黃連溫膽湯含藥血清干預(yù)IR-3T3-L1細(xì)胞的最佳濃度與時(shí)間篩選

韓宇博，田苗，劉紫君，婁宏君，王瑞楠，張丹丹，郭東浩，劉莉*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是指機(jī)體對(duì)胰島素調(diào)節(jié)作用/葡萄糖利用敏感度反應(yīng)下降，代償性增加胰島素分泌水平，以保持內(nèi)環(huán)境及血糖穩(wěn)態(tài)[1-2]。中醫(yī)藥在改善IR從而防治代謝性疾病及糖尿病方面具有鮮明特點(diǎn)，筆者前期研究[3-6]發(fā)現(xiàn)：黃連溫膽湯可降低飲食誘導(dǎo)代謝綜合征大鼠血壓、血糖、體質(zhì)量、血脂水平，降低炎性細(xì)胞因子及脂聯(lián)素水平，可上調(diào)胰島素受體底物、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體等基因的mRNA和蛋白表達(dá)，改善IR。基于體外細(xì)胞培養(yǎng)體系研究黃連溫膽湯含藥血清的作用機(jī)制具有重要意義。體外研究中，如何制定含藥血清與細(xì)胞培養(yǎng)體系的比例，能夠產(chǎn)生最佳干預(yù)效果，是亟須解決的問題。因此本研究探討黃連溫膽湯含藥血清干預(yù)IR-3T3-L1細(xì)胞的最佳濃度與時(shí)間，為后續(xù)進(jìn)一步的機(jī)制研究提供確切的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株及動(dòng)物

3T3-L1小鼠胚胎成纖維細(xì)胞購(gòu)買于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。30只SPF級(jí)雄性SD大鼠購(gòu)自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體質(zhì)量(200±20)g，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(黑)2 015 006。飼養(yǎng)環(huán)境溫度22～24 ℃，相對(duì)濕度40%～50%；飼養(yǎng)密度為5只/籠，自由飲食水，隔日更換墊料，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)研究，研究過程符合動(dòng)物倫理學(xué)要求。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

黃連溫膽湯：黃連10 g，清半夏10 g，竹茹15 g，枳實(shí)10 g，陳皮15 g，茯苓10 g，生姜5 g，炙甘草10 g，所有飲片購(gòu)自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院草藥局，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室鑒定，符合2015版《中華人民共和國(guó)藥典》一部要求。鹽酸二甲雙胍標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自天津阿爾法生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

OriCellTMSD大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基試劑盒(賽業(yè)生物科技有限公司)，DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco)，胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(HyClone)，胰蛋白酶(Gibco)，PBS(HyClone)，地塞米松(Sigma)，DMSO(Sigma)，戊巴比妥鈉(Sigma)，葡萄糖測(cè)定試劑盒(中生北控生物科技公司)，葡萄糖氧化酶(Glucose oxidas，GOD)Elisa試劑盒(Mobio)，CCK-8試劑盒(索萊寶)。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

BSC-1300IIAz生物安全柜(江蘇蘇凈集團(tuán))，CKX41 FS倒置相差顯微鏡(OLYMPUS)，MCO-18AC二氧化碳培養(yǎng)箱(Panasonic)，MULTISKAN FC酶標(biāo)儀(Thermo)，SORVALL ST8/8R低溫離心機(jī)(Thermo)等。

2 方法

2.1 黃連溫膽湯含藥血清的制備

將黃連溫膽湯各飲片混合，加入14倍量的蒸餾水，煎煮3次，每次煎煮1 h，紗布過濾，3次藥液合并，減壓濃縮至稠膏狀，并用凍干機(jī)做成凍干粉。30只SD大鼠用隨機(jī)數(shù)字法分為黃連溫膽湯組15只，空白組15只，黃連溫膽湯組每日灌服黃連溫膽湯凍干粉稀釋液(2.1 g生藥/mL，每100 g體質(zhì)量給予2 mL藥液)，空白組每日灌服與中藥組等體積蒸餾水，每日早、晚各灌胃1次，連續(xù)灌胃5次，于末次灌胃1 h后將大鼠用1%戊巴比妥鈉麻醉，無菌條件下腹主動(dòng)脈采血并分離血清，0.22 μm微孔濾膜過濾，56 ℃,30 min滅活，分裝并區(qū)分標(biāo)注為空白血清和含藥血清，-80 ℃保存?zhèn)溆肹7]。

