circZBTB44通過調(diào)控AKT通路促進腎透明細胞癌增殖和遷移的研究

鐘啟宇，謝文練

腎細胞癌（renal cell carcinoma，RCC），簡稱腎 癌，是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，其全球發(fā)病病例數(shù)約占成人惡性腫瘤新發(fā)病例數(shù)的4%，且發(fā)病率和死亡率均不斷上升［1］。在腎癌中，腎透明細胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）是最常見的病理類型，病例數(shù)約占腎癌病例的75%［2］。腎癌多為偶發(fā)，臨床癥狀不明顯，有高達17%的腎癌患者在初次就診時便已發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移［3］。腎癌對放、化療均不敏感，手術(shù)是目前治療局限性腎癌和局部進展性腎癌的主要方法［3，4］，但仍有近30%的腎癌患者在術(shù)后再次出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移［5］。因此，深入探究腎癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)關(guān)鍵分子，并挖掘相關(guān)作用機制，對臨床上腎癌的治療具有十分重要的科學(xué)意義。

環(huán)狀RNA（circular RNAs，circRNAs）是一類廣泛存在于真核細胞中的內(nèi)源性共價閉合環(huán)狀的非編碼RNA。circRNAs表達豐富，廣泛存在于細胞、組織、體液中，其半衰期長、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、耐RNA酶，是較為理想的生物標志物［6，7］。研究發(fā)現(xiàn)，circRNAs在多種人類腫瘤中異常表達，環(huán)上富含miRNA結(jié)合位點、蛋白結(jié)合位點、開放閱讀框等，可通過作為miRNAs吸附海綿、結(jié)合RNA相關(guān)蛋白、編碼相關(guān)蛋白等方式，調(diào)控基因表達，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起著重要調(diào)控作用［8］。

目前雖已有部分研究發(fā)現(xiàn)circRNAs在ccRCC中異常表達，并在ccRCC的增殖、遷移和侵襲中發(fā)揮著一定作用［6-9］。但circRNAs在ccRCC中的研究仍較少，有待進一步探索。本研究對GEO數(shù)據(jù)庫circRNA芯片數(shù)據(jù)表達譜進行差異分析，篩選出在ccRCC組織中高表達的circRNA circZBTB44，進一步探究circZBTB44在ccRCC中的表達情況，鑒定相關(guān)特征，探究其生物學(xué)功能，探索可能的分子機制，希望能為ccRCC的診斷和治療提供新的生物標志物和治療靶點。

1 材料與方法

1.1 腎透明細胞癌組織標本

31對腎透明細胞癌組織和配對癌旁組織標本均取自2018年至2020年于中山大學(xué)孫逸仙紀念醫(yī)院接受手術(shù)的腎透明細胞癌患者，患者術(shù)前均未行化療或放療?；颊呓M織的收集與使用均已從每個患者處獲得其書面知情同意。所有新鮮的組織收集后，立即使用液氮速凍，后續(xù)保存在-80°C冰箱。腎透明細胞癌和癌旁組織均經(jīng)兩名病理科醫(yī)師確認。本研究已得到中山大學(xué)孫逸仙紀念醫(yī)院倫理委員會的審批。

1.2 腎透明細胞癌細胞系的培養(yǎng)

人腎透明細胞癌細胞株786-O、ACHN和正常腎小管上皮細胞細胞株HK-2均購買于美國ATCC細胞庫。其中，786-O和ACHN細胞使用PRMI 1640培養(yǎng)基（Gibco）培養(yǎng)，HK-2細胞使用DMEM/F-12K培養(yǎng)基（Gibco）培養(yǎng)。所有細胞均使用完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清（Gibco）和1%青霉素/鏈霉素（Hyclone）培養(yǎng)于5%CO2的濕潤的37℃細胞培養(yǎng)箱，取處于對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染

取處于對數(shù)生長期的細胞以1.1×105細胞每孔的密度接種于六孔板中，培養(yǎng)過夜。次日按照說明書的步驟使用Lipofectamine RNAiMax（Invitrogen）將陰性對照和circZBTB44的siRNAs轉(zhuǎn)染至細胞中。轉(zhuǎn)染48 h后可進行下一步功能實驗，同時可提取RNA進行qRT-PCR驗證轉(zhuǎn)染效率。

