]。各時期花藥在戊二醛前固定液中室溫固定3 h。用含1%焦銻酸鉀的0.1 mol/L磷酸緩沖液換洗3次，每次30 min。之后，已換洗的花藥在含1%鋨酸和1%焦銻酸鉀的后固定液中4 ℃再固定12 h。用雙蒸水換洗3次后，系列丙酮脫水，Epon 812樹脂滲透、包埋。包埋的花藥用Leica Ultracut R超薄切片機做70 nm厚的切片，用醋酸2%雙氧鈾染色20 min。切片干燥后用透射電子顯微鏡(日立HT-7800，日本)觀察、拍照。

2 結果與分析

金線蓮花冠為左右對稱，外形呈蜘蛛狀，唇瓣2裂，裂片舌狀條形，中間頸部的兩側各具5～6枚流蘇狀細裂條(圖版Ⅰ，A)。金線蓮每花有2個呈水滴狀的花藥，2個花藥下方基部相連(圖版Ⅰ，B)。剝開花藥，可見許多呈條形的花粉塊。花粉塊的形態大小不一，有的呈一端大一端小的鐮刀形，有的呈長條形或索狀，其體積相差較大(圖版Ⅰ，C)。

花藥包括花藥壁和藥室，在藥室中產生小孢子，并逐漸發育形成雄配子體，即花粉。本研究結果根據金線蓮花藥的發育過程，分別描述其鈣離子的分布特征。

2.1 花藥壁特征及鈣離子分布

在花藥發育早期，花藥壁結構由外向內為表皮(Ep)、藥室內壁(En)、中層(ML)和絨氈層(T)組成。在造孢細胞時期，花藥壁細胞已明顯分化，表皮和藥室內壁細胞開始液泡化，但中層和絨氈層細胞的液泡化程度很低。絨氈層以內為造孢細胞(SC)，可見小液泡(圖版Ⅰ，D)。在開始液泡化的表皮細胞，其液泡(V)的表面上分布較多鈣沉淀顆粒(圖版Ⅰ，E)，顯示鈣離子與表皮細胞中的液泡形成有關。表皮細胞中一些質體合成淀粉粒(S)的現象也很明顯。花藥壁的最內層是絨氈層細胞(T)，這些細胞中有一個大的細胞核(n)，含有濃厚的細胞質。雖然在絨氈層細胞之間的徑向壁中有一些鈣沉淀顆粒，但在絨氈層細胞內鈣沉淀顆粒很少(圖版Ⅰ，F)。在絨氈層內切向面的藥室內為造孢細胞(SC)。造孢細胞的細胞壁有差異，一些較厚的細胞壁(箭頭所示)已顯示條形花粉塊的界限(圖版Ⅰ，G)。在花粉塊內造孢細胞之間的壁較薄，與花粉塊界壁有一定區別，顯示金線蓮花粉塊的形成在造孢細胞時期就已確定。

2.2 造孢細胞時期鈣的分布特征

造孢細胞的細胞核大，占據了細胞中央大部分空間。細胞核中的核仁清晰，染色質無規律分布。造孢細胞的四周細胞壁厚薄不同，較厚的為花粉塊的界壁，較薄的為花粉塊內部的細胞壁。造孢細胞中一些細胞器和小液泡分散在細胞核周圍(圖版Ⅰ，H)。在造孢細胞的細胞壁中鈣沉淀顆粒較大，細胞質中鈣沉淀顆粒較小。造孢細胞中的鈣沉淀顆粒分布有一定特異性，細胞質中的鈣沉淀顆粒主要分布在液泡(V)和質體(P)表面(圖版Ⅰ，I)。當質體表面附有較多鈣沉淀顆粒時，質體內部開始出現淀粉粒(圖版Ⅱ，A)，暗示鈣離子可能與淀粉合成有關。在細胞核中有較多的鈣沉淀顆粒，主要分布在核質部位，染色質中鈣沉淀顆粒較少(圖版Ⅱ，B)，呈現出鈣沉淀顆粒特異分布。

