基于代謝組學技術的植物抗病相關代謝物研究進展

趙 利，鈔建賓，郭 捷，田海嬌，高 芬

(1 山西大學 中醫藥現代研究中心，太原 030006; 2 山西大學 大型科學儀器中心，太原 030006; 3 山西省科技資源與大型儀器開放共享中心，太原 030006; 4 山西大學 應用化學研究所，太原 030006)

植物代謝物種類繁多，總數在20～100萬種之間[1], 主要分為初級代謝物和次級代謝物兩大類。植物代謝物是植物生理狀態在代謝水平上的反映，從整體上研究植物代謝物的變化與調控可為解析植物生長發育及其與環境因子的互作奠定基礎[2]。真菌是植物最重要的外界脅迫因子之一，由其侵染引起的病害占植物病害的70%～80%。植物受到病原真菌侵染時，可以通過調節體內的代謝反應產生一系列代謝物來增強自身對病原真菌的抗性[2]。

代謝組學技術是繼基因組學、轉錄組學、蛋白質組學后的又一新興學科，根據研究目的不同，可分為靶向代謝組學和非靶向代謝組學。目前，代謝組學技術已逐漸成為植物病理學，特別是植物-病原真菌互作研究的重要工具。通過代謝組學技術分析植物在病菌入侵后代謝物譜的變化與差異，可以尋找到一系列抗病相關(Resistance-related，RR)代謝物。這些RR代謝物不僅可為植物抗病機制研究和植物抗性鑒定提供幫助，而且綜合各種組學分析方法，能有效識別參與植物代謝過程的功能基因[3]，結合遺傳學方法，可對生產實踐中篩選抗性品種和抗病育種提供良好的輔助作用[4]。本文主要綜述了基于代謝組學技術研究植物RR代謝物的流程和近10年來發現的常見RR代謝物及其抗病機制，并討論了未來代謝組學技術在植物RR代謝物研究中面臨的挑戰。

1 植物抗病相關代謝物的分析與獲得

基于代謝組學技術分析植物RR代謝物，研究流程通常包括互作體系的建立、樣品前處理、代謝組學分析、數據處理、生物學意義闡釋等(圖1)。

圖1 病原菌與植物互作研究的代謝組學分析流程[5]Fig.1 Metabolomics analysis process for pathogen-plant interaction research[5]

1.1 互作體系的建立

植物-病原菌互作體系一般通過目標植物接種病原菌建立，如研究人員將禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)孢子懸液噴灑到小麥(TriticumaestivumL.)、大麥(HordeumvulgareL.)和水稻(OryzasativaL.)等禾本科植物上進行接種，建立互作體系[6-8]；而根腐病等土傳病害的互作體系則大多采用傷根浸泡法將病原菌接種到植物的根部建立，如本課題組采用此方法將腐皮鐮刀菌(F.solani)接種到黃芪(Astragalusmembranaceusvar.mongholicus)上建立互作體系[9]。然而，由于植物在不同的生長發育時期，其組織、器官、細胞類型中合成積累不同的代謝物，且互作體系建立時代謝物含量也極易受到樣品本身的均勻度、病原菌接種量、接種方法、生長環境等的影響，基于代謝組學技術的植物-病原菌互作研究面臨著實驗設計標準化的需求和挑戰。因此，在建立互作體系時應該控制基本一致的植物生長環境條件，并設置4～6次實驗重復，以消除環境和實驗操作的誤差[10]。

1.2 代謝物的分析與鑒定

樣品采集后應該立即進行代謝猝滅，以減小采樣后植物體內持續的代謝反應對實驗結果的影響，一般的處理方法為液氮冷凍處理。代謝淬滅后的樣品需馬上保存在-80 ℃的條件下直到提取，以確保生物體內代謝物的穩定性。常用的代謝組學技術主要包括氣相色譜(gas chromatography, GC)、液相色譜(liquid chromatography, LC)、質譜(mass spectrum, MS)、核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)等。NMR以無偏向性、無損傷性和直觀性等優點著稱[11]。Gao等[9]利用該技術在黃芪-腐皮鐮刀菌互作體系中檢測出24種代謝物。MS相比于NMR能夠檢測出更多的代謝物，并主要與GC、LC聯用。例如Mahatma等[12]利用氣相色譜-質譜聯用技術(gas chromatography-massspectrum, GC-MS)對花生(ArachishypogaeaLinn.)與鏈格孢葉枯病菌[Alternariaalternata(Fr.) Keissler]互作進行非靶向代謝組學研究，檢測出67種代謝物；Sara等[13]利用液相色譜-質譜聯用(liquid chromatography-mass spectrum, LC-MS)技術在菜豆(PhaseolusvulgarisLinn.)與立枯病菌(Rhizoctoniasolani)互作體系中檢測出了216種代謝物。

