基于網絡藥理學方法的加味黃芪赤風湯治療IgA 腎病作用機制的研究

馬思佳 趙明明 常美瑩 余 怡 王如夢 張 昱

中國中醫科學院西苑醫院腎病科，北京 100091

IgA 腎病是世界范圍內最常見的腎小球腎炎，以系膜區沉積免疫球蛋白A（IgA）為主要特點[1]。該病的發病機制較為復雜，現階段仍不十分明確，因此找出最佳治療方法是一個重大挑戰。目前，IgA 腎病仍然是導致終末期腎病的主要原因之一[2-4]。既往臨床上治療IgA 腎病多會應用免疫抑制療法，但近來有研究發現，對于正在進行綜合支持治療的，以中度蛋白尿和慢性腎臟疾病1～3 期為特征的IgA 腎病患者，采用增加免疫抑制的療法并沒有益處[1]。大量使用免疫抑制劑及激素雖在一定程度上可改善患者的癥狀，但均不足以阻斷或逆轉其病理發展，且存在容易產生耐藥性，出現股骨頭壞死、痤瘡、脫發等副作用，加重患者不適感等弊端。而中醫藥在長期的臨床實踐基礎上積累了不少治療經驗，經過研究證實，可有效改善患者癥狀，延緩腎臟病進展[5]。具有副作用小、易于接受的優勢。因此，臨床上許多患者經西藥治療后效果欠佳，多采用中藥復方進行輔助治療，以增強效果。

加味黃芪赤風湯是中國中醫科學院西苑醫院（以下簡稱“我院”）腎病科張昱教授及其團隊，通過長期的臨床運用，對中醫藥防治IgA 腎病進行觀察、總結及研究所取得的成果，是基于該病“虛-風-瘀-毒”的病機，在清代醫家王清任《醫林改錯》所載黃芪赤風湯的基礎上加味而成，主要由生黃芪、赤芍、防風、金櫻子、芡實、穿山龍、白花蛇舌草等組成[6]。臨床應用本方治療IgA 腎病常可收獲滿意效果[7]，本課題組前期采用真實世界研究的方法，收集2015 年1 月—2016 年12 月于我院門診就診的IgA 腎病并符合氣虛血瘀癥的患者295 例，以加味黃芪赤風湯治療24 周后患者24 h蛋白尿水平及中醫癥狀積分較治療前下降，差異有高度統計學意義（P ＜0.01），總有效率達77%[7]。

中藥具有多成分、多靶點的作用特點，因此在研究中藥及其復方治療某些疾病的作用機制時，難度會大大增加，而網絡藥理學的出現則在一定程度上為中藥作用機制的細化研究提供了幫助。為深入挖掘加味黃芪赤風湯治療IgA 腎病的潛在生物學機制，本研究通過篩選加味黃芪赤風湯的活性成分，預測活性成分的生物靶點，構建活性成分-疾病-靶點相互作用網絡和IgA 腎病靶點蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡等，從整體性觀察加味黃芪赤風湯治療IgA 腎病的潛在生物學機制，探討其潛在的作用機制，分析其復雜網絡關系，為其臨床應用提供一定的理論依據[8]。

1 材料與方法

1.1 加味黃芪赤風湯活性成分收集與篩選

利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）將加味黃芪赤風湯中的主要組成藥物分別輸入TCMSP 進行成分檢索，以口服生物利用度（OB）值≥30%、藥物相似性（DL）值≥0.18 作為篩選條件，篩選出該方的活性成分。

1.2 加味黃芪赤風湯潛在作用靶點的預測

利用TCMSP 獲取篩選出的加味黃芪赤風湯的每個活性成分對應的潛在靶點信息，借助Uniprot數據庫除去沒有相應靶點的成分，然后應用Perl 軟件（V5.24.1）為篩選出的靶點添加基因名及規范靶點的基因名。