圖版Ⅰ 金線蓮花和花藥結構A.金線蓮花形態；B.金線蓮的花藥；C.金線蓮的花粉塊；D.金線蓮花藥橫切，示花藥壁結構：表皮(Ep)、藥室內壁(En)、中層(ML)、絨氈層(T)、造孢細胞(SC)；E.花藥表皮細胞(Ep)結構和其中的鈣沉淀顆粒分布，淀粉粒(S)、液泡(V)；F.花藥絨氈層細胞(T)結構和其中的鈣沉淀顆粒分布；G.花藥中部的造孢細胞(SC)出現了花粉塊的界限(箭頭)；H.示花粉塊中的造孢細胞(SC)和細胞核(n)；I.造孢細胞(SC)中的鈣沉淀顆粒分布在液泡(V)和質體(P)表面Plate Ⅰ Flower and anther structure of Anoectochilus roxburghiiFig. A. Flower morphology of A.roxburghii; Fig.B. Anther of A.roxburghii; Fig.C. Pollinium of A.roxburghii; Fig.D. Cross section of the anthers shows anther wall structure: epidermis (Ep), endothecium (En), middle layer (ML), tapetum (T), sporogenous cell (SC); Fig.E. Structure of anther epidermal cells (Ep) and distribution of calcium precipitates in it. Starch (S), Vacuole (V); Fig.F. Anther tapetum cell (T) structure and distribution of calcium precipitates in it; Fig.G. The sporogenous cell (SC) in the middle of the anther appear the boundary of pollinium (arrow); Fig.H. Show the sporogenous cell (SC) in the pollinium and nucleus (n); Fig.I. Calcium precipitates distribution on the surface of vacuole (V) and plastid (P)

2.3 小孢子母細胞時期鈣的分布特征

由造孢細胞發育到花粉母細胞時期常有一些區分特征。但金線蓮是花粉塊發育，未觀察到植物經典花粉母細胞的形態，只能根據取材時間和細胞的結構特征來確定小孢子母細胞時期。金線蓮小孢子母細胞的明顯特征是分裂前染色質(體)靠核膜分布(圖版Ⅱ，C)。與造孢細胞相比，小孢子母細胞的結構沒有很大變化，細胞質中質體和液泡明顯，但其他細胞器難以區分；細胞中的鈣沉淀顆粒仍然較多分布在細胞核基質中，在染色質中較少，同時細胞質中的鈣離子顆粒也較少(圖版Ⅱ，D)。然而，分裂前的小孢子母細胞核中的鈣沉淀顆粒數量明顯增加，主要仍然分布在核基質中(圖版Ⅱ，E)。伴隨著小孢子母細胞的分裂，核膜破裂，染色(質)體分為二組排列，之間有大量的鈣沉淀顆粒分布(圖版Ⅱ，F)，暗示鈣離子可能參與調控小孢子母細胞的分裂過程。在小孢子母細胞的細胞壁中，鈣沉淀顆粒數量明顯增加。細胞中小液泡和質體仍然明顯可見，其他細胞器則不多(圖版Ⅱ，G)。與造孢細胞相比，小孢子母細胞的質體(P)表面鈣沉淀顆粒明顯增多，并伴隨著質體內淀粉粒的形成(圖版Ⅱ，H)。

圖版Ⅱ 金線蓮早期花藥中的鈣離子分布特征A.造孢細胞中的質體(P)表面分布有較多的鈣沉淀顆粒；B.造孢細胞核(n)中有較多的鈣沉淀顆粒，但染色質(C)中鈣沉淀顆粒較少；C.小孢子母細胞(MMC)時期，染色質靠核膜分布；D.示小孢子母細胞的細胞質中較少鈣沉淀顆粒；E.分裂前的小孢子母細胞核(n)中，鈣沉淀顆粒達到最多；F.分裂中的小孢子，二組染色體(c)之間分布大量的鈣沉淀顆粒；G.小孢子母細胞中的液泡(V)表面和細胞壁(W)分布一些鈣沉淀顆粒；H.小孢子母細胞中，一些質體(P)表面出現鈣沉淀顆粒并形成淀粉粒Plate Ⅱ Characteristics of calcium distribution in the early anthers of Anoectochilus roxburghiiFig.A. Calcium precipitates distribution on the surface of the plastid (P) in sporogenous cells (SC); Fig.B. There are more calcium precipitates in the nucleus (n) of sporogenous cell, but less in chromatin (C); Fig.C. At the microspore mother cell (MMC) stage, chromatin is distributed along the nuclear membrane; Fig.D. A fewer calcium precipitates distribution in the cytoplasm of microspore mother cells; Fig.E. The maximum calcium precipitates were accumulated in the nucleus (n) of microspore mother cell before meiosis; Fig.F. When the microspore mother cell divided, a large number of calcium precipitates appeared between the two sets of chromosomes (C); Fig.G. Some calcium precipitates distributed on the vacuole (V) surface and the cell wall (W) of microspore mother cells; Fig.H. Calcium precipitates appeared on the surface of plastids (P) and formed starch granules in the microspore mother cells

