白術對D-半乳糖致衰老小鼠學習記憶和抗氧化能力的影響

翟春梅,薛迎鳳,郭鵬飛,白晨曦,石雅維,孟永海,高利權

(黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

本文采用穿梭實驗視頻分析系統，考察白術對D-半乳糖致亞急性衰老模型小鼠的學習記憶能力的影響，再結合體質量、臟器指數及血清SOD、GSH-Px，CAT和T-AOC活力等指標，系統闡述白術對衰老產生的學習記憶能力影響特征，從而進一步揭示白術的抗衰老作用機制。

1 儀器與材料

1.1 實驗儀器

CT15RE型高速粉碎離心機(日本日立); OSB-2200型水浴鍋(上海愛朗儀器有限公司); AL 204電子天平(美國METTLER TOLEDO公司); KQ-5200DB型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司); EVOLUTION260型紫外分光光度計(美國賽默飛公司); ZH-CSC型穿梭實驗視頻分析系統Shuttle box system(徐州利華電子科技發展有限公司)。

1.2 實驗試劑

超氧化物歧化酶試劑盒(批號：20190519)，谷胱甘肽過氧化物酶試劑盒(批號：20190621)，總抗氧化能力試劑盒(批號：20190519)，過氧化氫酶試劑盒(批號：20190723)，以上均試劑盒購自南京建成生物工程研究所有限公司；抗壞血酸(天津市風船化學試劑科技有限公司，批號：20191125); D-半乳糖(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20180125)。

1.3 實驗動物及分組

選取KM小鼠36只(雄性)，隨機分至空白組、模型組、白術水提取液高、中、低劑量組和陽性藥組。適應性喂養7 d，晝夜12 h交替照明。

2 實驗方法及觀察指標

2.1 灌胃藥液制備

稱取2.4 kg白術生品粉碎成小塊，加10倍量水浸泡2 h，煎煮3 h，將濾液濃縮后旋蒸干溶劑，得到白術干膏，出膏率為35%，將浸膏溶于一定量蒸餾水，得到灌胃藥液。

2.2 D-半乳糖致衰老模型的建立

D-半乳糖模型組、白術高、中、低劑量組和抗壞血酸陽性藥組小鼠每日腹腔注射250 mg·kg-1的D-半乳糖溶液，空白組小鼠每日腹腔注射等量的生理鹽水。造模同時陽性藥組每日給予抗壞血酸100 mg·kg-1，高劑量組每日給予干膏2.80 g·kg-1，中劑量組每日給予藥液1.68 g·kg-1，低劑量組每日給予藥液0.56 g·kg-1。造模并給藥共計5周[13-17]。

2.3 一般狀態觀察

觀察各組小鼠日常狀態，包括飲水、攝食、糞便、活動度、毛皮光澤度變化等方面，進行組間比較。從第0周開始每周記錄小鼠體質量。

2.4 臟器指數測定

各組小鼠禁食12 h后，稱取各組小鼠的空腹質量，將經過采血處理后的小鼠脫頸處死，在冰上進行解剖，依次取出小鼠脾臟、肝臟組織，在冷的生理鹽水中漂洗除去血液后，剝離脂肪組織和結締組織，濾紙吸干表面水分，稱重記錄，計算臟器指數。

三相并網逆變器的MPDPC策略如圖3所示,不同的電壓矢量產生不同的有功和無功功率變化,因此,存在多種方式去選擇合適的開關狀態去控制有功和無功功率。采樣三相電網電壓和電流,分別在8個矢量的作用下計算出下一周期的功率預測值,將預測值代入式(9),根據誤差最小化原則,選取最優矢量。p*由直流電壓外環PI調節器的輸出與直流電壓的乘積給定,q*通常設為0,以實現單位功率因數運行。

2.5 行為學評價

在給藥及造模的最后1周，進行穿梭箱實驗。將小鼠置于穿梭箱中，小鼠適應5 min消除探索反射，給予嗡鳴刺激5 s后,隨即給予電刺激10 s，每次訓練間隔10 s，共訓練30次，共3 d，通過小鼠主動躲避次數和被動躲避次數與無反應次數考察D-半乳糖致衰小鼠灌服白術提取液后習得能力。

2.6 血清抗氧化能力測定

D-半乳糖腹腔注射造模5周后，在最末次給藥后12 h，摘取小鼠眼球取血，取出的小鼠血液于冰上靜置1 h，離心10 min(3 500 r·min-1)，吸取上層血清，于-80 ℃冰箱中保存。按照超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)，總抗氧化能力(T-AOC)和過氧化氫酶(CAT)試劑盒說明進行指標測定。

