blaCTX-M型雞大腸桿菌中mcr-1的分子流行病學(xué)分析

李文婭,賈雅婷,李垠樹(shù),丁海峰,孫華潤(rùn),胡功政,苑 麗

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

mcr基因是質(zhì)粒介導(dǎo)的細(xì)菌對(duì)多黏菌素類(lèi)藥物產(chǎn)生耐藥的重要機(jī)制之一,其可通過(guò)IncI、IncX 和IncH 等流行性接合型質(zhì)粒以及可移動(dòng)元件進(jìn)行快速水平轉(zhuǎn)移,因而引起了國(guó)際上的廣泛關(guān)注[1]。自2015年華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉健華團(tuán)隊(duì)首次在腸桿菌科細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)mcr-1以來(lái),美國(guó)、丹麥、泰國(guó)、法國(guó)、英國(guó)、加拿大、德國(guó)等全球超過(guò)50個(gè)國(guó)家相繼發(fā)現(xiàn)了mcr-1～mcr-10基因[2-4]。mcr-1的檢出來(lái)源豐富,不僅包括人和動(dòng)物,同時(shí)也包括肉食品、水、蔬菜、牛乳等樣品[5-7],說(shuō)明mcr-1基因已廣泛存在于臨床腸桿菌科細(xì)菌中。

blaCTX-M型是產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases, ESBLs)腸桿菌科細(xì)菌中最常見(jiàn)的基因型之一。近年來(lái),blaCTX-M型ESBLs在人源及食品動(dòng)物源分離菌中的檢出率急劇升高。blaCTX-M常通過(guò)IncF、IncI、IncN、IncX和IncHI等接合型質(zhì)粒[8,9]或ISEcp1、IS26 和IS903等插入序列[10-12]在菌屬間進(jìn)行水平傳播。

近年來(lái),在腸桿菌科細(xì)菌中同時(shí)檢出blaCTX-M和mcr-1基因的報(bào)道很多[7,13],但有關(guān)兩者接合轉(zhuǎn)移相關(guān)性的研究較少。本試驗(yàn)通過(guò)分析不同年代blaCTX-M型雞源大腸桿菌中黏菌素的耐藥及兩者接合情況,研究了blaCTX-M和mcr-1的傳播規(guī)律,旨在為控制mcr-1在獸醫(yī)臨床上的進(jìn)一步傳播提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

供試菌株為本實(shí)驗(yàn)室在2007年、2012年和2016年三個(gè)不同時(shí)期分離保存的162株攜帶blaCTX-M型ESBLs的雞大腸桿菌；大腸埃希菌ATCC25922(購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保存中心)作為質(zhì)控菌；大腸埃希菌C600作為接合試驗(yàn)的受體菌。

1.2 菌株對(duì)黏菌素的敏感性分析

對(duì)3個(gè)不同時(shí)期分離保存的菌株進(jìn)行復(fù)蘇純化,采用臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)[14]推薦的微量肉湯稀釋法測(cè)定各受試菌株對(duì)黏菌素的最小抑菌濃度(Minimal Inhibit Concentration, MIC),本試驗(yàn)重復(fù)3次。判斷標(biāo)準(zhǔn): MIC<2 μg/mL表現(xiàn)為敏感； MIC≥2 μg/mL表現(xiàn)為耐藥。

1.3 mcr-1的檢測(cè)

采用煮沸法提取各受試菌株的基因組DNA,并以其為模板進(jìn)行mcr-1的PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳、染色后,用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照,并對(duì)陽(yáng)性PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序和比對(duì)。

1.4 質(zhì)粒接合試驗(yàn)

取新鮮培養(yǎng)的供體菌和受體菌，將其接種于LB肉湯中,在37 ℃搖床中培養(yǎng)5～6 h；然后分別將其接種于含4 μg/mL頭孢噻肟和400 μg/mL利福平、2 μg/mL黏菌素和400 μg/mL利福平的麥康凱瓊脂培養(yǎng)基,在37 ℃下過(guò)夜培養(yǎng)。同時(shí),將受體菌和供體菌作為陰性對(duì)照。用無(wú)菌接種環(huán)挑取雙抗麥康凱平板上的透明單菌落,并采用PCR擴(kuò)增技術(shù)和微量肉湯稀釋法檢測(cè)各疑似接合子,觀察結(jié)果并計(jì)算接合頻率。挑出同時(shí)攜帶blaCTX-M和mcr-1的接合子及供體菌,將其blaCTX-M的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序比對(duì)，確定基因亞型,blaCTX-M-U參考Laura P等的方法[15]；blaCTX-M-1和blaCTX-M-9序列分別參考GeneBank號(hào)KY792888和AF252622。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌對(duì)黏菌素的敏感性

