HPLC 法測定弩藥液中5個成分的含量

昝芳芳 崔 瑾

1.貴州中醫藥大學研究生院，貴州貴陽 550002；2.貴州中醫藥大學第一附屬醫院針灸科，貴州貴陽 550002

弩藥液是傳統苗醫外治法中常用的外用藥物之一，由嗟尚（大血藤）50 g、斗珍空（透骨香）50 g、嘎八叉賒（黑骨藤）30 g、包家利幼（生草烏）20 g、嘎炯豆丟勞（白龍須）15 g 組成，具有祛風除濕、舒筋活絡、散瘀止痛的功效[1-3]。常搭配針具使用，由針具和弩藥液結合成弩藥針療法，在苗族民間主要治療風類疾病，現代臨床中廣泛應用于膝骨性關節炎、腰椎間盤突出癥、頸椎病等痛癥的治療[4-7]。多年來，經苗族人民和現代臨床不斷驗證，該療法具有極其顯著的臨床作用，操作簡單，安全性較高[8-12]。劉向陽[13]通過急性毒理試驗，證明了弩藥液經皮給藥對動物的急性毒性小，通過鎮痛抗炎試驗得出弩藥液能顯著提高小鼠的痛閾，具有明顯的鎮痛效果，但是它的藥理作用機制尚未闡明。目前苗醫弩藥針的研究現狀僅停留于臨床研究，弩藥液的藥理研究少之又少，其有效成分的含量測定方法亦少見。故本實驗建立高效液相色譜法（HPLC）測定弩藥液中5個具有抗炎鎮痛作用活性成分的含量方法，為弩藥液的臨床療效提供理論依據。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀LC-2030C 3D（日本島津）；十萬分之一電子天平（AUW120D，日本島津）；高速離心機（TGL-16B，上海安亭科學儀器廠）；超聲波清洗機（SB25-12DTD，寧波新芝生物科技股份有限公司）。

弩藥材購于貴陽市萬東花鳥市場，經貴州中醫藥大學孫慶文教授鑒定為正品。綠原酸對照品（批號：110753-201817，純度≥98%）購于中國食品藥品檢定研究院；八角楓堿對照品（批號：DST190715-176，純度≥98%）、兒茶素對照品（批號：DST190628-001，純度≥98%）、新烏頭堿對照品（批號：DST190613-025，純度≥98%）、次烏頭堿對照品（批號：DST190307-058，純度≥99%）均購自成都德思特生物技術有限公司。乙腈（色譜純，Tedia 公司），磷酸（色譜純，科密歐化學試劑有限公司），其余均為分析純，水為純凈水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

2.1.1 八角楓堿、兒茶素、綠原酸 色譜柱：Agilent 5 TC-C18（2）（250.0 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（C）-0.2%磷酸水溶液（A），梯度洗脫：0～25 min，5.0%C；25～35 min，5.0%～8.5%C；35～50 min，8.5%～8.8%C；50～60 min，8.8%～9.0%C；流速1.0 mL/min；檢測波長：258 nm；柱溫25℃；進樣量10 μL。

2.1.2 新烏頭堿、次烏頭堿 色譜柱、流動相與“2.1.1”項相同，梯度洗脫：0～10 min，28%C；10～25 min，28%～33%C；25～35 min，33%～37%C；35～40 min，37%～40%C；流速為1.0 mL/min；檢測波長：235 nm；柱溫30℃；進樣量10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液 將藥材切片放置1500 mL 玻璃容器內，加入50 度白酒1000 mL 密封，常溫下浸泡14 d，浸泡過程中需每日輕輕搖蕩1～2 次，待浸泡14 d 后，過濾出藥液，棄去藥渣，該原液需密封靜置3 d，再過濾，裝瓶，密封避光常溫下儲存備用。精密抽取弩藥液2 mL，置于10 mL 容量瓶中，甲醇定容，搖勻，過濾，即得。