2.7 統計學方法

3 實驗結果

3.1 一般狀態觀察結果

對小鼠進行日常觀察，總結小鼠日常狀態觀察表如表1所示。模型組小鼠在攝食、飲水方面出現了減少，毛皮晦暗不順滑、無光澤，并出現掉毛現象，精神狀態差，活動不活躍，出現了便溏的現象，提示經過D-半乳糖腹腔注射的小鼠出現了一系列衰老現象。與空白組小鼠對比，陽性藥組小鼠整體活躍、活動靈敏、飲水多、毛皮光亮順滑。給藥組小鼠在造模前期出現了便溏，提示可能D-半乳糖導致小鼠產生全身性的衰老，腸道滲水利濕能力不足，藥效短期內不顯著。隨著給藥日期的延長，給藥組小鼠逐漸恢復正常排便。

表1 小鼠一般狀態觀察表(n=6)

小鼠0至5周體質量測量見表2。結果顯示，當連續通過腹腔注射給予KM小鼠D-半乳糖(250 mg·kg-1)溶液5周，模型組小鼠體質量較高劑量組、中劑量組、陽性藥組小鼠產生極顯著性(P<0.01)降低；低劑量組小鼠第5周平均體質量較模型組小鼠發生顯著性(P<0.05)回調。當給予給藥組小鼠白術水提取物后，在體質量方面，第5周各組小鼠平均體質量從大到小依次為：陽性藥組>高劑量組>空白組>中劑量組>低劑量組>模型組，結果表明，連續給予小鼠5周白術水提取液，可改善由于D-半乳糖致亞急性衰老伴隨的體質量減輕現象。

表2 小鼠5周內體質量變化表

小鼠內臟指數見表3。通過各組小鼠內臟指數表可以得出：模型組小鼠脾臟指數、肝臟指數升高，通過解剖發現，模型組小鼠存在內臟粗糙、質地略硬、臟器淤血等情況，提示腹腔注射D-半乳糖可導致小鼠臟器的衰老。陽性藥組脾臟指數最高，其次為高劑量給藥組，較模型組具有顯著性差異(P<0.05)，提示給予小鼠白術水提取液可抵抗D-半乳糖導致的亞急性衰老與亞急性炎癥，提高機體抵抗力。

表3 小鼠內臟指數

3.2 白術對小鼠穿梭實驗行為學評價結果

各組小鼠主動逃避次數、被動逃避次數、無反應次數的行為學數據結果圖1～3，數學模型檢驗結果見表4。表明經過3 d的訓練，模型小鼠主動躲避次數增加幅度較小，提示給予小鼠D-半乳糖5周后，出現明顯的學習能力下降現象。穿梭實驗行為學研究結果表明：給予小鼠白術水提取液后可改善D-半乳糖致衰老小鼠學習能力下降與反應能力下降的現象。

表4 白術對衰老小鼠穿梭實驗學習記憶能力的影響次)

圖1 白術對衰老小鼠穿梭實驗主動躲避次數對比圖

圖2 白術對衰老小鼠穿梭實驗被動逃避次數對比圖

3.3 對衰老小鼠血清SOD活力測定結果

小鼠血清SOD活力影響數據及分析，見表5。結果表明：SOD活力測定結果，高劑量組略大于空白組且大于陽性藥組(P<0.01)，與模型組小鼠血清SOD活力相比具有極顯著性差異；中劑量與低劑量組均大于模型組小鼠血清SOD活力(P<0.05)，具有顯著性差異，白術給藥提高小鼠SOD活性并呈現劑量依賴性影響，結果顯示白術可有效提高衰老小鼠血清SOD活力，提升小鼠血清超氧化物歧化酶活性。

表5 小鼠血清SOD活力測定

3.4 小鼠血清測定結果

小鼠血清GSH-Px活力影響數據及分析，見表6。GSH-Px活力測定結果顯示，空白組與陽性藥組小鼠血清GSH-Px活力相差不大，高劑量組略大于空白組與陽性藥組小鼠血清GSH-Px活力，且大于陽性藥組。高劑量組、中劑量組、陽性藥組、空白組與模型組小鼠血清GSH-Px活力相比具有極顯著性差異(P<0.01)；低劑量組小鼠血清GSH-Px活力大于造模組(P<0.05)，具有顯著性差異，提示白術水提取液可有效提高小鼠血清GSH-Px活力，提升谷胱甘肽過氧化物酶活性。

表6 小鼠血清GSH-Px活力測定

3.5 小鼠血清CAT活力測定結果

小鼠血清CAT活力影響數據及分析，見表7。CAT活力測定結果顯示，高劑量組CAT活力大于空白組且大于陽性藥組小鼠血清CAT活力，高劑量組、中劑量組、陽性藥組、空白組小鼠與模型組小鼠血清CAT活力相比具有極顯著性差異(P<0.01)；低劑量組與模型組相比，CAT活力大于模型組，具有顯著性差異(P<0.05)，提示白術水提取液可有效提高小鼠血清CAT活力，提升過氧化氫酶活性。