2.2 誘導(dǎo)3T3-L1細(xì)胞成脂分化

參照OriCellTMSD大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基試劑盒說明書，在超凈工作臺(tái)中配制誘導(dǎo)培養(yǎng)基A液和B液，確保混合均勻之后即可使用。其中A液包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基175 mL，F(xiàn)BS 20 mL，雙抗2 mL，谷氨酰胺2 mL，地塞米松200 μL，胰島素400 μL，3-異丁基-1-甲基黃嘌呤200 μL，羅格列酮200 μL；B液包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基175 mL，F(xiàn)BS 20 mL，雙抗2 mL，谷氨酰胺2 mL，胰島素400 μL。5%CO2，37 ℃培養(yǎng)條件下的3T3-L1細(xì)胞，每隔3 d換增殖培養(yǎng)基1次，直到細(xì)胞融合達(dá)到100%或者過融合；移除細(xì)胞增殖培養(yǎng)基，向60 mm培養(yǎng)皿中加入3 mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基A液維持3 d，更換培養(yǎng)液為2 mL B液維持24 h，再換回A液，如此反復(fù)3個(gè)循環(huán)，用B液維持培養(yǎng)4～7 d直到脂滴變得足夠大、圓。油紅染色并在倒置顯微鏡下拍照。

2.3 胰島素抵抗3T3-L1細(xì)胞模型構(gòu)建及分組

在96孔板上培養(yǎng)3T3-L1成纖維細(xì)胞，成脂分化后加入含有1 μmol/L地塞米松的增殖培養(yǎng)基，培養(yǎng)96 h即可構(gòu)建IR-3T3-L1脂肪細(xì)胞模型，且36 h內(nèi)模型穩(wěn)定[8-9]。將IR-3T3-L1脂肪細(xì)胞隨機(jī)分為模型組(8%空白血清)、中藥高劑量組(8%含藥血清)、中藥中劑量組(4%含藥血清+4%空白血清)、中藥低劑量組(2%含藥血清+6%空白血清)和二甲雙胍組(8%空白血清+1 mmol/L鹽酸二甲雙胍溶液)，另外選用分化成熟的3T3-L1細(xì)胞作為正常組(8%空白血清)，共6組，每組3個(gè)復(fù)孔，分別在加藥后12 h、24 h和36 h收取培養(yǎng)板各孔剩余培養(yǎng)液，用于指標(biāo)測(cè)定。

2.4 檢測(cè)指標(biāo)測(cè)定方法

CCK-8測(cè)定細(xì)胞活力：向培養(yǎng)板的每孔加入10 μL CCK-8溶液孵育1 h；用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度，計(jì)算細(xì)胞活力；參照葡萄糖測(cè)定試劑盒說明書完成培養(yǎng)液葡萄糖含量檢測(cè)，葡萄糖消耗量=未接種細(xì)胞的培養(yǎng)液葡萄糖含量-樣本培養(yǎng)液葡萄糖含量；應(yīng)用ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)液中GOD含量。

2.5 統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，多組間樣本比較采用單因素方差分析，非正態(tài)分布樣本多組間樣本比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)；認(rèn)為P<0.05時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 誘導(dǎo)3T3-L1細(xì)胞成脂分化情況

如圖1所示，3T3-L1小鼠成纖維細(xì)胞復(fù)蘇后貼壁良好，細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞內(nèi)無脂滴；3T3-L1達(dá)到融合狀態(tài)后，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基A液作用3 d，再更換為誘導(dǎo)培養(yǎng)基B液作用1 d，如此反復(fù)3個(gè)循環(huán)，細(xì)胞回縮變圓，細(xì)胞內(nèi)逐漸出現(xiàn)脂滴；繼續(xù)應(yīng)用誘導(dǎo)培養(yǎng)基B液作用4～7 d，細(xì)胞內(nèi)充滿脂滴，呈典型的“戒環(huán)狀”；油紅染色成功，脂滴被染為紅色，可見3T3-L1細(xì)胞誘導(dǎo)分化率達(dá)80%以上。