植物體內代謝物復雜多樣，數量龐大，單一代謝組學技術往往無法達到理想的分析效果，因此聯合使用多種技術分析植物-病原菌互作后代謝物譜的變化已越來越廣泛。例如Koutouan等[14]使用GC-MS和UHPLC-MS對胡蘿卜(Daucuscarotavar.sativaHoffm.)與鏈格孢葉枯病菌(A.dauci)的互作進行聯合分析，不僅通過GC-MS分析鑒定出30種萜類化合物，而且還通過UHPLC-MS分析鑒定出了芹菜素、木犀草素等黃酮類化合物。新興的聯用技術，高效液相色譜-二極管陣列檢測-固相萃取-質譜-核磁共振(HPLC-DAD-SPE-MS-NMR)聯用則能夠提供有效的低濃度未知代謝物的結構確定方法[11]。

通過上述技術測得的代謝物數據信息，通常并不能直接給出具體的化合物名稱，需將獲得的數據與代謝組學數據庫或相關文獻加以比對才能完成代謝物的鑒定。常用的代謝組學數據庫分為4類：譜圖數據庫(MassBank、METLIN、NIST等)、代謝途徑數據庫(KEGG、PlantCyc、MetaCye等)、化合物信息數據庫(PubChem、ChemSpider等)和代謝組學實驗信息管理型數據庫(SetupX、Sesame LIMS等)[15]。

1.3 差異代謝物的指認

不同抗性水平的同一植物在受到病原真菌侵染時，其體內代謝物也會存在顯著性的差異。使用SIMCA-P軟件對代謝組學數據進行多元統計分析，是目前篩選差異代謝物常用的方法之一。采用非監督的模式識別方法主成分分析(principal component analysis, PCA)來觀察樣本整體的分布趨勢和是否有離群點的發生，然后使用監督的模式識別方法偏最小二乘判別分析法(partial least squares-discrimination analysis, PLS-DA)對模型的有效性進行評判，最后進行正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least square-discriminate analysis, OPLS-DA)以最大化地凸顯模型內部不同組別間的差異，并通過分析相關系數對具有統計意義的代謝物進行歸納，可獲得差異代謝物[10]。例如，Zhu等[16]利用PCA分析大豆(Glycinemax)接種疫霉菌(Phytophthorasojae)和模擬接種2個處理間代謝物的分離趨勢，然后通過OPLS-DA結合單變量分析，以VIP> 1.0和P< 0.05作為代謝物積累差異的閾值，發現96種代謝物在接種病菌和模擬接種的大豆間存在顯著性差異。Li等[17]將不同抗性品種的竹子(Bambusoideae)與毛竹基腐病菌(Arthriniumphaeospermum)互作后的代謝組學數據用同樣的方法進行分析，發現處理組和對照組間具有105種差異代謝物；Gao等[9]采用同樣的方法分析，也指認出了黃芪接種腐皮鐮刀菌和模擬接種2個處理間的13種差異代謝物。

此外，也有研究者利用其他分析方法處理代謝組學數據，并以此篩選差異代謝物。例如，Kumaraswamy等[6]使用SAS軟件的CANDISC程序進行典型判別分析(canonical discriminant analysis, CDA)，最后基于散點圖尋找不同抗性基因型小麥接種禾谷鐮刀菌后產生的差異代謝物。Anjum等[18]使用DSAASTAT和ClustVis軟件，通過bpca算法執行PCA分析，最后將代謝組學數據總結為熱圖，發現有47種代謝物在番茄枯萎病菌(F.oxysporumf. sp.lycopersici)侵染番茄(Solanumlycopersicum)抗、感病品種后存在顯著性差異。

1.4 抗病相關代謝物的分析與獲得

差異代謝物雖然解釋了同種植物在應對病原真菌的侵染時為何具有不同的抗/感病性，但是植物體內的所有差異代謝物不一定都是RR代謝物。獲得植物RR代謝物，是明確植物抗病機制，進而輔助植物抗病育種的關鍵。