2.4 小孢子時期鈣的分布特征

金線蓮小孢子母細胞減數分裂后形成的小孢子仍然聚集在一起，以花粉塊的方式發育。由于花粉塊由數十個甚至上百個花粉組成，位于花粉塊不同部位的花粉發育特性不同，最顯著的特征是位于花粉塊表面花粉和內部花粉的胼胝質壁和花粉外壁發育的差異性。金線蓮花粉母細胞時期在整個花粉塊表面形成了一層厚厚的含多糖的胼胝質壁，但在花粉塊內部的花粉母細胞表面則沒有胼胝質壁的形成。減數分裂后，在早期花粉塊表面仍可看到厚厚的胼胝質壁，但在小孢子徑向面和內切向面，則沒有胼胝質壁結構。在花粉塊內部的小孢子表面上也沒有胼胝質壁。雖然在小孢子徑向壁部位胼胝質壁分叉，但沒有繼續長入(箭頭)(圖版Ⅲ，A)。顯微放大后清晰顯示在小孢子和胼胝質壁之間已開始形成花粉外壁結構(箭頭)。這一結構特征也是確定小孢子的依據。在花粉外壁和胼胝質壁之間，有1層片狀網格結構，可能是胼胝質壁開始降解的產物。在胼胝質壁表面，有少量體積較大的鈣沉淀顆粒，在胼胝質壁(CW)中，鈣沉淀顆粒較小，數量較多。在花粉外壁部位，也有一些鈣沉淀顆粒，但在小孢子細胞質中，鈣沉淀顆粒很少(圖版Ⅲ，B)。在花粉塊內部，小孢子細胞壁中有較多的鈣沉淀顆粒，而在細胞質中的鈣沉淀顆粒依然很少(圖版Ⅲ，C)。隨著小孢子的發育，在小孢子細胞壁中鈣沉淀顆粒明顯增加，小孢子細胞質中鈣沉淀顆粒也增加(圖版Ⅲ，D)。從小孢子時期的鈣沉淀顆粒分布動態來看，鈣離子呈現移入小孢子中的趨勢。

2.5 二胞花粉時期鈣的分布特征

金線蓮花粉為二胞型，成熟花粉中含1個生殖細胞和1個營養細胞。小孢子分裂后，二胞花粉開始積累淀粉和脂滴的營養物質[8]。本實驗中，可看到成熟花粉的外形不規則，在花粉中積累了許多淀粉粒。在花粉塊表層上已形成了完整的花粉外壁，與其他植物的孢粉素花粉外壁相似，但花粉塊內部的花粉則沒有花粉外壁結構，或者花粉外壁不完整(圖版Ⅲ，E)。在成熟花粉塊表面的花粉外壁上(Ex)分布了1層鈣沉淀物(箭頭所示)，在外壁的空隙中也積累了一些鈣沉淀顆粒。花粉中有大量淀粉粒(S)(圖版Ⅲ，F)。在成熟花粉的細胞質中鈣沉淀顆粒主要分布在淀粉粒附近(圖版Ⅲ，G)，或被聚集在小泡中(箭頭所示)(圖版Ⅲ，H)。金線蓮成熟花粉中呈現較豐富的鈣離子。

