五加生化膠囊對早孕大鼠藥物流產出血干預作用的代謝組學研究

張寧，方衡，張愛華，閆廣利，祁永華，李貴森，王發善，王喜軍*

(1.黑龍江中醫藥大學 國家中醫藥管理局中醫方證代謝組學研究中心/國家中醫藥管理局中藥血清藥物 化學重點研究室/中美中醫方證代謝組學技術合作中心，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥 大學佳木斯學院，黑龍江 佳木斯 154007；3.多多藥業有限公司，黑龍江 佳木斯 154002)

五加生化膠囊源于產后圣方《生化湯》[1]，由刺五加、當歸、川芎、桃仁、甘草和干姜6味藥材組成，功效益氣養血、活血化瘀、行氣止痛，主治婦女產后惡露不行及婦女氣虛血瘀或虛寒夾瘀所致痛經等證[2]。代謝組學作為飛速發展起來的熱門技術，是考察機體代謝產物(小分子)隨時間動態變化特點的一門新學科[3-5]。相比臨床常用的酶學指標檢測，具有高效率、速度快、應用廣及高靈敏度等特點[6]。目前對五加生化膠囊的研究多集中于臨床指標觀察及質量控制[7-13]，對其致病機制的研究報道較少。本文首次采用代謝組學方法探討五加生化膠囊對早孕大鼠藥物流產出血干預作用的機制，為中西醫臨床應用五加生化膠囊治療藥物流產出血提供理論依據。

1 材料

1.1 動物

180～220 g的Wistar雌性大鼠，購于黑龍江中醫藥大學GLP實驗室，合格證號：SCXK黑2008-004。

1.2 儀器、試劑與藥物

Agilent6890N氣相色譜儀、5975B質譜儀(美國安捷倫公司)；HP-5 MS柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，正華生物儀器設備有限公司)；KPJ-1A型烤片機、TSJ-1A型自動組織脫水機、BMJ-1型生物組織包埋機(天津航空機電公司)；Ⅸ-71-21PH型Olympus倒置顯微鏡(日本Olympus株式會社)；KD-2508型輪轉切片機(浙江金華科迪儀器設備有限公司)；N-甲基-三甲基硅烷基-三氟乙酰胺(MSTFA，英國Apollo Scientific有限公司)；三甲基一氯硅烷(TMCS，美國Acros Organics公司)；五加生化膠囊(批號：0911251,多多藥業有限公司)；米非司酮片、米索前列醇片(批號：H1095003、H20010456,北京紫竹藥業有限公司)。

2 方法

2.1 灌胃藥液制備

米非司酮混懸液配制：取米非司酮片3片(25 mg/片)，搗碎溶于75 mL生理鹽水中，超聲10 min，即得；米索前列醇混懸液配制：取米索前列醇片3片(200 μg/片)，搗碎溶于60 mL生理鹽水中，超聲10 min，即得；五加生化膠囊混懸液配制：充分研磨五加生化膠囊內容物，過篩后使每毫升混懸液含生藥量0.25 g[14]。

2.2 藥物流產出血模型

將動情大鼠以王氏造模方法[15]按雌雄比2∶ 1合籠，次日早對陰道涂片進行檢查，顯微觀察到精子即受孕第1天。挑選受孕后大鼠，隨機分為4組(8只/組)，即正常組、受孕對照組、模型組和五加生化組。模型組和五加生化組大鼠于實驗第7天分別灌胃給予米非司酮和米索前列醇，灌胃劑量0.13 g/kg。

2.3 給藥方案

模型組自藥物流產第1天起，灌胃給予生理鹽水(1 mL/100 g)，連續7 d；五加生化組自藥物流產第1天起，灌胃給予五加生化膠囊混懸液(1 mL/100 g)，連續7 d[16]，正常組和受孕對照組灌胃給予蒸餾水。

2.4 樣品的采集

2.4.1 血清樣品采集

采集血樣前禁食不禁水12 h，在實驗第1、8,14天眼眶取血，實驗結束時下腔靜脈取血，分離血清，置于-80 ℃冰箱保存。

2.4.2 藥物流產出血時間及血樣收集

自實驗第8天，放置棉球于大鼠陰道內(相隔6 h·次-1·d-1)，觀察其是否有血漬，并收集于-20 ℃冰箱。藥物流產出血時間為取出棉球無血漬時間距離第1次取出棉球時間。

