復(fù)方梔子金花清熱瀉火藥理作用研究

孫延平，劉艷，劉源，劉宇萌，肖宗雨，趙東穎，楊炳友，匡海學(xué)

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江省中藥及 天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040)

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為“上火”是一種亞健康狀態(tài)，是受到氣候、飲食、情志、勞倦過度、不良生活習(xí)慣等因素的影響而產(chǎn)生的。近年來，出現(xiàn)“上火”狀態(tài)的患者數(shù)量呈增長勢態(tài)，如能及時(shí)進(jìn)行調(diào)理，可迅速解除“上火”的狀態(tài)，使身體達(dá)到新的平衡。但若“上火”的狀態(tài)持續(xù)存在，就有可能進(jìn)一步發(fā)展為臨床病癥[1]，在給生活帶來不便的同時(shí)也給身心造成一定的損害。復(fù)方梔子金花始載于《宣明論方》[2]，為經(jīng)典的清熱瀉火復(fù)方，由梔子、黃連、黃芩、黃柏、大黃、金銀花、知母、天花粉等組成，用于肺胃熱盛，口舌生瘡，牙齦腫痛，目赤眩暈，咽喉腫痛等癥[3-4]。然而復(fù)方梔子金花是如何發(fā)揮清熱瀉火的作用機(jī)制目前仍不明晰。本研究采用拘束應(yīng)激大鼠模型和小鼠耳腫脹模型，通過考察動物狀態(tài)、胸腺及脾臟指數(shù)，測定血清中ALT、TG、SOD、TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-6、IL-8的含量，肝組織中MDA、NO、XOD的含量和ORAC及血清中總抗氧化能力T-AOC，明確梔子金花清熱瀉火的作用，并初步明晰其可能的作用機(jī)制，為其傳統(tǒng)功效提供現(xiàn)代藥理學(xué)的科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

可見分光光度計(jì)(Thermo scientific公司)；酶標(biāo)儀VICTOR X3型(PerkinElmer公司)；水浴鍋HHS型(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)；離心機(jī)(Micro公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Buchi公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級雄性Wistar大鼠,體質(zhì)量(180±20)g和雄性KM小鼠,體質(zhì)量(20±2)g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號為SCXK(黑)2015001。實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)條件適應(yīng)飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑與藥品

梔子(北京同仁堂，批號18100361)、黃連(北京同仁堂，批號18903340)、黃芩(北京同仁堂，批號17120071)、黃柏(北京同仁堂，批號18230012)、大黃(北京同仁堂，批號17330014)、金銀花(北京同仁堂，批號17070428)、知母(北京同仁堂，批號18100041)、天花粉 (北京同仁堂，批號17070026)，ALT、MDA、NO、XOD、ORAC、T-AOC、TG、SOD、TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-6、IL-8試劑盒 (南京建成生物工程研究所)，生理鹽水 (哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)股份有限公司)，20%脂肪乳劑 (四川科倫藥業(yè)股份有限公司)，冰醋酸 (天津市富宇精細(xì)化工有限公司)，二甲苯 (上海江萊生物科技有限公司)，阿司匹林 (南京白敬宇制藥有限責(zé)任公司)。

2 方法

2.1 對拘束應(yīng)激大鼠模型的影響

2.1.1 藥品制備

復(fù)方梔子金花提取物的制備：根據(jù)2015版《中華人民共和國藥典》中梔子金花丸復(fù)方比例稱取各味藥，44倍量29%乙醇，回流提取3次，每次3 h，合并提取液，濃縮至無醇味，冷凍干燥即得。

2.1.2 造模與給藥

采用拘束應(yīng)激大鼠模型模擬機(jī)體“上火”狀態(tài)[5]。拘束應(yīng)激模型是以剝奪大鼠身體自由活動為模型，將大鼠置于拘束模型中，連續(xù)拘束21 d，每天拘束6 h(9:30—15:30)[6]。每天于造模前30 min給各組大鼠灌胃[7]。

將健康大鼠40只，隨機(jī)分成空白對照組，模型組，復(fù)方梔子金花低、中、高劑量組 (0.4 g/kg、0.8 g/kg、1.6 g/kg) 共5組，每組8只?？瞻讓φ战M和模型組均予以同體積生理鹽水。

2.1.3 樣品的收集

大鼠按1 mL/100 g尾靜脈注射10%脂肪乳劑生理鹽水稀釋液，35 min后腹腔注射10%戊巴比妥鈉麻醉，沿腹中線用無菌剪刀剖腹，取出肝臟、胸腺和脾臟，腹主動脈取血，靜置1 h后離心 (5 000 r/min，5 min)，取上清液即血清備用。

