桃AAAP基因家族的鑒定與分析

楊陽,劉媛媛,付鴻博,申成丞

桃基因家族的鑒定與分析

楊陽1*,劉媛媛2,付鴻博2,申成丞2

1. 呂梁學院生命科學系, 山西 呂梁 033000 2. 山西農業大學園藝學院, 晉中 太谷 030801

為了解桃基因家族成員的特征和功能，基于桃基因組，對桃基因家族成員進行理化性質、系統進化樹、基因結構和保守基序以及染色體定位和共線性分析。結果表明，桃中共鑒定到家族成員101個，氨基酸序列范圍在166～593個范圍內，亞細胞定位表明成員全部定位在細胞內膜上；系統進化樹分析顯示桃成員被分為8個亞家族；基因結構和保守基序分析顯示，桃基因家族成員之間基因結構和保守基序存在差異性，但亞家族成員內基因結構和保守基序存在相似性；染色體定位分析顯示桃家族成員不均勻的分布的8條染色體上，有53對基因存在串聯重復，有3對基因存在共線性。本研究初步了解了桃家族成員的特征和功能，為后期在桃中該基因的功能研究在分子水平上提供了理論支撐。

桃;基因家族; 生物信息學

氨基酸主要以有機氮[1]元素的形式參與植物體內蛋白質合成、代謝過程、激素調控等多種生命過程[2]，是多細胞生物體內細胞和組織之間的通訊紐帶[3]。這些功能的實現需要氨基酸運輸系統，(Amino acid/suxin permease)家族是最大的氨基酸轉運蛋白家族之一[1]，可以轉運生長素（吲哚-3-乙酸）、C氨基丁酸和單L-氨基酸以及多個氨基酸。根據序列間相似性和保守結構域的特點可以將分為八個分支，即AAP(氨基酸滲透酶）、LHT(賴氨酸和組氨酸轉運體）、GAT（γ-氨基丁酸轉運體）、ProT(脯氨酸轉運體）、AUX)生長素轉運體）和ANT（芳香性以及中性氨基酸轉運體）以及ATLa、ATLb（類氨基酸轉運體）[4-6]。不同亞家族成員序列間相似性較低，但所有的AAAP蛋白都具有相同的保守結構域，Aa_trans結構域（PF01490)。

自從第一個AAAP蛋白在哺乳動物中被發現鑒定后，家族基因逐漸延伸到植物領域，如擬南芥中，參與賴氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸以及亮氨酸的轉運[7]，和將氨基酸從木質部向韌皮部運輸[8,9]，參與孢子細胞的氨基酸運輸來調控花粉的發育[10]；在煙草中，參與天冬酰胺、天冬氨酸和谷氨酰胺以及谷氨酸的轉運[11]；在楊樹中，參與木質部脯氨酸的轉運[12]；在水稻中，會影響種子發育早期階段氨基酸的分布情況[13]。

桃（(L.) Batsch）薔薇科（Rosaceae)桃屬()，多年生木本植物，是世界上重要的經濟果樹。桃基因組測序的完成和釋放[14]為桃重要基因功能的挖掘提供了可行性。本研究利用生物信息學方法對桃基因家族成員進行了鑒定，并對其成員進行理化性質預測，基因結構，染色體定位和串聯重復以及系統進化樹分析，以期進一步對桃家族基因的功能研究提供基礎信息。

1 材料與方法

1.1 桃AAAP基因家族的鑒定及生物信息學分析

通過GDR（http://www.rosaceae.org)下載桃基因組（genome.v2.2.a1)，通過TAIR（http://arabidopsis.org)下載擬南芥基因家族氨基酸序列。通過Pfam（http：//pfam.xfam.org)搜索隱馬爾可夫模型（PF01490)，利用Hmmer3.0構建本地蛋白數據庫并進行候選基因篩選。將所有候選基因在NCBI上對其保守結構域進行進一步確認。利用ExPASy（https://www.expasy.org）對家族成員進行理化性質分析，利用CELLO（http://cello.life.nctu.edu.tw/）進行亞細胞定位預測。

1.2 桃AAAP基因家族的系統進化樹分析

利用擬南芥AAAP氨基酸序列和桃AAAP氨基酸序列構建系統進化樹：將所有氨基酸序列導入MEGA中，以Cluster W進行序列比對，以Maxumum Likelihood構建系統進化樹。參數設置如下：Bootstrap Replications為1000，Mode/Method為Poisson model，Gaps/Missing Data Treatment為Partial deletion，Site Coverage Cutoff（%）為50，利用iTOL(https://itol.embl.de/)對進化樹進行優化處理。

