利多卡因抑制ERK信號通路激活降低甲狀腺癌細(xì)胞TPC-1的增殖能力

吳毅，劉付寧，嚴(yán)穎哲，楊浩杰，謝乾

研究及臨床實踐表明，局部麻醉和局麻藥可能提高腫瘤患者的預(yù)后［1-5］。利多卡因由于其起效快、毒性作用小而廣泛應(yīng)用于體表手術(shù)［6］。多項研究發(fā)現(xiàn)，利多卡因可影響TRPM7（transient receptor potential melastatin-subfamily member 7）的功能，TRPM7可能是利多卡因在某些類型腫瘤中的靶點，例如，膠質(zhì)瘤、乳腺癌等［7，8］。另有文獻(xiàn)報道，利多卡因和羅哌卡因可抑制TNF-α（TumourNecrosis Factor-alpha）激活的SRC信號通路降低肺癌轉(zhuǎn)移能力［9］。也有研究證實，利多卡因可通過EGFR（epidermal growth factor receptor）信號通路抑制結(jié)腸癌的增殖，促進(jìn)其凋亡［10］。還有研究表明，利多卡因可能通過抑制NF-κB通路進(jìn)而抑制細(xì)胞粘附因子表達(dá)并抑制肝癌細(xì)胞粘附于血管內(nèi)皮細(xì)胞［11］。

生理情況下，細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶ERK（extracellular regulated MAP kinase）信號通路在發(fā)育和免疫中發(fā)揮重要作用［12，13］。而在腫瘤進(jìn)程中，它通常處于被激活和上調(diào)狀態(tài)，可以促進(jìn)腫瘤的增殖、分化、運動等［14］，所以ERK是許多藥物抑制腫瘤的重要靶點［15，16］。多項研究證實，甲狀腺癌的增殖轉(zhuǎn)移能力與ERK信號通路激活有關(guān)［17，18］。然而，利多卡因?qū)谞钕倌[瘤細(xì)胞的影響及其機(jī)制仍不清楚。本項研究中，我們通過體內(nèi)外實驗檢測了利多卡因?qū)谞钕侔┘?xì)胞增殖能力的影響。此外，我們探究了利多卡因影響腫瘤增殖的潛在機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 TPC-1細(xì)胞購自中科院細(xì)胞庫（上海，中國）。

1.1.2 試劑 RPMI1640培養(yǎng)基購自Invitrogen公司；胎牛血清購自GIBCO；鏈霉素和青霉素購自Sigma；細(xì)胞裂解液購自碧云天；磷酸酶蛋白酶抑制劑、Erk1/2、p-Erk1/2、GAPDH一抗，二抗購自Cell Signaling Technology；周期試劑盒購自凱基生物；CCK8購自日本同仁；利多卡因購自鄭州卓峰制藥有限公司；

1.1.3 儀器設(shè)備 Western Blot機(jī)器購自Bio-rad；酶標(biāo)儀購自Thermo Fisher Scientific；0.45μm PVDF膜購自Merck。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) RPMI1640培養(yǎng)基加入10%胎牛血清，100 U/mL青霉素及100μg/mL鏈霉素，混勻，4℃冰箱存儲備用。TPC-1細(xì)胞在含有5%CO2，37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 CCK8 將對數(shù)生長期的TPC-1細(xì)胞用胰蛋白酶消化種在96空板，約5000個細(xì)胞，6 h后加入含有PBS、10μM、100μM利多卡因的培養(yǎng)基200 mL，分別在處理24 h、48 h、72 h后使用CCK8試劑檢測TPC-1增殖情況，詳細(xì)步驟見試劑盒說明書。本項研究所使用的利多卡因的濃度參考既往發(fā)表的文獻(xiàn)［8，10］。

1.2.3 周期實驗 將對數(shù)生長期的TPC-1細(xì)胞用胰蛋白酶消化種在6空板，約1.5×105，6 h后換成不含血清的培養(yǎng)基，24 h后細(xì)胞密度約為50%～60%，分別加入含有PBS、10μM、100μM利多卡因的培養(yǎng)基200 mL。孵育48 h，消化細(xì)胞，離心，將細(xì)胞在4℃的75%酒精中混勻，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.4 Western Blot 使用含蛋白酶磷酸酶抑制劑的細(xì)胞裂解液在冰上孵育細(xì)胞30 min，刮取細(xì)胞，收集在1.5 mL EP管中，4℃下12 000 g離心30 min；吸取上清液，檢測蛋白濃度，加入loading buffer和H2O，配成每管15μg蛋白樣品；分別取蛋白進(jìn)行電轉(zhuǎn)膜，一抗（1∶1000）孵育12 h，TBST液中漂洗3次，10 min/次；孵育二抗，2 h，漂洗條件同上；條帶上加曝光液在曝光機(jī)曝光。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 使用SPSSstatistic19分析實驗數(shù)據(jù)，CCK8、細(xì)胞周期實驗、Western Blot實驗至少重復(fù)三次，數(shù)據(jù)用均數(shù)±均數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。P＜0.05則認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異。*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。