2.1.4 考察指標(biāo)

21 d后觀察大鼠體毛顏色、光澤度，精神狀態(tài)，體質(zhì)量變化等。第22天對大鼠尾靜脈注射10%脂肪乳劑，35 min后麻醉，麻醉后取胸腺和脾臟稱重，按照公式：免疫器官指數(shù)=[免疫器官重量(g)/大鼠體質(zhì)量(g)]×100%計(jì)算免疫器官指數(shù)[7]；取肝組織0.4 g，加入9倍體積生理鹽水，冰浴條件下研磨成10%勻漿，離心，按試劑盒法測定肝組織中過氧化脂質(zhì)NO、MDA、XOD、ORAC含量；并腹主動脈取血，靜置1 h后離心 (5 000r/min，5 min)，取上清液按試劑盒法測定血清中ALT、TG、SOD、GSH-PX、IL-2、IL-3的含量及總抗氧化能力T-AOC[8]。

2.2 對二甲苯誘導(dǎo)的小鼠耳腫脹模型的影響

2.2.1 樣品制備 同2.1.1。

2.2.2 造模與給藥

小鼠連續(xù)灌胃給藥7 d后，末次給藥30 min后，除空白組外，每只小鼠右耳廓兩面涂抹濃度50 μL 100%二甲苯致炎，左耳對照[9-10]。將健康雄性KM小鼠48只，隨機(jī)分成空白組，模型組，阿司匹林陽性對照組 (0.75 g/kg)，復(fù)方梔子金花低劑量組(0.3 g/kg)、中劑量組(0.6 g/kg)、高劑量組(1.2 g/kg)，共6組，每組8只?？瞻捉M和模型組均予以同體積的生理鹽水。

2.2.3 考察指標(biāo)

致炎后30 min，將小鼠脫臼處死，剪下左右兩耳片，用6 mm直徑打孔器，分別在同一部位打下圓耳片，用電子天平稱兩耳片的重量，腫脹度為兩耳片的重量差，耳片腫脹率計(jì)算公式如下：腫脹抑制率=(模型組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度)/模型組平均腫脹度×100%[11]；所得到的小鼠耳組織放入10%福爾馬林中固定，耳組織經(jīng)脫水、包埋、切片、脫蠟、尹紅-蘇木精(HE)染色，封固后將標(biāo)本置于顯微鏡下并選擇合適具有代表性的區(qū)域觀察拍照(20×)；致炎后1 h眼球取血，離心(3 000 r/min，5 min)，取上清液，按照試劑盒說明測試小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的含量。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 對拘束應(yīng)激大鼠狀態(tài)的影響

與空白組相比，模型組大鼠精神萎靡，毛發(fā)凌亂、干枯毛躁，灌胃和束縛時(shí)反抗劇烈，且體質(zhì)量增長緩慢。與模型組相比，復(fù)方梔子金花中、高各劑量組的大鼠精神狀態(tài)較好，體毛較整潔且光澤度好。

3.2 對拘束應(yīng)激大鼠免疫器官指數(shù)的影響

與空白組相比，模型組大鼠的脾臟和胸腺出現(xiàn)萎縮，脾臟指數(shù)具有顯著性差異(P<0.05)，胸腺指數(shù)具有極顯著差異(P<0.01)；與模型組相比，梔子金花低、中、高劑量組可以顯著提高大鼠脾臟指數(shù)(P<0.05)；梔子金花高劑量組可以顯著提高大鼠胸腺指數(shù)(P<0.05)，結(jié)果見表1。

表1 梔子金花對拘束應(yīng)激大鼠免疫器官指數(shù)的影響

3.3 對拘束應(yīng)激大鼠肝組織中NO、MDA、XOD、ORAC含量和血清ALT、T-AOC、IL-2、IL-3和TG清除率含量的影響

與空白組相比，模型組大鼠肝組織中NO、MDA、XOD和血清ALT的含量、TG清除率明顯增高(P<0.01)，與模型組相比，梔子金花中、高劑量組可以極顯著降低大鼠肝組織中NO、MDA、XOD和血清ALT、TG的含量(P<0.01)；與空白組相比，模型組大鼠肝組織中ORAC和血清T-AOC、IL-2、IL-3降低，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，梔子金花中、高劑量組可以顯著提高ORAC、T-AOC、IL-2和IL-3(P<0.05)，結(jié)果見表2和3。