1.4 RNA的提取及實時熒光定量PCR（qRT-PCR）

按照說明書的步驟使用RNAiso Plus（Takara）提取標本組織或轉(zhuǎn)染后細胞的總RNA，使用Evo M-MLV RT Premix for qPCR（艾科瑞生物）將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再使用SYBR?Green Premix Pro Taq HSqPCR Kit（艾科瑞生物）按說明書步驟在熒光定量PCR儀LightCycler96（Roche）上進行qRT-PCR反應(yīng)得到目的RNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA及內(nèi)參GAPDH的Cq值，通過2-ΔΔCq的方法計算相對表達量。本研究使用的引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列為：circZBTB44-F：TCCCAGCCTGTCAGTGCATC，circZBTB44-R：GGCTGTGGGAAGAGGAGCTAT；ZBTB44 mRNA-F：CGAGTGCAAAACATGTGGC，ZBTB44 mRNA-R：CACCTCTTGGAATTCATTCTCCG；GAPDH-F：GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT，GAPDH-R：GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG。

1.5 放線菌素D實驗

取處于對數(shù)期生長的細胞接種于六孔板中，每孔7×104個細胞，并置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入含2μg/mL放線菌素D的新鮮完全培養(yǎng)基，分別于處理后的4 h、8 h、12 h、24 h提取細胞RNA，并逆轉(zhuǎn)錄，行qRT-PCR法檢測放線菌素D處理后，circRNA和mRNA豐度的變化。

1.6 RNase R實驗

提取細胞總RNA，按照說明書步驟，將10 U RNase R（20 U/μL，廣州吉賽生物）加入到3μg總RNA中，對照組則將等量DEPC水加入到3μg總RNA中，于37℃孵育30 min后逆轉(zhuǎn)錄，并進行qRTPCR。

1.7 核漿分離實驗

采用PARISTM試劑盒（Invitrogen）按照說明書步驟，取1×107細胞，加入預(yù)冷的500μL Cell Fractionation Buffer冰上裂解，并4℃500×g離心5 min，上清即為胞漿裂解液，沉淀物為細胞核沉淀。細胞核沉淀中加入預(yù)冷的500μL Cell Disruption Buffer，用力吹打或渦旋振蕩使細胞核充分裂解。往胞漿裂解液和胞核裂解液中加入500μL常溫的2×Lysis/Binding Solution，充分混勻后分別過吸附柱提取RNA。

1.8 MTS細胞增殖實驗

取siRNA轉(zhuǎn)染48 h后的細胞以每孔1×103個細胞接種于96孔板后，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。在孵育0、24、48、72、96和120小時后，加入20μL MTS溶液（CellTiter 96?AQueous One Solution細胞增殖試劑盒，Promega），37℃溫箱孵育2 h，使用酶標儀測定490 nm的OD值。根據(jù)測得的OD值繪制MTS細胞增殖曲線。

1.9 克隆形成實驗

取siRNA轉(zhuǎn)染48 h后的細胞以每孔1×103個細胞接種于六孔板后，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)約2周，并觀察細胞存活狀態(tài)和克隆形成情況，每3～4天用換液一次，直到菌落清晰可見。使用PBS洗滌細胞后，使用4%多聚甲醛溶液室溫固定25 min，再使用0.1%結(jié)晶紫溶液室溫染色20 min，流水沖洗晾干后對六孔板進行拍照并計數(shù)。

1.10 Transwell細胞遷移實驗

取siRNA轉(zhuǎn)染48 h后的細胞，用無血清培養(yǎng)基重懸，配成200μL 8×104個細胞，加入到已提前使用無血清培養(yǎng)基潤膜的Transwell小室的上室中，下室加入新鮮的完全培養(yǎng)基600μL，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h（786-O）或3 h（ACHN）后，使用4%多聚甲醛溶液室溫固定30 min，再使用0.1%結(jié)晶紫溶液室溫染色25 min，拍照并計數(shù)穿過膜的細胞個數(shù)。