1.3 桃AAAP家族基因結構與保守基序分析

利用GSDS（http://gsds.gao-lab.org/）對桃進行基因結構分析，利用MEME（http://meme-suite.org/）和TBtools對桃進行保守基序分析。

1.4 桃AAAP基因家族染色體定位和共線性分析

根據桃的位置信息，利用TBtools中MCScanX對桃基因進行染色體定位及串聯重復事件和共線性。

2 結果與分析

2.1 桃AAAP基因家族的鑒定及生物信息學分析

根據HEMMER篩選和NCBI中保守結構域的鑒定，共確認桃中有101個基因家族成員，根據染色體位置將其命名為-（表1），對得到的所有家族成員進行氨基酸長度、分子量、等電點、親水性、脂肪族氨基酸指數和亞細胞定位（表1）表明，氨基酸序列長度從166到593，編碼蛋白長度最小的是，由166個氨基酸組成，編碼蛋白最大的是，由593個氨基酸組成；分子量在19.17 kDa（）～49.54 kDa（）范圍內；等電點在5.41（）～9.99（）；不穩定系數在21.60（）～61.56（）范圍內；脂肪族氨基酸指數在86.22（）～130.89（）范圍內；親水性在0.240（）～-0.942（）范圍內；亞細胞定位表明，所有家族成員均定位在細胞內膜上。

表1 桃PpAAAP家族成員生物信息學分析

Prupe.3G301100.1PpAAAP61Chr343949.033848.9434.72101.910.541InnerMembrane Prupe.4G137000.1PpAAAP62Chr446950.972249.3037.67113.110.524InnerMembrane Prupe.4G277700.1PpAAAP63Chr448052.820169.1139.35102.60.516InnerMembrane Prupe.5G115900.1PpAAAP64Chr545349.688698.8540.63107.840.602InnerMembrane Prupe.5G115900.2PpAAAP65Chr537941.913668.6841.29110.580.629InnerMembrane Prupe.5G115900.3PpAAAP66Chr545349.688698.8540.63107.840.602InnerMembrane Prupe.5G115900.4PpAAAP67Chr534337.446539.0234.58116.820.776InnerMembrane Prupe.5G155600.1PpAAAP68Chr546151.919.0942.78101.870.257InnerMembrane Prupe.5G155600.2PpAAAP69Chr542244.856.3230.58113.460.742InnerMembrane Prupe.5G162500.1PpAAAP70Chr544850.502239.4730.67105.740.421InnerMembrane Prupe.5G162500.2PpAAAP71Chr540145.308679.8528.65110.100.577InnerMembrane Prupe.5G162600.1PpAAAP72Chr521524.331217.8021.6095.670.240InnerMembrane Prupe.5G162700.1PpAAAP73Chr516619.169699.9923.59102.230.371InnerMembrane Prupe.6G032700.1PpAAAP74Chr644349.375189.0738.4792.440.414InnerMembrane Prupe.6G032700.2PpAAAP75Chr646050.888.6731.8586.220.441InnerMembrane Prupe.6G032700.3PpAAAP76Chr636039.791339.5830.74110.830.538InnerMembrane Prupe.6G032700.4PpAAAP77Chr646050.888.6731.8596.220.441InnerMembrane Prupe.6G032700.5PpAAAP78Chr646050.888.6731.8596.220.441InnerMembrane Prupe.6G032700.6PpAAAP79Chr646851.715278.3734.79100.640.438InnerMembrane Prupe.6G032700.7PpAAAP80Chr642346.151836.5231.55115.180.835InnerMembrane Prupe.6G118000.1PpAAAP81Chr643547.560118.8533.71113.860.625InnerMembrane Prupe.6G118000.2PpAAAP82Chr633036.023789.2530.52113.420.727InnerMembrane Prupe.6G118000.3PpAAAP83Chr619421.352369.2025.99120.050.858InnerMembrane Prupe.6G258200.1PpAAAP84Chr654559.233735.4138.27104.260.478InnerMembrane Prupe.6G273000.1PpAAAP85Chr637741.058779.1339.7197.000.341InnerMembrane Prupe.7G038500.1PpAAAP86Chr754058.374735.8334.16111.040.502InnerMembrane Prupe.7G088200.1PpAAAP87Chr748052.652569.2731.72104.810.503InnerMembrane Prupe.7G088200.2PpAAAP88Chr740443.804348.6332.67128.590.931InnerMembrane Prupe.7G177800.1PpAAAP89Chr754159.118689.1938.75102.940.447InnerMembrane Prupe.7G183800.1PpAAAP90Chr742346.151836.5231.55115.180.835InnerMembrane Prupe.7G183800.2PpAAAP91Chr742346.151836.5231.55115.180.835InnerMembrane Prupe.7G183800.3PpAAAP92Chr744949.938069.2834.4496.500.383InnerMembrane Prupe.8G163100.1PpAAAP93Chr834238.108648.8928.1996.930.493InnerMembrane Prupe.8G164200.1PpAAAP94Chr844950.334349.1340.91102.850.494InnerMembrane Prupe.8G164200.2PpAAAP95Chr837641.969.1335.3899.590.578InnerMembrane Prupe.8G173300.1PpAAAP96Chr850255.296028.8335.33104.740.464InnerMembrane Prupe.8G173400.1PpAAAP97Chr850154.437088.6131.64105.570.506InnerMembrane Prupe.8G173500.1PpAAAP98Chr849154.108.6536.44101.710.468InnerMembrane Prupe.8G173800.1PpAAAP99Chr853958.596319.3235.73102.800.487InnerMembrane Prupe.8G179700.1PpAAAP100Chr834939.004758.9028.8798.880.480InnerMembrane Prupe.8G230900.1PpAAAP101Chr842746.60136.5935.43111.150.704InnerMembrane