表2 梔子金花對拘束應(yīng)激大鼠肝組織中NO、MDA、XOD、ORAC的影響

3.4 對小鼠耳腫脹度的影響

如表4所示，與空白組相比，模型組局部給予二甲苯后，小鼠的耳腫脹度具有極顯著差異(P<0.01)，表明造模成功；給藥后，與模型組比較，陽性藥組能夠明顯降低小鼠耳腫脹度，腫脹抑制率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，復(fù)方梔子金花中、高劑量組能夠降低小鼠的耳腫脹度，且腫脹抑制率具有顯著性差異(P<0.05)。

3.5 對耳腫脹小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8含量的影響

與空白組相比，模型組小鼠血清中TNF-α的含量增高(P<0.05)，IL-1β、IL-6、IL-8的含量明顯增高(P<0.01)；與模型組相比，陽性藥組能夠顯著降低小鼠血清中TNF-α、IL-8的含量(P<0.05)和IL-1β的含量(P<0.01)，梔子金花中、高劑量組能夠不同程度地降低小鼠血清中TNF-α、IL-8、IL-1β和IL-6的含量(P<0.01，P<0.05)，結(jié)果見表4。

表3 梔子金花對拘束應(yīng)激大鼠血清中ATL、T-AOC、IL-2、IL-3、TG的影響

表4 復(fù)方梔子金花對二甲苯誘導(dǎo)小鼠耳腫脹度的影響

3.6 對小鼠腫脹耳組織形態(tài)學(xué)的影響

蘇木精和伊紅對小鼠耳組織染色(HE)，觀察各組小鼠耳組織的炎癥水腫和淋巴細(xì)胞浸潤程度。如圖1中HE染色結(jié)果所示，與正常組小鼠耳組織相比(圖1a)，給予二甲苯刺激的小鼠耳組織有明顯的水腫、充血、肌肉松散和淋巴細(xì)胞浸潤現(xiàn)象(圖1b)。與模型組相比，陽性藥組、復(fù)方梔子金花低、中、高劑量組(圖1c～f)能夠改善小鼠耳組織的水腫和淋巴細(xì)胞浸潤現(xiàn)象。

注:a,正常組;b,模型組;c,陽性藥組;d,低劑量組;e,中劑量組;f,高劑量組。圖1 二甲苯誘導(dǎo)的小鼠耳組織的HE染色(×400)

4 討論

“上火”是一種應(yīng)激性生理反應(yīng)，是機(jī)體受到應(yīng)激因素刺激引起的一種穩(wěn)定及維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的適應(yīng)能力，從“上火”到形成疾病是一種包含中樞、內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)的應(yīng)激負(fù)荷反應(yīng)過程。當(dāng)機(jī)體處于應(yīng)激負(fù)荷時(shí)，體內(nèi)活性氧自由基生成增加，破壞脂肪酸鏈和細(xì)胞膜完整性，使胞漿內(nèi)ALT滲出[12]，過量生成的NO可以與超氧陰離子直接或間接作用產(chǎn)生過氧化亞硝酸鹽，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，生成脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA。同時(shí)，當(dāng)機(jī)體受到外界刺激，巨噬細(xì)胞便會釋放出多種與炎癥和免疫應(yīng)答密切相關(guān)的細(xì)胞因子，例如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等[13]。本實(shí)驗(yàn)首次采用拘束應(yīng)激大鼠模型和二甲苯誘導(dǎo)的小鼠耳腫脹模型，考察復(fù)方梔子金花清熱瀉火功效的藥理學(xué)作用及其作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，復(fù)方梔子金花可以明顯抑制拘束應(yīng)激所致的免疫器官指數(shù)的降低，降低拘束應(yīng)激大鼠ALT、NO、MDA的含量，顯著提高其T-AOC、ORAC指數(shù)、TG清除率、GSH-PX活力和IL-2含量，改善二甲苯誘導(dǎo)的小鼠耳腫脹度，顯著降低血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的含量。

綜上所述，復(fù)方梔子金花發(fā)揮清熱瀉火的藥理作用機(jī)制可能是與改善脂代謝紊亂、緩解氧化應(yīng)激狀態(tài)以及降低炎癥反應(yīng)等相關(guān)。該研究不僅為復(fù)方梔子金花的作用機(jī)制、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、質(zhì)量評價(jià)等進(jìn)一步研究提供了理論依據(jù)，也為“上火”相關(guān)發(fā)生機(jī)制的深入研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。