1.3 IgA 腎病相關靶點的獲取

在GeneCards 數據庫和人類孟德爾遺傳數據庫（OMIM）中以“IgA nephropathy”為關鍵詞檢索，得到有關IgA 腎病的相關靶點信息。

1.4 中藥-IgA 腎病靶點的構建

利用R 語言（V3.6.2）計算出加味黃芪赤風湯活性成分靶點和IgA 腎病交集的靶點，從而得到中藥復方-IgA 腎病的共同靶點，將映射結果以韋恩圖的形式繪制出來。

1.5 加味黃芪赤風湯活性成分-疾病-靶點調控網絡的構建

運用Perl 軟件將“1.1”項下獲得的加味黃芪赤風湯中的活性成分和“1.4”項下獲得的中藥復方-IgA 腎病靶點進行一一映射，借助Cytoscape 軟件（V3.7.0）進行繪圖，構建出加味黃芪赤風湯各中藥-有效成分網絡圖及加味黃芪赤風湯活性成分-疾病-靶點調控網絡圖。之后利用該軟件的分析功能以Degree 值作為拓撲分析的主要參考依據，篩選排名靠前的靶點作為核心靶標，從而繪制出核心靶點的柱狀圖。

1.6 構建中藥-IgA 腎病靶點蛋白的PPI 網絡

將篩選得到的中藥-IgA 腎病靶點蛋白以文本形式上傳至String 在線軟件，篩選條件種屬選擇為人類，進行PPI 網絡預測，保存相應結果文本文件及圖形。

1.7 GO 功能和KEGG 通路富集分析

借助R 語言軟件對得到的中藥-IgA 腎病靶點進行相應計算，得到相關的GO 功能和KEGG 通路富集分析，以P ＜0.05 為差異有統計學意義，繪制相應的柱狀圖和氣泡圖。

2 結果

2.1 加味黃芪赤風湯有效成分篩選匯總

在TCMSP 數據庫中根據OB、DL 值篩選后共得到了85個關于加味黃芪赤風湯的有效化學成分，其中7個來自白花蛇舌草，3個來自穿山龍，28個來自赤芍，18個來自防風，20個來自黃芪，7個來自金櫻子，2個來自芡實，排除重復部分，共45個活性成分。

2.2 中藥-IgA 腎病靶點構建的結果

在GeneCards數據庫中獲取到1252個潛在作用靶點，在OMIM 中獲取到31個潛在作用靶點，將兩者匯總后，利用R 語言軟件將疾病相關靶點與加味黃芪赤風湯有效活性成分靶點取交集，繪制出中藥-IgA腎病共同靶點的韋恩圖，其中95個為疾病與中藥復方重合作用的靶點，IgA 腎病相關靶點為1283個，加味黃芪赤風湯有效作用靶點為228個。見圖1。

圖1 加味黃芪赤風湯與IgA 腎病相關的韋恩圖

2.3 加味黃芪赤風湯活性成分-疾病-靶點網絡的構建

通過收集加味黃芪赤風湯活性成分的靶點和IgA腎病的相關靶點，在Cytoscape 中構建出該方成分-疾病-靶點的網絡圖，如圖2 所示，倒三角形代表中藥名稱，長方形代表加味黃芪赤風湯中各中藥具有的有效成分，成分和靶點之間的相互作用以邊表示。加味黃芪赤風湯活性成分-疾病-靶點網絡圖如圖3 所示，該網絡圖中共有141個節點與366 條邊，倒三角形節點代表加味黃芪赤風湯中有效成分，圓形節點代表IgA腎病與該復方共同作用的靶點。由圖3 可知，存在一個成分與多個靶點相交或多個成分與一個靶點相交的現象，證實了加味黃芪赤風湯是在多成分、多靶點的基礎上輔助治療IgA 腎病的。選取Cytoscape 中的Network-Analyzer 選項，對節點的Degree 值及相關參數進行網絡拓撲分析，找到了節點Degree 值排名前10 位的基因作為核心靶標，其中包括白蛋白（ALB），白細胞介素-6（IL-6），絲氨酸/蘇氨酸激酶1（AKT1），血管內皮生長因子A（VEGFA）等，以數字代表節點Degree 值，這些靶點可作為加味黃芪赤風湯治療IgA腎病的潛在靶點以進行進一步研究。見圖4。