1.2.6 皮下成瘤實驗動物實驗 得到了中山大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)；BALB/C裸鼠購自中山大學(xué)東校區(qū)動物實驗中心，4～6周雄鼠，隨機(jī)分為兩組（n=6），用來檢測利多卡因?qū)PC-1增殖的影響。6×106個細(xì)胞重懸在150μL的PBS中，皮膚消毒后使用1 mL的胰島素針注射在裸鼠的背部，種植7天后腫瘤塊的直徑約2 mm。成瘤的第5天，兩組裸鼠分別以100μL/10 g的量在腫瘤周圍注射PBS和利多卡因（濃度10 mg/mL），隔天注射1次，總計注射5次，注射的當(dāng)天使用游標(biāo)卡尺檢測腫瘤塊的長徑和橫徑，每3天量一次，總計10次［19］。

2 結(jié)果

2.1 利多卡因抑制TPC-1細(xì)胞的增殖

為研究利多卡因?qū)谞钕侔┘?xì)胞增殖的影響，本研究采用PBS和10μM、100μM利多卡因處理TPC-1細(xì)胞24 h、48 h、72 h。CCK8結(jié)果顯示，10μM、100μM利多卡因均可抑制TPC-1細(xì)胞的增殖能力，且100μM利多卡因抑制作用強(qiáng)于10μM的利多卡因（圖1-A）。流式細(xì)胞學(xué)結(jié)果顯示10μM、100μM利多卡因處理TPC-1細(xì)胞48 h后，S期細(xì)胞比值降低，G0/G1期細(xì)胞比值增加（圖1-B）。Western Blot結(jié)果顯示，10μM、100μM利多卡因處理TPC-1細(xì)胞48 h后P21、P27蛋白表達(dá)量升高，ERK蛋白表達(dá)量下調(diào)，100μM利多卡因處理組p-ERK蛋白表達(dá)下調(diào)較顯著（圖1-C）。

圖1 利多卡因抑制甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞增殖 A：CCK8實驗檢測不同濃度的利多卡因?qū)PC-1細(xì)胞增殖的影響；B：流式細(xì)胞學(xué)實驗檢測不同濃度利多卡因?qū)PC-1細(xì)胞周期的影響；C：Western blot實驗檢測不同濃度利多卡因?qū)χ芷谙嚓P(guān)蛋白及ERK信號通路的影響。Student t test，one-way ANOVA，*P＜0.05，**P＜0.001；每組實驗至少重復(fù)3次

2.2 利多卡因抑制TPC-1細(xì)胞移植瘤增殖

為了進(jìn)一步探討利多卡因在動物體內(nèi)對TPC-1細(xì)胞增殖的影響，我們使用BALB/C裸鼠建立甲狀腺癌移植瘤模型（圖2-A）。我們將利多卡因注射在腫瘤周圍，實驗結(jié)束后麻醉處死裸鼠取出腫瘤塊拍照（圖2-B），實驗期間記錄腫瘤塊的大小變化（圖2-C）。實驗結(jié)果表明，利多卡因可抑制TPC-1細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)生長。

圖2 利多卡因抑制BALB/C裸鼠移植瘤生長 A：第37天處死裸鼠取出背部腫瘤；B：PBS和利多卡因注射腫瘤周圍后瘤體體積變化曲線。n=6，Student t test，one-way ANOVA，*P＜0.05

3 討論

局部麻醉藥利多卡因浸潤復(fù)合術(shù)中鎮(zhèn)靜是甲狀腺癌手術(shù)的麻醉方式之一，因其可減少對患者呼吸循環(huán)系統(tǒng)的抑制、降低患者費用，縮短住院時間而受到推崇［19-21］。既往研究報道利多卡因等其他局麻藥可以抑制乳腺癌等惡性腫瘤細(xì)胞的進(jìn)程［22，23］。但是，目前關(guān)于利多卡因?qū)谞钕倌[瘤細(xì)胞的影響鮮有報道。因此，研究利多卡因?qū)谞钕倌[瘤的影響及其機(jī)制可對麻醉醫(yī)師做出最佳選擇提供理論依據(jù)。

為了探究利多卡因?qū)谞钕侔┘?xì)胞的影響，本研究檢測利多卡因?qū)谞钕侔┘?xì)胞TPC-1增殖的影響，又對其可能機(jī)制進(jìn)行初步探究。本研究在10μM、100μM利多卡因處理甲狀腺癌細(xì)胞TPC-1后，利用CCK8實驗檢測利多卡因?qū)PC-1細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果顯示利多卡因在兩種濃度下均可抑制TPC-1細(xì)胞增殖，且100μM利多卡因抑制作用強(qiáng)于10μM。之后，利用流式細(xì)胞學(xué)檢測處理后細(xì)胞周期，結(jié)果顯示利多卡因兩種濃度處理后均有S期細(xì)胞比值降低，G0/G1期細(xì)胞比值增加。為了探究利多卡因抑制TPC-1細(xì)胞增殖的機(jī)制，我們對利多卡因處理后TPC-1細(xì)胞表達(dá)的蛋白進(jìn)行Western Blot實驗，結(jié)果顯示利多卡因兩種濃度處理后均有p21、p27蛋白表達(dá)量升高，ERK及其磷酸化水平降低，表明利多卡因抑制TPC-1細(xì)胞增殖的機(jī)制可能與ERK信號通路相關(guān)。裸鼠皮下成瘤實驗檢測利多卡因?qū)ζは乱浦睺PC-1細(xì)胞的影響，結(jié)果顯示利多卡因可抑制腫瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)生長。

綜上所述，利多卡因處理甲狀腺癌細(xì)胞可抑制其增殖能力，這可能與抑制ERK信號通路有關(guān)。