2.2 桃AAAP基因家族的系統進化樹分析

為分析桃基因在植物中的進化模式，選取擬南芥和桃的AAAP蛋白的氨基酸序列使用MEGA構建系統進化樹（圖1），結果表明，該基因家族可以分為八個亞族，即為AAP(氨基酸滲透酶）、LHT(賴氨酸和組氨酸轉運體）、GAT（γ-氨基丁酸轉運體）、ProT(脯氨酸轉運體）、AUX)生長素轉運體）和ANT（芳香性以及中性氨基酸轉運體）以及ATLa、ATLb（類氨基酸轉運體）。亞族內成員數量最多的為AAP亞族，含有23個成員；其次亞族成員數量加多的為ATLb、LHT、ATLa數量分別為18、18和12；亞族成員數量最少的是AUX亞族和ANT亞族，僅含有4個和6個。

2.3 桃AAAP基因結構與保守基序分析

對桃基因家族101個成員進行基因結構和保守基序分析（圖2、圖3、圖4），結果表明，桃基因家族成員內皆因結構相似性較低，家族成員內部含有的外顯子個數不等。對桃家族中的10個保守基序進行鑒定，發現在桃成員內保守基序間存在差異，motif9高度保守，motif4、5相對保守。每個亞族內成員具有相似的保守基序組成。

圖1 桃AAAP和擬南芥AAAP系統進化樹

圖2 桃AAAP基因結構

圖3 保守基序示例

圖4 桃AAAP保守基序分析

2.4 桃AAAP基因家族染色體定位和共線性分析

為了了解桃基因在染色體上的分布，利用TBtools將桃基因定位在染色體上，同時展示基因串聯重復事件和共線性分析。結果表明（圖5）桃基因不均勻的分布在桃8條染色體上。其中，1號染色體上含有桃基因數量最多，為27個，其次是2號和3號染色體，數量分別為16和18，而4號染色體上僅有兩個基因。基因的串聯重復事件是指位于同一條染色體上的基因物理距離在200 kb內且相似性大于70%的基因。由圖6可以看出，桃基因共有53對基因存在串聯重復，其中，在1號染色體上有13對基因存在串聯重復，2號染色體上9對基因存在串聯重復，3號染色體上有13對基因存在串聯重復，5號染色體上有5對基因基因存在串聯重重復，6號染色體上有6對基因存在串聯重復，7號染色體上存在3對基因有串聯重復，8號染色體上存在4對基因有串聯重復，而在4號染色體上未發現基因串聯重復事件。通過TBtools中MCScanX功能展示桃基因在染色體上共線性（圖6）發現，在桃基因內存在3對基因Prupe.8G173300.1）～（Prupe.1G356000.1）、（Prupe.1G233800.1）～（Prupe.3G300900.1）和（Prupe.1G275100.1）～（Prupe.3G267100.1）具有共線性，由此推測這3對基因可能是由于染色體的大片段復制而形成的。