圖2 加味黃芪赤風湯各中藥-有效成分網絡圖

圖3 加味黃芪赤風湯活性成分-疾病-靶點網絡圖

圖4 加味黃芪赤風湯活性成分-疾病-靶點網絡中Degree 值排名前10 的活性成分

2.4 交集基因編碼蛋白相互作用網絡圖的構建

在String 數據庫中導入加味黃芪赤風湯與IgA腎病的交集靶點，得到中藥-IgA 腎病交集靶蛋白的PPI 網絡圖，其中，節點表示蛋白，連線表示蛋白之間存在聯系。見圖5。

圖5 加味黃芪赤風湯治療IgA 腎病的蛋白質-蛋白質相互作用網絡圖

2.5 GO 功能富集分析

加味黃芪赤風湯治療IgA 腎病核心靶標的GO功能富集分析的柱狀圖見圖6（封四）。該復方治療IgA 腎病可能主要是通過細胞因子受體結合、抗氧化、抑制轉錄因子結合等過程實現的。

圖6 加味黃芪赤風湯治療IgA腎病的GO富集分析

2.6 KEGG 功能富集分析

加味黃芪赤風湯治療IgA 腎病的核心靶標KEGG 通路富集分析的氣泡圖見圖7（封四）。該復方主要是通過干預AGE-RAGE 信號通路、IL-17 信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路和人類巨細胞感染通路、HIF-1 信號通路等治療IgA 腎病的。

圖7 加味黃芪赤風湯治療lgA腎病的KEGG通路富集分析

3 討論

IgA 腎病最早由Berger 和Hinglais 于1968 年提出，是一種被定義為以IgA 在腎小球內沉積占主導地位的腎小球腎炎[9]。臨床發病以20～30 歲多見，亞洲發病率高于全球其他地區[10]。大量的IgA 與補體在腎內沉積，會引起腎小球系膜細胞增生、腎小球節段硬化或粘連、毛細血管內細胞增多、腎小管萎縮和腎間質纖維化等，從而進一步損傷腎臟功能[11]。越來越多的研究表明，大部分的IgA 患者最終會進展為腎衰竭。由于IgA 腎病的具體發病機制較為復雜，目前仍不明確，因此，如何降低蛋白尿，減輕腎臟負擔，改善病理損傷，延緩病情發展成為治療該疾病的首要任務和相關領域的研究熱門。

由于中藥復方成分、靶點、機制復雜的客觀難題，使得傳統藥理學方法很難從整體性的角度觀察和探討加味黃芪赤風湯的潛在生物學機制，尤其是相互關聯的生物分子網絡的調控[8]。通過某個特定靶點往往不能有效地干預或控制IgA 腎病的進程，而中藥復方的組合形式往往多種多樣，每一味藥物中含有的有效活性成分不同，具有多成分、多靶點、多通路的作用特點，在治療IgA 腎病這類由多種病理機制共同影響的疾病時，往往是重要的干預措施。黃芪赤風湯首載于清代王清任的《醫林改錯》，方中包含生黃芪、赤芍、防風三味藥，具有益氣通陽、活血行滯、祛風通絡的功效。張昱教授精研其方，認為該方與慢性腎病本虛標實，虛-風-瘀-毒的病因病機特點不謀而合，諸藥配伍共奏健脾補腎、益氣活血、祛風解毒之功，虛實兼顧，標本同調[12-13]。

本研究借助網絡藥理學相關平臺，應用生物信息學對加味黃芪赤風湯進行網絡構建，探究加味黃芪赤風湯治療IgA 腎病的作用機制。本研究共篩選出主要包括槲皮素、β-谷甾醇、黃芩苷元、山柰酚等在內的45個有效活性成分，其可能通過影響ALB、IL-6、AKT1、VEGFA等潛在靶點，發揮治療IgA 腎病的關鍵作用。后續通過IgA 腎病相關靶點的PPI 預測和GO 生物功能及KEGG 通路富集分析，發現該方可能主要通過AGE-RAGE 信號通路、前列腺癌通路、乙型肝炎通路、IL-17 信號通路等，干預磷酸酶結合、血紅素結合、細胞因子受體結合、細胞抗氧化、抑制轉錄因子結合等生物過程，從而發揮其保護腎臟功能，改善病理損傷等作用來治療IgA 腎病。