圖版Ⅲ 金線蓮晚期花藥中的鈣離子分布特征A.減數分裂后的小孢子(M)，示花粉塊表面的胼胝質壁(CW)，箭頭示花粉徑向壁部位；B.小孢子(M)合成花粉外壁(箭頭)，在胼胝質壁(CW)中分布一些鈣沉淀顆粒；C.花粉塊內小孢子(M)之間的壁中出現一些鈣沉淀顆粒；D.隨著花粉塊的發育，小孢子(M)之間的壁中鈣沉淀顆粒明顯增加；E.開花時，花粉塊中的成熟花粉積累了大量的淀粉粒；在花粉塊的表面有一層花粉外壁，但塊內花粉之間無花粉外壁；F.在花粉外壁(Ex)表面附有一層鈣沉淀顆粒(箭頭)，花粉中有大量淀粉粒(s)；G.成熟花粉，鈣沉淀顆粒分布在淀粉粒(S)附近；H.成熟花粉，鈣沉淀顆粒聚集在細胞質小泡中(箭頭)Plate Ⅲ Characteristics of calcium distribution in the late anthers of Anoectochilus roxburghiiFig.A. Shows the callose wall (CW) on the surface of pollinia and the arrows show the radial wall of pollen in the microspore (M) after meiosis; Fig.B. Microspores (M) synthesize the outer wall of pollen (arrow) and distribute some calcium precipitates in the callose wall (CW); Fig.C. Some calcium precipitates appear in the wall between microspores (M) inside pollinia; Fig.D. With the development of pollinia, calcium precipitates increased significantly in the walls between microspores (M); Fig.E. At flowering, the mature pollen in pollinia accumulated a large number of starch grains. There is a layer of pollen outer wall on the surface of pollinia, but there is no pollen outer wall between the pollens within pollinia; Fig.F. There is a layer of calcium precipitates (arrow) on the outer wall (Ex) of the pollen and there are a large number of starch grains (S) in the pollen; Fig.G. There are many calcium precipitates near starch granules of mature pollen; Fig.H. Calcium precipitates gather in cytoplasmic vesicles (arrow) of mature pollen

3 討 論

我們已在前期報道了金線蓮花藥發育的特殊性，即金線蓮花藥以花粉塊的形式發育[8]，在造孢細胞時期確定了花粉塊的輪廓；在造孢細胞向小孢子母細胞轉變過程中，花粉塊內細胞之間發生細胞器和細胞核的穿壁現象，且在花粉塊表面形成了胼胝質壁,但在花粉塊內部的小孢子母細胞之間沒有胼胝質壁。減數分裂后，以花粉塊為單位在其表面形成孢粉素花粉外壁，但在花粉塊內部的花粉沒有花粉外壁結構[8]。這些金線蓮花粉發育的特異性顯示與其他游離花粉發育有很大差異。本研究進一步探索其花藥發育過程中的鈣離子分布特征，進而討論鈣離子在金線蓮花粉發育中的生理功能。

花藥是植物的雄性器官，其發育的調控機制還不清楚。在小麥[10]中，可育花藥在特定時期和特定部位聚集了較多的鈣離子，而在不育花藥中鈣離子的分布呈現異常，表明花粉發育與鈣離子有特定的關系。在萵苣[11]和油茶[12]花粉發育的鈣離子分布研究中，表明鈣離子含量最高的時期是小孢子時期，尤其在液泡中，顯示鈣離子與液泡的代謝有關。對羊蹄甲[13]花粉發育的深入研究證實，小孢子細胞質中線粒體積累鈣離子后，其內膜(嵴)分解，轉變為小液泡，這些小液泡膨大最終融合形成一個大液泡，占據小孢子絕大部分空間并將細胞核擠到邊緣，形成單核靠邊小孢子。這些研究結果表明鈣離子在植物花粉發育的某些環節中具有重要的生理功能。

其他植物花藥發育中鈣離子的分布特征可見報道[10-13]，但蘭科植物花粉發育中鈣離子的分布特征和生理功能研究尚未見報道。本研究發現金線蓮花藥以花粉塊形式發育，其鈣離子呈現特異性的分布特征：造孢細胞時期，在花藥表皮細胞和藥室內壁細胞的液泡中分布較多的鈣沉淀顆粒，顯示鈣離子與植物細胞中的液泡發生和形成有關；在減數分裂前期，小孢子母細胞核中聚集了較多的鈣沉淀顆粒，當小孢子母細胞分裂時，大量的鈣沉淀顆粒分布在二組染色體之間，顯示鈣離子與細胞分裂有關；同時，在合成淀粉的質體表面覆蓋了較多的鈣沉淀顆粒，顯示鈣離子與花粉細胞中的質體糖代謝功能有關；開花時，花粉塊表面的花粉外壁上附有1層鈣沉淀顆粒，成熟花粉細胞質中仍有大量的鈣沉淀顆粒被聚集到小泡中，提示成熟花粉中的鈣沉淀顆粒作為儲備鈣離子，為以后花粉萌發時提供鈣離子。金線蓮花粉發育中鈣離子的特異時空分布暗示其參與花粉發育的代謝活動。