1.11 蛋白免疫印跡實驗

取siRNA轉(zhuǎn)染48 h后的細胞，使用RIPA蛋白裂解液（北京康為世紀）（含1%蛋白酶抑制劑（北京康為世紀）和1%磷酸酶抑制劑（Roche））裂解細胞獲得蛋白制品。使用BCA試劑盒（上海碧云天）測定蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液（Invitrogen）混勻后100℃煮沸5 min。使用恒壓80 V或120 V進行SDS-PAGE凝膠電泳，使用恒流250 mA轉(zhuǎn)膜，使用5%BSA封閉后，一抗4℃慢搖孵育過夜，二抗室溫慢搖孵育1 h后，使用ECL發(fā)光液在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中顯影，并保存圖片。

1.12 統(tǒng)計分析

所有實驗均重復(fù)三次，并使用軟件SPSS 20.0.0和GraphPad Prism 8.0進行統(tǒng)計分析和作圖。數(shù)據(jù)采用均值±SD表示。兩組定量資料之間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 circZBTB44在腎透明細胞癌組織和細胞株786-O和ACHN中明顯高表達

本研究通過對GEO數(shù)據(jù)庫GSE100186數(shù)據(jù)集（4對腎透明細胞癌和配對癌旁組織）的circRNA芯片數(shù)據(jù)表達譜進行差異分析，發(fā)現(xiàn)circZBTB44（hsa_circ_0002484）在腎透明細胞癌組織中明顯高表達。通過提取收集的本院31對腎透明細胞癌組織和配對癌旁組織標本及腎透明細胞癌細胞株786-O和ACHN的總RNA，進行qRT-PCR檢測circ-ZBTB44的表達水平，我們發(fā)現(xiàn)，相較癌旁組織，circZBTB44在腎透明細胞癌組織中的明顯高表達（圖1A）。相較永生化的正常腎小管上皮細胞株HK-2細胞，circZBTB44在腎透明細胞癌細胞株786-O和ACHN中明顯高表達（圖1B），與數(shù)據(jù)庫結(jié)果一致。

圖1 circZBTB44在腎透明細胞癌組織和細胞中明顯高表達 A：qRT-PCR法檢測31對腎透明細胞癌組織與癌旁組織中circZBTB44的表達水平；B：qRT-PCR法檢測正常腎小管上皮細胞系HK-2細胞和腎透明細胞癌細胞系786-O和ACHN中circZBTB44的表達水平；**P＜0.05，***P＜0.001

2.2 circ ZBTB44在腎透明細胞癌細胞中的鑒定和特征

通過查詢數(shù)據(jù)庫，了解到circZBTB44位于chr11：130130750-130131824，由ZBTB44基因的15、16、17、18號外顯子通過首尾相接共價閉合成環(huán)，circZBTB44全長1074 bp。

為了驗證circZBTB44的環(huán)狀RNA相關(guān)特征，我們用放線菌素D作用于腎透明細胞癌細胞株786-O和ACHN并設(shè)置了不同的作用時間，結(jié)果提示，circZBTB44的半衰期超過24 h，而線性ZBTB44 mRNA的半衰期約為12 h，表明circZBTB44的結(jié)構(gòu)比線性ZBTB44 mRNA穩(wěn)定（圖2A）。我們進一步從細胞系786-O和ACHN中提取總RNA并利用RNase R消化，然后進行qRT-PCR，結(jié)果提示circZBTB44的表達量基本不受RNase R影響，而ZBTB44 mRNA則顯著降低，提示circZBTB44在一定程度上能夠耐受核酸外切酶的作用（圖2B）。

為了進一步明確circZBTB44在786-O和ACHN中的定位，以U6（定位于細胞核）和18SrRNA（定位于細胞漿）為內(nèi)參，通過核漿分離實驗，我們發(fā)現(xiàn)circZBTB44在細胞漿的水平明顯高于細胞核水平（圖2C），提示circZBTB44主要定位于腎透明細胞癌細胞的胞漿內(nèi)。