實驗進行至14 d時，將NaOH溶液(5 %，4 mL)加入各組大鼠尾靜脈血(0.02 mL)混勻。用5%NaOH溶液浸泡并搓洗收集棉球的血漬，根據出血量適當調整溶液用量并記錄。過濾浸提液，分別將大鼠尾靜脈血5%NaOH溶液、已過濾的浸提液各4 mL檢測其吸光度A值(546 nm)，并計算子宮出血量。

2.5 指標檢測

2.5.1 子宮組織病理學檢查

實驗第14天，用4%中性緩沖多聚甲醛液固定新鮮大鼠子宮組織，經處理后，用蘇木素-伊紅進行染色，封片后進行顯微鏡下觀察。

2.5.2 血清代謝組學研究

2.5.2.1 樣本預處理

取150 μL解凍后血清，加入450 μL甲醇，渦漩3 min，冰水浴10 min后離心(10 000 r/min，10 min，4 ℃)。取上清液400 μL氮吹干。加入50 μL甲氧胺吡啶溶液(15 mg/mL)渦漩混勻，70 ℃下反應1 h，加入75 μL衍生化試劑(MSTFA∶ TMCS=100∶ 1)，密封渦漩混勻，70 ℃條件下放置1 h。室溫冷卻后加150 μL含二十二烷(0.10 mg/mL)的正庚烷渦漩，離心(10 000 r/min，4 ℃，10 min)后取上清液進行GC-MS分析。

2.5.2.2 GC-MS分析

氦氣作為載氣，流速恒為1.0 mL/min；不分流進樣，進樣量2 μL，進樣口溫度為280 ℃；程序升溫：開始時85 ℃保持5 min，以10 ℃/min升至128 ℃，保持2 min，以15 ℃/min升至200 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升至220 ℃，以10 ℃/min升至250 ℃，以20 ℃/min升至280 ℃保持10 min；EI離子源70 eV；離子源溫度：230 ℃，四極桿溫度：150 ℃；調諧方式：自動調諧；質量掃描方式及范圍：全掃描，50～1 000 aum。

2.6 數據處理

3 結果

3.1 五加生化膠囊對藥物流產出血大鼠子宮組織形態的影響

正常組大鼠子宮組織及子宮腔狀態均正常；受孕對照組大鼠子宮組織中滋養細胞存在明顯；模型組大鼠子宮組織中沒有明顯的滋養細胞存在，蛻膜細胞呈片狀壞死，部分出現核固縮現象，子宮腔含較多瘀血；五加生化組大鼠子宮組織蛻膜細胞存在不明顯，子宮腔中不含瘀血。見圖1。

3.2 五加生化膠囊對藥物流產大鼠子宮出血量及出血時間的影響

如表1所示，與正常組相比，模型組子宮出血量及出血時間顯著增加(P<0.01)。與模型組相比，五加生化組子宮出血量明顯減少(P<0.05),出血時間顯著縮短(P<0.01)。

注：A：正常組；B：受孕對照組；C：模型組；D：五加生化組。圖1 大鼠子宮組織形態(HE染色,100×)

表1 大鼠子宮出血量及出血時間

3.3 代謝輪廓分析

見圖2，用PCA法分析大鼠血清樣本，繪制反映組間離散程度的2D得分圖，可視化樣本分析結果。

3.4 藥物流產出血代謝標記物的確定

如圖3所示，采用EZinfo2.0軟件針對性的建立正常組和模型組間的OPLS-DA分析，以顯示化合物對離散趨勢貢獻程度，結合對組分有貢獻意義的VIP值,確定VIP>1.2為潛在標記物。使用NIST05a質譜數據庫檢索篩選出來的化合物，為甘氨酸、2-丁烯二酸、絲氨酸、氨基丙二酸、L-焦谷氨酸、磷酸甘油酯、L-鳥氨酸、L-賴氨酸、D-半乳糖、L-酪氨酸、D-葡萄糖酸、花生四烯酸、2-單棕櫚酸甘油酯，2-單硬脂酸甘油酯和膽固醇等15個潛在代謝標記物。