表7 小鼠血清CAT活力測定

3.6 小鼠血清T-AOC活力測定結果

小鼠T-AOC活力影響數據及分析，見表8。各組T-AOC活力測定結果顯示，高劑量組T-AOC活力大于陽性藥組且大于空白組T-AOC活力，中劑量與低劑量組T-AOC活力均大于造模組。高劑量組、中劑量組、低劑量組、陽性藥組小鼠血清T-AOC活力與模型組相比，具有極顯著性差異(P<0.01)；空白組血清T-AOC活力大于模型組小鼠血清T-AOC活力，具有顯著性差異(P<0.05)，提示白術水提取液可有效提高小鼠血清T-AOC活力，提升總抗氧化能力。

表8 小鼠血清T-AOC活力測定

4 討論與小結

機體衰老過程涉及許多內外因素，活性氧自由基(ROS)是在衰老過程中最常見的內源性生化因子。生物體在生長過程中，ROS在機體內不斷積累，過量ROS搶奪細胞蛋白分子的電子，使蛋白質接上支鏈發生烷基化，導致細胞結構和功能的損傷。而機體相關抗氧化酶類如SOD、GSH-Px和CAT等活性的下降使機體清除自由基的能力下降。機體內脂褐素含量為衰老的客觀依據之一，其形成與脂質自由基有關，衰老生物體內血清脂質自由基水平顯著增高，組織內脂褐素含量增多。活性氧能與生物膜中不飽和脂肪酸形成過氧化脂質，引起神經元細胞損傷，導致機體功能下降，產生如阿爾茨海默病、帕金森病等相關衰老性疾病[18]。

D-半乳糖造成的動物衰老模型接近于自然衰老特征，是當前世界公認的應用衰老和腦老化動物模型。D-半乳糖在體內代謝能產生大量的ROS，是其導致衰老的一個重要機制，D-半乳糖可使其代謝產生的過量氧自由基導致過氧化產物MDA升高，氧自由基的過量積累也會使致腦組織中清除自由基酶類活性下降，實驗動物出現認知功能障礙[17]。

本實驗中小鼠亞急性衰老模型由腹腔注射D-半乳糖溶液的方法建立，同時進行給藥與造模共5周，給予陽性藥組小鼠抗壞血酸溶液。伴隨著造模時間的延長，模型組小鼠出現了便溏、食欲減退、行動不活躍、毛皮無光澤且掉毛的衰老現象，當給予白術水提取液時間逐漸延長，陽性藥組小鼠與給藥組小鼠的便溏得到了充分緩解，食欲增強，體質量增加，逐漸改善掉毛現象，毛皮逐漸變得順滑光澤。在行為學考察中，如圖1～圖3所示，經過3 d的訓練，模型小鼠主動躲避次數增加幅度較小，提示給予小鼠D-半乳糖5周后，出現明顯的學習能力下降現象，出現衰老認知功能障礙。給與高、中劑量白術藥物組及陽性藥物組的無反應次數較少(P<0.01)，而主動逃避次數較多(P<0.05)，結果表明白術可改善D-半乳糖致衰老導致的記憶減退與學習能力、反應能力下降，體現抗衰老作用。

圖3 白術對衰老小鼠穿梭實驗無反應次數對比圖

在模型動物抗氧化研究中，高劑量白術組小鼠血清中SOD活力略大于空白組與陽性藥組小鼠血清SOD，中劑量與低劑量小鼠血清SOD活力均大于模型組；空白組小鼠血清GSH-Px活力與陽性藥組活力相近，高劑量組小鼠血清GSH-Px活力略大于空白組與陽性藥組，且大于低性藥組，中劑量與低劑量組小鼠血清GSH-Px活力均大于造模組；高劑量組小鼠血清CAT活力大于空白組且大于陽性藥組小鼠血清CAT活力，中劑量與低劑量組小鼠血清CAT活力均大于造模組；高劑量組小鼠血清T-AOC活力大于陽性藥組且大于空白組小鼠血清T-AOC活力，中劑量與低劑量組小鼠血清T-AOC活力均大于造模組。抗氧化研究表明白術對D-半乳糖導致的亞急性衰老顯示出非常好抗氧化活性，可顯著提高機體SOD、GSH-Px、CAT及T-AOC活力，對抗ROS對機體細胞的損傷，從而改善模型小鼠的記憶等認知功能的障礙。

本研究對白術的改善學習記憶能力及抗衰老作用進行了初步研究，結果提示白術是通過清除機體內活性氧、抵抗氧化應激造成的機體損傷這一機制來發揮抗衰老作用。表明白術可通過提高機體抗氧化功能而改善D-半乳糖誘導的衰老模型小鼠的學習記憶等認知障礙。本研究為白術作為具有改善學習記憶能力的抗衰老藥物應用于臨床提供了重要的實驗數據。