圖2 circ ZBTB44在腎透明細胞癌細胞中的鑒定和特征A：qRT-PCR法檢測不同時間的放線菌素D作用下，786-O和ACHN的circZBTB44和ZBTB44 mRNA的表達水平；B：qRT-PCR法檢測RNaseR作用下，786-O和ACHN的circZBTB44和ZBTB44mRNA的表達水平；C，核漿分離實驗提示circZBTB44主要分布在細胞漿中；*、**P＜0.05，***P＜0.001

2.3 siRNAs能有效下調(diào)circZBTB44的表達水平

為了探究circZBTB44在腎透明細胞癌細胞中的生物學(xué)功能，我們設(shè)計合成了兩條circZBTB44特異性siRNAs（si#1和si#2）。利用siRNAs轉(zhuǎn)染技術(shù)，向腎透明細胞癌細胞株786-O和ACHN轉(zhuǎn)染si#1和si#2或陰性對照序列。通過qRT-PCR方法檢測轉(zhuǎn)染效率，發(fā)現(xiàn)與對照組（NC組）相比，si#1和si#2能有效下調(diào)circZBTB44的表達水平，而對ZBTB44 mRNA的表達無明顯影響（圖3）。

圖3 si#1和si#2能有效下調(diào)circZBTB44的表達水平qRTPCR法檢測轉(zhuǎn)染circZBTB44特異性siRNAs（si#1和si#2）后，786-O和ACHN的circZBTB44和ZBTB44mRNA的表達水平；***P＜0.001

2.4 下調(diào)circZBTB44抑制腎透明細胞癌細胞的增殖和遷移能力

通過MTS細胞增殖實驗，發(fā)現(xiàn)與NC組相比，通過si#1和si#2下調(diào)circZBTB44可明顯抑制腎透明細胞癌細胞株786-O和ACHN細胞增殖（圖4A）。通過克隆形成實驗，發(fā)現(xiàn)si#1和si#2組細胞形成克隆數(shù)目低于NC組（圖4B）。以上結(jié)果表明，下調(diào)circZBTB44明顯抑制腎透明細胞癌細胞的增殖能力。

進一步探究下調(diào)circZBTB44對腎透明細胞癌細胞遷移能力的影響，利用Transwell小室進行體外遷移實驗。結(jié)果表明，與NC組相比，si#1和si#2組細胞遷移能力明顯被抑制（圖4C）。綜上結(jié)果，circZBTB44在腎透明細胞癌中發(fā)揮著促癌作用，下調(diào)circZBTB44抑制腎透明細胞癌細胞的增殖和遷移能力。

2.5 circZBTB44可能通過調(diào)控AKT通路促進腎透明細胞癌細胞的增殖和遷移

上述結(jié)果證明circZBTB44在腎透明細胞癌中發(fā)揮著促癌作用。進一步探究circZBTB44可能的分子作用機制，通過對circZBTB44的親本（host）基因進行基因富集分析（GESA）。我們發(fā)現(xiàn)一些腫瘤相關(guān)的信號通路有富集，如P53通路、AKT通路、TGF-β通路（圖5A）。通過對這些通路的關(guān)鍵蛋白進行蛋白免疫印跡檢測，我們發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，通過si#1和si#2下調(diào)786-O和ACHN細胞circ-ZBTB44的表達后，p-AKT表達量明顯減少，而PI3K表達量及P53、TGF-β通路未見明顯變化（圖5B），提示circZBTB44可在一定程度上促進AKT的磷酸化。綜上結(jié)果，circZBTB44可能通過調(diào)控AKT通路促進腎透明細胞癌細胞的增殖和遷移。

圖4 下調(diào)circZBTB44抑制腎透明細胞癌細胞的增殖和遷移能力 A：MTS細胞增殖實驗檢測細胞轉(zhuǎn)染siRNAs后的增殖能力；B：克隆形成實驗檢測細胞轉(zhuǎn)染siRNAs后的克隆形成能力；C：Transwell小室檢測細胞轉(zhuǎn)染siRNAs后的遷移能力；**P＜0.005