對于已有不同抗性品種的作物，研究者們往往通過比較抗、感病品種感染病原菌后，差異代謝物的含量變化來尋找RR代謝物。其含量變化比較主要在RM/SM、RP/RM、SP/SM和RP/SP 等4種處理組之間進行，其中的R為抗病品種，S為易感病品種，M為模擬(無菌水)接種，P為病原體接種。RR代謝物指相較于感病基因型，抗性基因型中豐度更高的代謝物。其中，以模擬接種為基礎的RR代謝物被認為是組成型RR代謝物RRC(RRC=RM>SM)；RR代謝物在抗性基因型接種病原真菌后豐度大于模擬接種，以及接種病原真菌后在抗性基因型中豐度大于易感病基因型的被認為是誘導型RR代謝產物RRI(RRI=RP>RM和RP>SP)[6, 19-20]。基于上述原則，Kumaraswamy等[6]鑒定出禾谷鐮刀菌與大麥互作系統中的128種RRC代謝物和33種RRI代謝物，Gunnaiah等[21]也鑒定出144個RRC代謝物和167個RRI代謝物。

對于暫無抗性品種的植物，研究者通過分析病原菌接種與模擬接種組之間的代謝物變化，將接種組內含量顯著高于或者低于對照組的代謝物與已有文獻報道的RR代謝物進行比對，來識別RR代謝物。陳佳華[22]通過對甘薯[Dioscoreaesculenta(Lour.) Burkill]接種腐皮鐮刀菌和模擬接種組間的18種差異代謝物進行相關性和代謝通路分析，并對照已報道的RR代謝物，發現綠原酸、蘋果酸、琥珀酸等可能作為RR代謝物存在。本課題組則在將代謝物含量變化和病害發病程度進行相關性分析的基礎上，結合文獻比對，指認出蘋果酸、苯丙氨酸、果糖、蔗糖為黃芪抗腐皮鐮刀菌侵染的潛在RR代謝物[9]。

除此以外，對于無抗性品種的植物還可以將代謝組與蛋白組、轉錄組等其他組學技術相結合來對其體內的RR代謝物進行指認分析。Chen等[23]綜合轉錄組學和代謝組學技術發現部分糖類、氨基酸類和類黃酮化合物在菜豆抵御腐皮鐮刀菌侵染中發揮作用。Carere等[24]對小麥和番茄中具有已知靶標的兩種病原體酶進行純化，然后利用其對植物提取物進行處理，對處理后的提取物進行LC-MS分析，通過比較處理前后代謝物的含量來尋找植物RR代謝物。

然而，植物體內代謝物的差異變化，也可能因環境等其他因素引起，因此指認出的RR代謝物還需加以驗證。鑒于此，體外抑菌、代謝物途徑分析、基因表達分析等技術已與上述指認方法相結合，應用于植物RR代謝物的研究中。例如，Kumar 等[20]對大麥抗禾谷鐮刀菌侵染的相關代謝物進行了體外抑菌試驗，發現茉莉酸甲酯、亞油酸、亞麻酸、油酸、咖啡酸和對香豆酸均可顯著抑制病原菌菌絲生長。Tugizimana等[25]對高粱(Sorghumbicolor(L.) Moench)與炭疽菌(Colletotrichumsublineolum)互作中72個具統計意義的代謝物進行代謝途徑分析，發現這些代謝物最主要的代謝途徑是苯丙酸和類黃酮生物合成途徑。這兩種代謝途徑的次生代謝物具有廣泛的生物學功能，包括發育、抵御非生物和生物脅迫、調節重要的生理和生化過程等[26]，并籍此說明部分代謝物可作為高粱抵御炭疽菌侵染的相關代謝物。將代謝組學和基因組學結合利用，還發現高粱中抗毒素相關基因(F3′H)的高表達與芹菜素苷和木犀草素的積累相關，證實二者是高粱中的RR代謝物[25]。

2 植物抗病相關代謝物及其作用機制

植物通過調節體內的代謝反應對病原菌進行防御，初級代謝產物在植物抗病反應中主要作為信號物質誘導植物產生抗性和作為次級代謝產物的前體存在，而次級代謝產物在植物防御過程中不僅作為信號物質誘導下游抗菌物質的生成，還可以直接參與對病原菌的抑制[27]。

