Luminal型乳腺癌胞膜蛋白相關(guān)預后模型的構(gòu)建與驗證

朱釗雯，賈衛(wèi)娟，劉潔瓊

胞膜蛋白（plasma membrane proteins，PMPs）癌細胞增殖、轉(zhuǎn)移和免疫逃逸等過程有關(guān)，隨著這些基因表達水平的改變，細胞無限增殖、粘附細胞外基質(zhì)、侵入血管或淋巴管、于靶器官定植的能力也發(fā)生了相應(yīng)的變化［1-3］。乳腺癌現(xiàn)已成為危害女性健康最常見的癌癥［4］，而luminal型乳腺癌占所有乳腺癌的70%以上［5］。

由于PMPs在腫瘤發(fā)生發(fā)展中經(jīng)過受體配體結(jié)合發(fā)揮相應(yīng)的生物效應(yīng)，成為許多抗癌藥物研發(fā)的目標靶點［6］，如多種細胞表面受體和離子通道［7-9］。然而，近來除了CDK4/6抑制劑外，應(yīng)用于Luminal型乳腺癌的新型PMPs相關(guān)治療靶向有限［10］。同時，鑒于PMPs表達于細胞膜上，便于臨床上的定性定量檢測，更能快速有效地獲取每一位患者的相應(yīng)腫瘤表達特點，進而運用于臨床工作。本研究旨在獲得一種有效的Luminal型乳腺癌PMPs相關(guān)預后預測模型，同時盡可能為Luminal型乳腺癌患者篩選出潛在的PMPs相關(guān)治療靶點。

1 材料和方法

1.1 臨床樣本及數(shù)據(jù)采集

從TCGA數(shù)據(jù)庫中下載Luminal型乳腺癌轉(zhuǎn)錄組RNA測序數(shù)據(jù)和這些患者的臨床信息作為訓練集，包括769例Luminal型乳腺癌和111例正常組織樣本。排除標準包括：患者①無乳腺癌分子分型信息；②不具備完整的臨床數(shù)據(jù)：包括總生存期（overall survival，OS）、生存狀態(tài)、診斷年齡、腫瘤大小（T）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況（N）。另外，我們從GEO數(shù)據(jù)庫下載了兩個微陣列數(shù)據(jù)集GSE20685和GSE37751中的RNA測序數(shù)據(jù)及臨床信息作為外部驗證集。最終，246例Luminal型乳腺癌患者被納入驗證集。同時我們從人類蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫中獲得了相應(yīng)的PMPs基因列表。

1.2 訓練集差異表達基因分析

利用R軟件中Limma包將腫瘤組織與正常組織進行比較，得到所有差異表達基因（deferentially expressed genes，DEGs）和差異表達PMPs（DEPMPs）。篩選條件為logFC＞0.5，P＜0.05。

1.3 PMPs預后模型

首先，將DEPMPs的基因表達量與相應(yīng)患者的OS和生存狀態(tài)相結(jié)合，篩選出影響預后的DEPMPs，進一步運用多因素Cox回歸分析建立PMPs相關(guān)預后預測模型。將構(gòu)建模型中相關(guān)基因表達水平與各自的Cox回歸系數(shù)相乘，得到每個患者的風險評分（RiskScore）根據(jù)RiskScore中位數(shù)將訓練集中的患者劃分為高危組和低危組。兩組生存差異采用Kaplan-Meier生存分析及l(fā)og-rank檢驗，并計算ROC曲線下面積，驗證RiskScore的有效性和預測模型的準確性。

1.4 多基因預后模型驗證

利用驗證集中246例Luminal型乳腺癌患者的數(shù)據(jù)驗證上述模型的臨床有效性。計算風險評分，根據(jù)中位風險評分將患者分為高、低風險組，構(gòu)建K-M生存分析和ROC曲線驗證預后預測模型的有效性。

1.5 統(tǒng)計分析

使用R軟件通過Survival ROC包計算ROC曲線的AUC以檢驗預后模型的有效性。對于K-M曲線，通過log-rank和單因素Cox風險回歸分析得到95%置信區(qū)間的P值和風險比（HR）。所有的統(tǒng)計檢驗都是雙向的。P＜0.05被認為是具有統(tǒng)計學差異的。

2 結(jié)果

2.1 篩選差異表達基因DEGs

首先，從訓練集中得到所有的DEGs（圖1A），進一步發(fā)現(xiàn)Luminal型乳腺癌的DEPMPs基因中有59個上調(diào)基因和85個下調(diào)基因（圖1B）。

2.2 預后模型的建立

通過單因素Cox回歸分析，從DEPMPs中篩選出30個預后相關(guān)基因（圖2），進一步通過多變量Cox回歸分析，構(gòu)建出一個包含11個基因的預后預測模型，模型計算公式如下：［ADRA1B的基因表達量*（0.164496）］+［CD99L的基因表達量*（0.35221）］+［EZR的基因表達量*（0.33013）］+［IYD的基因表達量*（0.119785）］+［RGS9BP的基因表達量*（0.125277）］+［SLC16A2的基因表達量*（0.165859）］+［DUS1L的基因表達量*（-0.57798）］+［KIT的基因表達量*（-0.07974）］+［MS4A1的基因表達量*（-0.06685）］+［PI3的基因表達量*（-0.0783）］+［SUSD2的基因表達量*（-0.07928）］。由圖2可知，ADRA1B、CD99L2、EZR、IYD、RGS9BP及SLC16A2高表達和DUS1L、KIT、MS4A1、PI3及SUSD2的低表達均與患者預后不良有關(guān)。據(jù)此計算所有患者的風險評分，根據(jù)風險評分中位數(shù)將患者分為高危組和低危組（圖3A）。同時我們繪制得到了患者的生存狀態(tài)圖（圖3B）和11個預后基因的生存熱圖（圖3C）。單因素Cox回歸分析顯示，包括診斷年齡、分期、T、N在內(nèi)的臨床特征和風險評分都不同程度地影響患者的預后（圖4A）。多因素Cox風險回歸分析表明診斷年齡、分期和風險評分的P值具有統(tǒng)計學意義（圖4B）。為了預測患者的OS，我們得到了高危組和低危組之間的K-M生存曲線，發(fā)現(xiàn)高危組的總生存期明顯低于低危組（圖4C）。此外，風險評分的AUC為0.825，表明該模型可能具有較好的預后預測潛力（圖4D）。