3.2 細(xì)胞活力水平比較

如表1所示，干預(yù)12 h和36 h時(shí)，各組OD450nm較正常組下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；干預(yù)24 h時(shí)，模型組和二甲雙胍組OD450nm較正常組下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

注：A：3T3-L1小鼠成纖維細(xì)胞復(fù)蘇后狀態(tài)；B：3T3-L1細(xì)胞第3次換入誘導(dǎo)培養(yǎng)基B液；C：3T3-L1細(xì)胞繼續(xù)用誘導(dǎo)培養(yǎng)基B液培養(yǎng)4天；D：3T3-L1脂肪細(xì)胞油紅O染色。圖1 誘導(dǎo)3T3-L1細(xì)胞成脂分化情況(100×)

表1 各組CCK-8孵育后吸光度水平比較

如圖2所示，干預(yù)12 h、24 h和36 h的各組間細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，干預(yù)12 h、24 h時(shí)，中藥高、中、低劑量組細(xì)胞活力相當(dāng)，干預(yù)36 h時(shí)，中藥高、低劑量組細(xì)胞活力較中藥中劑量組有下降趨勢(shì)。

圖2 12 h、24 h及36 h各組細(xì)胞活力水平

3.3 葡萄糖消耗量水平

如表2所示，藥后干預(yù)12 h、24 h及36 h，正常組葡萄糖消耗量均高于其余5組；各組給藥干預(yù)12 h，模型組葡萄糖消耗量明顯低于其余5組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；各組給藥干預(yù)24 h后，各組葡萄糖消耗量較12 h增高，但中藥低劑量組與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其余各組葡萄糖消耗量仍高于模型組(P<0.05)；各組給藥干預(yù)36 h后，中藥高劑量組和中藥低劑量組葡萄糖消耗量與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，僅中藥中劑量組和二甲雙胍組葡萄糖消耗量較模型組升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著取樣時(shí)間點(diǎn)的推遲，各組葡萄糖消耗量增加，模型組與各用藥組間差值增大。

表2 各組12 h、24 h、36 h取樣點(diǎn)葡萄糖消耗量水平 的比較

3.4 ELISA測(cè)得葡萄糖氧化酶水平

標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：Y=0.035 02+0.019 92X，R2=0.999 71；所有數(shù)據(jù)處理均去除本底，即去除孔板本身的OD值。將各組檢測(cè)所得OD值代入回歸方程，得到各組葡萄糖氧化酶濃度(GOD),見表3。干預(yù)12 h和24 h時(shí)，各組培養(yǎng)基中GOD濃度水平相當(dāng)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；干預(yù)36 h時(shí)，模型組培養(yǎng)基中GOD濃度低于中藥中劑量組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 各組間葡萄糖氧化酶水平的比較

4 討論

血清藥理學(xué)是由日本學(xué)者田代真一首次提出的，它是一種研究非單體藥物的藥理學(xué)方法，通過實(shí)驗(yàn)對(duì)象經(jīng)口給藥一段時(shí)間后采集血液，制備含藥血清，從而模擬藥物從體內(nèi)經(jīng)吸收代謝后出現(xiàn)的新成分和產(chǎn)物。由于這種方法提取的含藥血清比較接近藥物在體內(nèi)的代謝情況，所以更適合藥物種類繁多、成分復(fù)雜、含量不確定的中藥復(fù)方研究。本實(shí)驗(yàn)屬中藥血清藥理學(xué)范疇，其意義在于模擬體內(nèi)藥理活動(dòng)過程，是中藥藥理學(xué)研究的重要方法，自發(fā)明以來被廣泛使用[10]。