2.1 常見植物抗病相關代謝物

目前基于代謝組學技術研究發現的抗病相關代謝物主要是初級代謝產生的糖、氨基酸、脂肪酸和次級代謝產生的苯丙酸、類黃酮等代謝物。筆者總結了近10年來基于代謝組學技術發現的部分常見植物RR代謝物(表1)。此外，兒茶素[6]、海藻糖[7]、香豆素[8, 12]、精氨酸[17, 29]、半乳糖[28]、阿魏酸[30]以及有機酸如蘋果酸[31]等在一些植物中也被指認為RR代謝物。

表1 部分常見植物RR代謝產物

2.2 抗病相關代謝物的作用機制

2.2.1 初級代謝產物植物體內的果糖、蔗糖等被認為是病原菌獲取能量的來源，能有助于病原真菌的生長[12]，但也有研究表明：植物可以通過與病原菌競爭其體內的蔗糖、果糖等使得病原菌獲得更少的能量來源，從而通過將“饑餓”作為病原體適應的主要障礙來增強植物抗病性[36]。另外，糖在植物體內不僅作為碳源和能量的主要來源，同時也參與植物的下游信號網絡，比如在植物防御過程中果糖和蔗糖被認為是信號物質，可以激活植物對不同病原體的免疫反應[33]。除此以外，小麥體內的水蘇糖和半乳糖可能通過增強細胞壁強度來抵御禾谷鐮刀菌入侵[37]；大豆(Glycinemax)體內積累的松三糖、赤蘚糖、海藻糖和異麥芽糖等可增強信號轉導和細胞壁的修飾，從而達到對疫霉菌侵染的防御[16]。

苯丙氨酸(Phe)在植物體內可以作為苯丙素、黃酮類化合物、細胞壁木質素等一系列RR代謝物的前體來起到抗病作用[38]；谷氨酸(Glu)也通過參與和植物抗逆性增強有關的多種代謝物的合成來增強植物抗病性[39]；脯氨酸(Pro)則通過強化植物細胞壁來抵御病原真菌入侵[29]；蘇氨酸(Thr)通過磷酸化和去磷酸化參與植物-病原體互作中的信號轉導，調控植物抗病反應[40]；精氨酸(Arg)在葡萄(VitisviniferaL.)體內通過參與多胺與酚類化合物的絡合來抵御灰葡萄球菌(B.cinereais)的侵染[28]。

亞麻酸和亞油酸在體外試驗中對立枯絲核菌、腐霉菌(Pythiumultimum)、禾谷鐮刀菌等幾種病原真菌具有抑制作用[41]，并且亞油酸等脂肪酸還通過沉積形成蠟層和脂質以減少病原菌在植物中的滲透和擴展[6]。例如，禾谷鐮刀菌侵染大麥時，其體內亞油酸和游離脂肪酸的沉積可以加強角質層從而形成一個物理屏障，增強大麥的抗病性[20]。

2.2.2 次級代謝產物水楊酸(salicylic acid, SA)是植物中重要的信號物質，Patil等[42]在龍爪稷(Gramineae)對稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)抗性的研究中發現，水楊酸誘導激活了系統獲得性抗性(systemic acquired resistance, SAR)通路，從而增加了苯丙酸途徑的代謝物，導致木質素在細胞壁上沉積，限制了病原體的侵入。茉莉酸(jasmonic acid, JA)作為信號分子，也可誘導植物產生抗性以應對脅迫，如水稻與紋枯病菌互作中，茉莉酸作為信號傳導物質促進了木質素的積累[7]。

肉桂酸、咖啡酸在植物防御中作為木質素形成的前體發揮作用。例如，小麥在應對禾谷鐮刀菌侵染時，其體內累積的肉桂酸酰胺(HCAAs)可通過細胞膜運輸并用于細胞壁的木質化[43]；咖啡酸、阿魏酸、香豆酸、水楊酸、單寧酸等在小麥體內對禾谷鐮刀菌中的碳酸酐酶和細胞色素P450s等主要蛋白具有較強的抑制活性，并且咖啡酸、阿魏酸、水楊酸的抑菌作用已在真菌生長抑制實驗中得到證實[44]。