圖5 桃AAAP基因在染色體上的分布

注：）:代表串聯重復基因。

Note: ) Representative tandem repeat gene

圖6 桃AAAP基因在染色體上分布及共線性分布

3 討論

大量跨膜氨基轉運蛋白在生理和基因層面上都有鑒定[15,16]，作為一個重要的基因家族，基因在植物生長發育的各個方面發揮著重要作用，在玉米[17]、油菜[18]和模式植物擬南芥中均被鑒定到，Yong等[19]曾報道擬南芥中AAP1將氨基酸轉運到擬南芥根部和Grallath等[20]曾報道過擬南芥ProT家族具有相似底物特異性，但表達模式不相同。

系統進化樹根據蛋白序列的相似性以及保守結構域可以揭示物種之間的親緣關系，進而推測基因的功能。通過對桃和擬南芥基因構建系統進化樹發現，桃中含有植物家族的所有亞族（共八個亞族）。AAP亞族的成員能運輸中性條件下帶有正電荷以及堿性氨基酸，在擬南芥中AAP家族還能參與調控植物對根結線蟲的抵抗過程[21]，由此推測桃AAP亞家族內成員具有類似的功能，而此亞族也是桃家族最大的亞族；AUX亞族主要負責轉運生長素物質，在擬南芥中主要轉運吲哚-3-乙酸來促進側根形成[22]由此推測桃AUX亞家族中的成員具有相同的功能；在擬南芥中可以調控根的表皮組織和皮層細胞β-葡萄糖醛酸酶的活性[19]，由此推測桃ProT亞家族內成員具有類似的功能，同樣地，其他亞家族內的成員基因功能也與進化樹上亞家族的擬南芥功能類似。

Motif是蛋白質分子內具有特定空間構象、特定蛋白質功能的結構成分，是結構域的亞單位，與特定功能聯系在一起[23]，推測具有不同motif的家族成員在進化和功能上存在差異。

文獻[24]曾報道，基因部分重復和串聯重復是植物中基因家族擴增的兩個重要因素，根據桃基因家族內的比對，我們檢索到53對基因存在串聯重復和3對基因存在共線性關系。這些研究結果表明桃基因間存在基因串聯重復和部分重復，對桃家族基因的擴張發揮了重要作用。

4 結論

本研究通過對桃基因組內基因家族的篩選，我們共確認鑒定101個家族成員，氨基酸序列長度為166～593范圍內，跨度范圍較廣；等電點和其他理化性質同樣跨度范圍較廣，說明桃基因成員相似性較低，同樣系統進化樹發現，將桃家族分為把八個亞族，與前人[18]研究結果一致。通過對桃家族成員進行基因結構和保守基序分析發現，在桃家族成員內基因結構和保守基序存在差異性，但亞家族成員內基因結構和保守基序分布相對一致。染色體定位和串聯重復事件顯示，桃基因不均勻的分布在桃8條染色體上，同時可以發現桃基因以片段重復和串聯重復的方式擴增。本文在分子水平上為桃基因的功能挖掘提供了一定的理論支持。

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Identification and Analysis ofgene family in(L.) Batsch

YANG Yang1, LIU Yuan-yuan2, FU Hong-bo2, SHEN Cheng-cheng2

1.033000,2.030801,

In order to understand the characteristics and functions offamily members inpeach, based on the peach genome, the physicochemical properties, phylogenetic tree, gene structure and conservative motifs, chromosome location and collinearity analysis ofgene family members were carried out. The results showed that there were 101 members of thefamily identified in(L.) Batsch, with amino acid sequences ranging from 166 to 593. The subcellular location indicated that allmembers were located on the cell membrane; phylogenetic tree analysis showed that the members of thewere divided into 8 Analysis of gene structure and conservative motifs shows that there are differences in gene structure and conservative motifs among members of thefamily in(L.) Batsch, but there are similarities in gene structure and conservative motifs among members of the subfamily; chromosome mapping analysis shows thaton the 8 chromosomes with uneven distribution of family members, 53 pairs of genes have tandem duplication, and 3 pairs of genes have collinearity. This study has a preliminary understanding of the characteristics and functions of the members of thefamily in(L.) Batsch, which provides theoretical support at the molecular level for the later functional research of this gene in(L.) Batsch.

(L.) Batsch;gene family; bioinformatics

A

1000-2324(2021)03-0408-08

2020-10-18

2020-11-25

楊陽(1983-),女,博士研究生,講師,主要從事園藝作物種質資源開發及生物技術應用. E-mail:147414658@ qq.com