前期已有大量的臨床研究證實了加味黃芪赤風湯中的各類中藥有效成分可有效延緩IgA 腎病患者腎功能惡化，保護患者腎功能[14-16]。而加味黃芪赤風湯治療IgA 腎病的網絡藥理學分析結果也與之前眾多實驗的研究結果相契合。葉苗等[17]發現，應用槲皮素可使血清炎癥因子顯著降低，其可能通過抑制炎癥反應和緩解細胞凋亡起到保護腎臟，使其免受缺血再灌注損傷的作用。黃芩苷可有效改善糖尿病大鼠的腎功能，降低細胞外基質（ECM）沉積，修復損傷的腎小球足細胞并減輕局部的炎癥反應[18]，山奈酚[19]可有效抑制高糖引起的大鼠腎系膜細胞p38MAPK 蛋白的磷酸化，減少腎細胞膜細胞增殖。毛蕊異黃酮可保護腎小球，增加腎臟血液灌注量，改善腎臟血流動力，具有抗腎臟組織纖維化的作用[20]。有相關研究表明[21-23]，在伴有營養不良和炎癥的終末期腎病患者中，炎癥的發生可能于激活AGE-RAGE 信號通路后，導致血清可溶性黏附分子水平升高有關。此外，VEGF 在新生血管生成和血管高通透性中也起著重要作用，其不但會使局部新生血管內皮增生，還參與局部氧化應激反應及炎癥反應，破壞腎小管上皮細胞的完整性，使腎小管上皮細胞的重吸收功能受損，導致患者出現不同程度的電解質紊亂[24-26]。IL-17 是具有較強促炎作用的物質，可以誘導其他細胞因子，促進炎癥細胞募集，促進T 細胞浸潤，誘導炎癥反應發生，加重腎組織損傷。有研究表明IL-17 參與了IgA 腎病的發病過程[27]，患者腎小管間質及外周血中IL-17 表達增高，并與臨床及病理預后指標密切相關，提示IL-17 可能是參與IgA 腎病發病及進展的因素之一。芍藥苷可以作用于TNF 信號通路，有抑制炎癥反應及抵抗細胞壞死和纖維化的作用[28]，且其還具有降低IL-17 在人體內表達的作用[29]。人巨細胞病毒、腺病毒、乙型肝炎病毒感染在IgA 腎病的發生與發展過程中都發揮著重要的作用。馮曉麗[30]發現人巨細胞病毒多表達于腎小球及腎小管；腎小管、腎小球間質破壞程度與人巨細胞病毒抗原表達水平變化呈正相關；乙型肝炎病毒在腎小管上皮細胞內的表達水平較高，也有微量表達于腎間質、腎小球內。人巨細胞病毒感染會下調內皮細胞和細胞滋養層的金屬蛋白酶-9（MMP-9）活性，特異性地降低MMP-9 的表達和活性[31]。在IgA 腎病中，MMP-9在系膜增殖性腎小球和間質血管壁的表達均明顯增多，導致腎小球結構過度重塑，使ECM 過度聚積，形成蛋白尿，加重腎臟組織損傷，這可能是影響IgA 腎病進展的因素之一[32]。

綜上所述，本研究采用網絡藥理學的方法，初步研究了加味黃芪赤風湯治療IgA 腎病的作用機制，主要是發揮其多成分、多靶點、多通路的方式，協同作用，保護腎臟功能，延緩病理損傷。為后續進一步研究加味黃芪赤風湯輔助治療IgA 腎病的作用機制奠定了研究基礎，為臨床上合理應用加味黃芪赤風湯提供了理論支持，具有重大意義。但是其具體的有效成分與詳細的作用機制還有待于更深入、更細化的挖掘與討論，并需要進行相關實驗佐證。