目前誘導(dǎo)3T3-L1脂肪細(xì)胞的方法很多，最常用的是傳統(tǒng)“雞尾酒”法[11]，但“雞尾酒”法存在諸多影響因素，例如FBS的質(zhì)量、誘導(dǎo)劑的配制、誘導(dǎo)劑作用時(shí)間、細(xì)胞融合程度等，因此涌現(xiàn)出大量學(xué)者研究誘導(dǎo)配方的改進(jìn)，尚無統(tǒng)一造模方法可供參考。考慮使用已經(jīng)商品化的OriCellTMSD大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，減少影響因素。雖然該試劑盒主要應(yīng)用于骨髓間質(zhì)干細(xì)胞成脂分化，但其具有增強(qiáng)趨向脂肪細(xì)胞分化的能力，同時(shí)誘導(dǎo)培養(yǎng)基A組成較傳統(tǒng)“雞尾酒”法多了羅格列酮溶液，羅格列酮是噻唑烷二酮類胰島素增敏劑，可激活特異性過氧化物酶體增殖因子γ型受體，Vishwanath D[12]等研究與其相似，在傳統(tǒng)“雞尾酒”法加入曲格列酮溶液(同屬噻唑烷二酮類胰島素增敏劑)后明顯提高3T3-L1細(xì)胞誘導(dǎo)分化率。在本實(shí)驗(yàn)中，誘導(dǎo)時(shí)間持續(xù)16～19 d，相比于傳統(tǒng)方法誘導(dǎo)時(shí)間較長(zhǎng)，但實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較好，經(jīng)油紅O染色鑒定，認(rèn)為成脂分化率可穩(wěn)定維持在80%以上。

目前，IR-3T3-L1脂肪細(xì)胞模型的建立方法主要有：①炎癥因子刺激，例如腫瘤壞死因子α[13]、白介素6[14]等；②棕櫚酸或游離脂肪酸刺激[15]；③高濃度胰島素刺激[16]；④糖皮質(zhì)激素刺激，例如地塞米松[17]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用含1 μmol/L地塞米松的增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞，建立IR-3T3-L1脂肪細(xì)胞模型。進(jìn)一步用于黃連溫膽湯含藥血清干預(yù)IR-3T3-L1脂肪細(xì)胞最佳濃度和時(shí)間的篩選。

黃連溫膽湯含藥血清所產(chǎn)生的量效關(guān)系與動(dòng)物的給藥量及體外培養(yǎng)體系中血清的濃度共同決定，前期研究中，依據(jù)含藥血清色譜峰強(qiáng)度及數(shù)量分析實(shí)驗(yàn)，已經(jīng)確定了大鼠的給藥量，因此，本實(shí)驗(yàn)中將相對(duì)固定的黃連溫膽湯含藥血清以不同比例加入到培養(yǎng)體系，以期明確體外培養(yǎng)體系中黃連溫膽湯含藥血清的最佳配比關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)設(shè)定整個(gè)培養(yǎng)體系中總血清濃度所占比為13%，其中FBS濃度占5%，因?yàn)閺?T3-L1成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞，再到建立胰島素抵抗模型，培養(yǎng)體系中均含有FBS，全部換為大鼠含藥血清或正常血清易引起3T3-L1脂肪細(xì)胞“不適”，對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境感到陌生，維持5%FBS濃度的目的就是為了保證3T3-L1脂肪細(xì)胞以較好狀態(tài)存活，排除細(xì)胞自身的影響。筆者將黃連溫膽湯含藥血清分為3個(gè)不同比例，分別是8%、4%和2%，將其命名為中藥高、中、低劑量組，余下血清用正常大鼠血清補(bǔ)充，以保證各組間相對(duì)一致，具有可比性。IR-3T3-L1脂肪細(xì)胞模型在36 h內(nèi)較為穩(wěn)定[8]，因此本研究在36 h內(nèi)設(shè)定了3個(gè)取樣點(diǎn)，分別為12 h、24 h和36 h，通過觀察不同濃度黃連溫膽湯含藥血清對(duì)IR-3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗量、葡萄糖氧化酶含量和細(xì)胞活力的影響，篩選含藥血清干預(yù)IR-3T3-L1的最佳濃度和最佳時(shí)間。