注：A為實驗第1天；B為實驗第2天；C為實驗第8天。圖2 正常組、模型組和五加生化組的PCA分析圖

注：K為正常組，M為模型組;A為Score圖;B為S-plot圖。圖3 實驗第14天正常組和模型組在OPLS-DA模式下的score、S-Plot圖

3.5 潛在生物標記物的相對峰面積

潛在代謝標記物的相對峰面積數值反映了該代謝標記物的含量。正常組、模型組和五加生化組的潛在代謝標記物相對峰面積結果見表2。與正常組比較，模型組大鼠血清中甘氨酸、氨基丙二酸、L-焦谷氨酸、L-酪氨酸(P<0.01)含量和絲氨酸、L-鳥氨酸、膽固醇(P<0.05)含量顯著降低，2-丁烯二酸、磷酸甘油酯、L-賴氨酸、D-半乳糖、D-葡萄糖酸、2-單棕櫚酸甘油酯和2-單硬脂酸甘油酯相含量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，五加生化組大鼠血清中甘氨酸、絲氨酸、氨基丙二酸、L-鳥氨酸、L-酪氨酸、花生四烯酸(P<0.01)，L-焦谷氨酸和膽固醇(P<0.05)含量顯著升高，2-丁烯二酸、磷酸甘油酯、2-單棕櫚酸甘油酯、2-單硬脂酸甘油酯(P<0.01)、L-賴氨酸，D-半乳糖和D-葡萄糖酸(P<0.05)含量顯著降低。

表2 潛在代謝標記物的相對峰面積

4 討論

從潛在生物標記物的角度來看，給予米非司酮和米索前列醇后，主要影響了動物機體內脂肪酸、糖及氨基酸的代謝。

脂肪酸代謝過程中，腸道菌群代謝對其生物合成和代謝有調控作用，脂肪酸的含量和組成變化會反作用于機體，影響能量供應[17]，導致體溫變化從而影響酶的活性作用，繼而使氨基酸的代謝發生改變。本實驗通過VIP predictive和t檢驗，共找到相關潛在性標記物15個并對其含量進行了分析，發現與正常組相比，2-羥基丁酸、磷酸甘油酯、L-賴氨酸、D-半乳糖、D-葡萄糖酸，2-單棕櫚酸甘油酯和2-單硬脂酸甘油酯含量升高，甘氨酸、絲氨酸、氨基丙二酸、L-焦谷氨酸、L-鳥氨酸、L-酪氨酸，花生四烯酸和膽固醇含量降低。實驗第14天，在五加生化組中相關潛在生物標記物具有回調趨勢。

單硬脂酸甘油酯和單棕櫚酸甘油酯是飽和脂肪酸和棕櫚酸的代謝產物，服用米非司酮和米索前列醇后，其含量降低，影響了脂肪酸的代謝。花生四烯酸作為一種人體必需的主要分布于機體脂肪、腦、肝臟等器官的不飽和脂肪酸，血栓素和前列素等的合成均能受其影響[18-19]。且花生四烯酸具有調節血小板聚集、平滑肌收縮、炎性細胞因子的產生等一系列生理活性[20]，因此，花生四烯酸的代謝在體內顯得尤為重要。口服米非司酮和米索前列醇導致藥物流產出血，影響了脂肪酸代謝，其中降低了花生四烯酸在血清中的濃度，影響了大鼠子宮平滑肌的收縮，使蛻膜組織不能順利排出體外，刺激子宮內膜，使出血時間延長。影響了血液凝固和血液黏度，使子宮出血不止，子宮受損處無法及時修復而導致出血時間延長。

由于藥物流產出血對脂肪酸的代謝及糖代謝的影響，使得氨基酸代謝也受到影響。氨基酸代謝需要大量的酶參與，一旦能量代謝途徑發生異常，體溫會受到很大影響，將直接影響酶的活性，繼而影響氨基酸代謝。本實驗結果顯示，模型組大鼠甘氨酸、鳥氨酸、焦谷氨酸、絲氨酸和酪氨酸含量明顯降低，賴氨酸含量升高，說明藥物流產出血影響了氨基酸代謝。而含量變化顯著的絲氨酸與本實驗密切相關。絲氨酸屬于非必需氨基酸，高度集中在所有細胞膜上，在細胞增殖中起著核心作用。絲氨酸合成的數量不足將直接導致細胞的生長受到抑制。藥物流產出血后，影響了絲氨酸的代謝，抑制了其合成，受損細胞生長受阻，組織修復緩慢，導致流產出血時間延長，可能是藥物流產出血時間長的機制之一。

綜上所述，五加生化膠囊可在一定程度上對大鼠的藥物產后出血產生治療作用，其作用可能是通過調節脂肪酸代謝及氨基酸的產生等途徑來實現的。本實驗對于深入研究和揭示中藥復方治療藥物流產出血的多靶點治療特點和優勢具有重要意義。