圖1 DEGs基因（圖1A）與DEPMPs基因（圖1B）

圖2 預后相關(guān)DEPMPs基因紅色為HR＞1，綠色為HR＜1

2.3 多基因預后模型的驗證

利用驗證集的RNA測序數(shù)據(jù)對預后預測模型進行驗證，計算驗證集中所有患者的風險評分并將患者分為高危組和低危組。結(jié)果提示高危組患者預后較低危組差（圖5A），且風險評分ROC曲線下面積為0.861（圖5B），進一步證明該模型具有一定的臨床應(yīng)用價值。

3 討論

本研究中，我們建立并驗證了可行的Luminal型乳腺癌PMPs預后預測模型。通過分析Luminal型乳腺癌PMPs預后相關(guān)基因，我們構(gòu)建了一個包含高風險相關(guān)基因ADRA1B、CD99L2、EZR、IYD、RGS9BP和SLC16A2，以及低風險相關(guān)基因DUS1L、KIT、MS4A1、PI3和SUSD2的預后預測模型。

圖3 預后模型的特征患者風險評分（圖3A）、生存狀態(tài)圖（圖3B）和模型中預后基因的生存熱圖（圖3C）

據(jù)報道，ADRAIB（腎上腺素受體α1B）增加細胞增殖的同時減少細胞的凋亡，導致較長的腫瘤生存時間和腫瘤復發(fā)［11］。CD99L2可以幫助中性粒細胞突破內(nèi)皮基膜并遷移到炎癥組織中［12］。EZR已被證實在多種癌癥的增殖、遷移和侵襲中發(fā)揮重要作用［13，14］。Ezrin由EZR編碼，交聯(lián)胞膜和構(gòu)建細胞骨架，Ezrin的磷酸化依賴于TGF-β和MAPK通路的激活，參與癌癥的生長和轉(zhuǎn)移，導致疾病進展和低生存率［15，16］。有研究報道IYD能夠抑制肝癌細胞糖酵解，進而通過增加有氧糖酵解支持癌細胞的存活和增殖，并導致癌癥患者預后較差［17］。RGS9BP在趨化因子誘導的淋巴細胞遷移中發(fā)揮作用，負調(diào)控naive和調(diào)節(jié)T細胞遷移的能力，從而影響T淋巴細胞的免疫應(yīng)答［18］。作為SLC16基因家族中與生存相關(guān)的代謝基因，編碼MCT8的SLC16A2的表達減少與部分頭頸部癌癥患者生存的改善相關(guān)［19］。

在乳腺癌中，KIT編碼的CD117+造血祖細胞，可在腫瘤發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移之前，便被富集至肺部誘導細胞外基質(zhì)重構(gòu)，進而為腫瘤的肺部轉(zhuǎn)移與定植提供條件［20］。而在血液系統(tǒng)疾病中，抗人CD117嵌合抗原受體T細胞可有效治療骨髓增生異常綜合征與急性髓系白血病，這也為乳腺癌肺轉(zhuǎn)移患者的靶向治療提供了啟示［21］。SUSD2編碼含822個氨基酸的蛋白，與半凝集素-1相互作用，促進乳腺癌細胞的免疫逃逸與轉(zhuǎn)移、腫瘤血管新生，并顯著減少CD4腫瘤浸潤淋巴細胞，這表明SUSD2可能是乳腺癌甚至其他癌癥的新靶點［22，23］。

圖4 模型的預后價值單因素Cox回歸分析（圖4A）；多因素Cox回歸分析（圖4B）；高低風險組患者生存曲線（圖4C）和ROC曲線（圖4D）

圖5 預后模型效能的驗證：高低風險組患者生存曲線（圖5A）和ROC曲線（圖5B）

無論在訓練集還是驗證集中，高危患者的預后都明顯較差。進一步采用多因素Cox回歸分析，風險評分的AUC均大于0.8。在類似的研究中，腫瘤突變負荷、自噬、不同表達的mRNA或免疫相關(guān)預后信號的AUC分別為0705、0.742、0.785、0.83［24，25］。因此，我們的基于11個基因的預后預測模型可能有更好的臨床應(yīng)用潛力，而其中一些基因甚至可能成為有效的治療靶點。基于11個預后模型相關(guān)基因，我們認為可以為深入的實驗研究提供一些新的研究思路。

同時，本研究也存在一些局限性。首先，我們還需要更多的功能性實驗來探索和驗證我們的PMPs預后預測模型的有效性，以及它們是否有可能成為精準治療的治療靶點。其次，基于研究現(xiàn)狀，我們暫且僅能關(guān)注于已被發(fā)現(xiàn)及驗證的在PM上表達的蛋白質(zhì)，而不是所有的PMPs。