CCK-8法是目前常用于測(cè)定細(xì)胞活力的方法之一[18-19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃連溫膽湯含藥血清及二甲雙胍溶液對(duì)IR-3T3-L1脂肪細(xì)胞活性無明顯影響，該濃度的范圍的黃連溫膽湯含藥血清及二甲雙胍溶液的細(xì)胞毒性可忽略不計(jì)。各組干預(yù)24 h的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，模型組和二甲雙胍組OD450nm較正常組下降，但經(jīng)細(xì)胞活力公式計(jì)算后二者無差異，說明培養(yǎng)板、培養(yǎng)基及CCK-8溶液本身可能存在對(duì)吸光度的影響，在排除它們的干擾后，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為準(zhǔn)確，認(rèn)為黃連溫膽湯含藥血清不同濃度及不同作用時(shí)間對(duì)IR-3T3-L1脂肪細(xì)胞活力無明顯影響，對(duì)于最佳藥物濃度及干預(yù)時(shí)間的篩選，可忽略細(xì)胞活力的影響。

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)各組培養(yǎng)基中葡萄糖消耗情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：黃連溫膽湯各劑量組和二甲雙胍能夠改善3T3-L1脂肪細(xì)胞的IR程度，隨著取樣時(shí)間點(diǎn)的推遲，各組葡萄糖消耗量逐漸增加，模型組與各用藥組間差值增大。在干預(yù)36 h時(shí)，模型組與其他用藥組葡萄糖消耗量差值最大，可見干預(yù)時(shí)間達(dá)到36 h時(shí)，用藥組發(fā)揮了最大改善胰島素抵抗的作用，但僅有中藥中劑量組、二甲雙胍組與模型組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明隨著干預(yù)時(shí)間的推移，中藥高、低劑量?jī)山M提高葡萄糖消耗量的作用逐漸減弱，只用中藥中劑量組和二甲雙胍組能夠一直保持提高葡萄糖消耗量的作用，因此推測(cè)中劑量的黃連溫膽湯含藥血清(4%)干預(yù)IR-3T3-L1脂肪細(xì)胞36 h，可明顯改善其胰島素抵抗水平，增加葡萄糖消耗量及葡萄糖的利用度。

本實(shí)驗(yàn)亦應(yīng)用ELISA法測(cè)定各組培養(yǎng)基中GOD含量，首先是想明確3T3-L1脂肪細(xì)胞培養(yǎng)基中是否含有GOD，目前的結(jié)果顯示培養(yǎng)基中含有GOD，而且在干預(yù)36 h中藥中劑量組明顯出現(xiàn)提高葡萄糖消耗量的同時(shí)，中劑量組GOD含量與模型組比較差異明顯，說明在藥物的干預(yù)作用下，可調(diào)節(jié)IR-3T3-L1脂肪細(xì)胞培養(yǎng)基中的GOD含量，而且GOD來源于細(xì)胞，通過某種機(jī)制將胞內(nèi)的GOD釋放到培養(yǎng)基中，但應(yīng)考慮樣本量的限制，由于是進(jìn)行最佳藥物劑量和最佳干預(yù)時(shí)間的篩選，所以本實(shí)驗(yàn)每組設(shè)計(jì)3個(gè)復(fù)孔，若想明確GOD含量變化情況，可在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中擴(kuò)大樣本量，同時(shí)提高實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)的是培養(yǎng)基中的GDO含量，可能存在細(xì)胞外影響機(jī)制，后續(xù)實(shí)驗(yàn)考慮棄掉培養(yǎng)基，通過裂解細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)GOD含量，以明確問題所在。

綜上所述，黃連溫膽湯含藥血清及二甲雙胍溶液無細(xì)胞毒性，對(duì)IR-3T3-L1脂肪細(xì)胞的活力無影響，在最佳藥物濃度及干預(yù)時(shí)間的篩選時(shí)可忽略細(xì)胞活力的因素，僅考慮葡萄糖消耗量的變化即可。最終確定中劑量的黃連溫膽湯含藥血清(4%)干預(yù)IR-3T3-L1脂肪細(xì)胞36 h是最佳給藥方案，可用于后續(xù)機(jī)制探討的實(shí)驗(yàn)研究。