2.2.2 對照品溶液 精密稱取各對照品適量，置于10 mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，過0.22 μm 微孔濾膜，即得含有八角楓堿6.294 μg/mL、兒茶素58.086 μg/mL、綠原酸17.900 μg/mL、新烏頭堿6.018 μg/mL、次烏頭堿2.890 μg/mL 的混合對照品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液 按“2.2.1”項下方法制備6 份分別缺大血藤、透骨香、黑骨藤、生草烏、白龍須、黑骨藤與大血藤的陰性樣品溶液，過濾，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性試驗 精密吸取供試品溶液、混合對照品溶液、陰性樣品溶液各10 μL，按“2.1”項下色譜條件測定，結果見圖1～2。

圖1 八角楓堿、兒茶素、綠原酸HPLC 圖

圖2 新烏頭堿、次烏頭堿HPLC 圖

2.3.2 線性關系考察 分別精密吸取混合對照品溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mL 至10 mL 量瓶，甲醇定容至刻度，搖勻，即得一系列濃度的對照品溶液。按“2.1”項色譜條件測定，記錄峰面積。以對照品的質量濃度（μg/mL）為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得到回歸方程及相關系數，結果見表1。

表1 各成分線性關系

2.3.3 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液各10 μL，連續進樣6 次，記錄峰面積。結果八角楓堿、兒茶素、綠原酸、新烏頭堿、次烏頭堿峰面積的RSD 分別為0.929%、0.569%、0.472%、0.647%、0.481%，可見儀器精密度良好。

2.3.4 穩定性試驗 取上述供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h 按“2.1”項下色譜條件測定。記錄八角楓堿、兒茶素、綠原酸、新烏頭堿和次烏頭堿的峰面積，RSD 分別是2.662%、0.650%、1.147%、1.367%、1.165%，提示供試品溶液在24 h 內穩定。

2.3.5 重復性試驗 取同一批次購買的弩藥材，按供試品溶液制備方法平行制備6 份，進樣測定。結果八角楓堿、兒茶素、綠原酸、新烏頭堿、次烏頭堿平均含量分別為2.195、3.713、3.718、1.669、1.121 mg/g，RSD 分別為1.402%、1.770%、1.461%、1.542%、1.421%，提示該方法重復性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 精準吸取已知含量的同一批次弩藥液6 份，每份1 mL，置于10 mL 容量瓶中，分別精密加入適量的八角楓堿、兒茶素、綠原酸、新烏頭堿、次烏頭堿對照品溶液，搖勻，過0.22 μm 微孔濾膜，進樣測定，計算回收率及RSD，結果見表2。

表2 加樣回收率試驗結果（n=6）

2.3.7 含量測定 取6 批弩藥材，按“2.2.1”項下方法制備弩藥液，再按“2.1”項下色譜條件測定。測得峰面積按標準曲線法計算出6 批次藥材中5個化學成分的含量，結果見表3。

表3 弩藥液中5個成分的含量（mg/g，n=6）

3 討論

本課題組在前期大量的臨床研究中發現弩藥針療法治療膝骨性關節炎具有極其顯著的臨床療效[14-17]，除針具的物理促滲作用外，弩藥液有重要的作用。黑骨藤、大血藤屬于藤類植物，均含有黃酮、皂苷、酚酸類化學成分，現代研究表明具有一定的抗炎、抑菌、抗氧化作用[18-20]。據文獻報道白龍須、生草烏均含有生物堿、黃酮、皂苷等化學成分，經藥理學研究證明具有鎮痛、抗炎、抗腫瘤等作用，而烏頭屬植物中二萜類生物堿的生理活性顯著，是最主要的特征性化學成分[21-25]。故本實驗篩選了生物堿類、酚酸類及黃酮類成分作為弩藥液的指標性成分具有可行性。

本研究建立了弩藥液中八角楓堿、綠原酸、新烏頭堿等5種有效成分的含量測定方法，選取了弩藥方中含量較高且與臨床藥效緊密聯系的成分作為指標性成分。該方法操作簡便，快速高效，靈敏度高，干擾性少，結果準確可靠，可用于弩藥液的含量測定，能為臨床用藥的安全性和有效性提供理論支撐。