柚皮素和槲皮素也被證明具有抗真菌活性，能夠顯著抑制病菌孢子萌發[26, 45]；棉花(Gossypiumspp.)中的兒茶素和槲皮素也能夠直接抑制棉花黃萎病菌(Verticilliumdahliae)的產孢、孢子萌發和菌絲生長[46]；芹菜素在植物體內作為抗毒素存在抵御入侵的炭疽菌[25]；鷹嘴豆(CicerarietinumLinn.)抗性植株中異黃酮和紫檀堿的結合物作為植物抗毒素的前體可增強對尖孢鐮刀菌的抗性[35]，而類黃酮苷則通過強化細胞壁來抵御病菌入侵[47]。

3 問題與展望

植物RR代謝物可作為抗性指標用于植物抗病品種的鑒定。例如，Kumaraswamy等[48]認為大麥抗赤霉病的RR代謝物可用于大麥抗赤霉病基因型的篩選；Heidari等[30]認為根據甜菜(BetavulgarisL.)抗病性與代謝物的相關性分析，可以輔助對抗褐斑病甜菜品種進行快速、經濟、有效的篩選。此外，將代謝組學與其他組學技術結合應用，可以分析獲得具有實際應用潛力的抗病基因，并已有多個相關報道。例如，通過代謝組學結合基因表達研究，Karre等[49]發現HvCERK1基因是大麥對禾谷鐮刀菌的抗性基因；Chen等[23]通過指認大豆抗腐皮鐮刀菌侵染的相關代謝物并結合轉錄組學分析，得到了Cluster-30876.30681，Cluster-30876.60313等候選抗性基因。上述研究結果均可對抗病育種提供良好的輔助作用。

盡管基于代謝組學的植物RR代謝物研究在植物抗性基因型鑒定、抗病基因篩選、輔助抗病育種等方面具有良好的前景，但目前研究范圍和指認出的抗病相關代謝物大多針對小麥、大麥等大田作物病害，對中藥材、水果、蔬菜等病害系統的關注較少。由于以根莖作為藥用部位的中藥材(如黃芪、三七、地黃等)多數生長周期較長，且土傳病害的致病菌復雜多樣[50]，使得其抗病育種耗時漫長且十分困難。因此，利用代謝組學技術對中藥材的植物RR代謝物進行研究，尋找抗病指標和相關抗病基因，可有效地縮短抗病育種時間，加快中藥材抗病育種的研究進程。

目前，基于代謝組學的植物RR代謝物研究還存在許多挑戰和制約因素。首先，如何通過消除生長環境、操作方式等外界因素對植物代謝組的影響，從而保證研究體系的均一性，以及體系建立后植物發病程度的準確評價，對保證研究結果的準確性至關重要。對此，一方面通過建立標準化的病菌接種流程和人為控制植物的生長環境，可以消除對植物代謝組產生影響的外來因素；另一方面，利用實時熒光定量PCR技術(RT-qPCR)，對植物體內病原菌的含量進行測定，可以更好地對植物發病程度進行評價。其次，盡管各類代謝組技術的飛速發展使得海量化合物的分析成為可能，但由于植物體內的代謝物極其復雜且相關數據庫還不夠完善，故由代謝組學研究提供的數據只能覆蓋植物代謝組的一部分。針對此問題，除通過不斷優化提取方法擴充可獲得的化合物的數量外，注重對已有代謝物數據庫進行補充和完善，將對植物代謝物的全面、準確鑒定大有助益。第三，對于已鑒定出的植物代謝物，由于其在植物體內的生物學意義極為復雜，目前主要采用體外試驗驗證其抗病作用，這一做法無法對其在植物體內的真正抗病機制進行全面了解。將基因組學、蛋白組學、轉錄組學等技術和代謝組學相結合，將基因的表達和代謝物的變化進行綜合分析，可構建更加全面的植物代謝物生物學信息網絡，進而深入了解RR代謝物在植物體內的抗病機制。第四，真菌衍生代謝物的存在是植物-病原菌互作的代謝組學研究面臨的又一難題，這使獲得的代謝物的解釋變得更加困難，而建立病原真菌綜合代謝物數據庫有望幫助克服這一障礙[5]。

總之，盡管代謝組學技術在植物抗病相關代謝物的研究中還存在著諸多挑戰，但是隨著研究方法和各種相關技術的不斷發展與完善，未來必將可以為植物抗性評價指標的篩選和抗病育種提供更加有力的輔助作用。

(本綜述由趙利負責文獻查找及撰寫；鈔建賓和郭捷參與了文獻查找，并提供了撰寫建議；田海嬌負責文章格式修正及校對；高芬指導綜述撰寫并負責論文定稿。)