3 討論

近年來，隨著高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展，越來越多的circRNAs被發(fā)現(xiàn)，逐漸成為科學(xué)探究的熱點。circRNAs表達豐富，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，是較為理想的生物標記物［10，11］。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，circRNAs在人類多種腫瘤組織中異常表達，并可通過作為miRNAs吸附海綿、結(jié)合RNA相關(guān)蛋白、編碼相關(guān)蛋白等方式，調(diào)控腫瘤細胞的基因表達，進而影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展［12］。如Has_circ_100395通過吸附miR-1228調(diào)控TCF21通路調(diào)控肺癌的進展［13］。circFoxo3直接結(jié)合p21、CDK2，共同形成三元復(fù)合物，進而調(diào)控細胞周期進程［14］。順式circCTNNB1通過調(diào)控DDX3介導(dǎo)的YY1轉(zhuǎn)錄激活，調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路，進而調(diào)控腫瘤的進展［15］等。目前circRNAs在腎透明細胞癌中的研究仍較少，其在腎透明細胞癌中的生物學(xué)功能和具體調(diào)控機制尚不明確，仍待進一步探索。PI3K/AKT信號通路是一條十分重要的信號通路，在細胞的生理、病理變化中都起著重要的作用。PI3K/AKT信號通路是腎透明細胞癌中最常見的反復(fù)突變的信號通路之一［16］，PI3K/AKT信號通路被各種因素異常激活或失活，引起下游通路的改變，進而影響腎透明細胞癌的增殖、遷移、侵襲、EMT等能力［17］。如PTPN3基因通過抑制腎透明細胞癌細胞的PI3K/AKT信號通路，抑制腎透明細胞癌的增殖和轉(zhuǎn)移［18］。?；视图っ缚赏ㄟ^激活PI3K/AKT/GSK3β信號通路促進腎透明細胞癌的生長和轉(zhuǎn)移［19］等。

圖5 circZBTB44可能通過調(diào)控AKT通路促進腎透明細胞癌細胞的增殖和遷移 A：基因富集分析（GESA）探究circZBTB44可能的分子作用機制；B：蛋白免疫印跡實驗檢測細胞轉(zhuǎn)染siRNAs后PI3K/AKT通路、P53通路、TGF-β通路的關(guān)鍵蛋白表達量的變化。

本研究通過分析GEO數(shù)據(jù)庫中腎透明細胞癌與癌旁組織circRNA芯片數(shù)據(jù)的差異表達，發(fā)現(xiàn)circZBTB44在腎透明細胞癌組織中明顯高表達，并在本院31對腎透明細胞癌組織及細胞系786-O和ACHN得到了驗證。通過放線菌素D實驗和RNase R實驗驗證了circZBTB44結(jié)構(gòu)較ZBTB44 mRNA穩(wěn)定的特征，并通過核漿分離實驗確定circZBTB44定位于胞漿。體外實驗中，通過下調(diào)circZBTB44的表達水平，發(fā)現(xiàn)786-O和ACHN細胞的增殖和遷移能力均被明顯抑制。進一步探究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)circZBTB44的表達可抑制AKT的磷酸化，提示circZBTB44可能通過促進AKT的磷酸化，激活PI3K/AKT信號通路，進而發(fā)揮其促癌作用，促進腎透明細胞癌細胞的增殖和遷移。然而circZBTB44具體調(diào)控PI3K/AKT信號通路的分子機制仍不明確，本研究驗證了circZBTB44主要分布于細胞漿，通過數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)circZBTB44環(huán)上有較多miRNA和RNA相關(guān)蛋白結(jié)合位點，后續(xù)將結(jié)合生物信息學(xué)分析預(yù)測并進行驗證，繼續(xù)深入探索circZBTB44的分子機制。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)circZBTB44在腎透明細胞癌組織和細胞中均高表達，circZBTB44可能促進AKT的磷酸化，激活A(yù)KT信號通路，促進腎透明細胞癌的增殖和遷移能力，有望成為腎透明細胞癌治療的潛在新靶點。