由分離菌對(duì)黏菌素的MIC分布結(jié)果(表1)可知：2007年分離保存的13株blaCTX-M型雞大腸桿菌均對(duì)黏菌素高度敏感,其MIC均不超過(guò)1 μg/mL；在2012年分離保存的66株雞大腸桿菌中，有6株(JD43、JD36、G44、G12、H23和G42)對(duì)黏菌素耐藥,耐藥率為9.1%；在2016年分離獲得的83株blaCTX-M型雞大腸桿菌中,有35株對(duì)黏菌素耐藥,耐藥率達(dá)42.2%。3個(gè)不同時(shí)期的分離菌對(duì)黏菌素的耐藥率差異極顯著(P=0.000<0.01),說(shuō)明隨著時(shí)間的推移,雞攜帶的blaCTX-M型大腸桿菌對(duì)黏菌素的耐藥性日益增強(qiáng),這與黏菌素在臨床中被人們推廣應(yīng)用的趨勢(shì)基本一致。41株對(duì)黏菌素耐藥的分離菌均攜帶有mcr-1,說(shuō)明mcr-1是對(duì)黏菌素耐藥的blaCTX-M型雞大腸桿菌中最主要的基因亞型。

2.2 質(zhì)粒接合試驗(yàn)結(jié)果

接合試驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)表2)顯示,不同篩選平板獲得的接合子有一定的差異。在含有頭孢噻肟和利福平的平板上共篩選獲得21株菌的接合子,其中有5株菌(G44、13、20、23和25)的接合子同時(shí)攜帶有mcr-1。在含有黏菌素和利福平的平板上共篩選獲得18株菌的接合子,有11株菌的接合子同時(shí)攜帶有blaCTX-M。這不僅說(shuō)明部分菌株的mcr-1和blaCTX-M可能位于同一接合型質(zhì)粒上,而且說(shuō)明攜帶blaCTX-M和mcr-1的質(zhì)粒在單一藥物(黏菌素或頭孢噻肟)的選擇性壓力下,也能實(shí)現(xiàn)同時(shí)水平轉(zhuǎn)移。

由表2可知：攜帶blaCTX-M的接合子共有27株,接合率為65.9%(27/41)，blaCTX-M的接合頻率范圍為(1.23×10-5)～(9.11×10-2);攜帶mcr-1的接合子有21株,接合率為51.2%(21/41),mcr-1的接合頻率范圍為(3.78×10-5)～(4.24×10-1)。上述結(jié)果表明兩種基因的接合頻率差異不明顯,且均易通過(guò)質(zhì)粒接合進(jìn)行菌屬間的水平轉(zhuǎn)移。

2.3 blaCTX-M亞型分析

對(duì)14株同時(shí)攜帶blaCTX-M和mcr-1的接合子及其供體菌進(jìn)行blaCTX-M的PCR擴(kuò)增，并測(cè)序確定亞型,結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知：在14株受體菌中,有10株攜帶1種亞型,且均屬于blaCTX-M-9亞群;有4株同時(shí)攜帶兩種亞型。blaCTX-M亞型包括blaCTX-M-14(7株)、blaCTX-M-27(2株)、blaCTX-M-65(5株)和blaCTX-M-79(4株),其中blaCTX-M-79亞型屬于blaCTX-M-1亞群,且分別與blaCTX-M-14或blaCTX-M-27同時(shí)存在于同一菌株中。相應(yīng)的接合子均僅檢出1種blaCTX-M亞型,且均為blaCTX-M-9亞群。說(shuō)明在相同的選擇性壓力條件下,blaCTX-M-9亞群的傳播速度可能較blaCTX-M-1亞群更快。

表1 黏菌素對(duì)分離菌的MIC分布

表2 從不同篩選平板上獲得的接合子

表3 14株原菌和接合子的基因亞型

3 討論

在早期黏菌素因腎毒性和神經(jīng)毒性而被禁用,但是近幾年來(lái),碳青霉烯類(lèi)耐藥菌的出現(xiàn)導(dǎo)致一些藥物不起作用,使得黏菌素又重新進(jìn)入了人們的視野。在2015年,我國(guó)學(xué)者首次報(bào)道了質(zhì)粒介導(dǎo)的黏菌素耐藥基因mcr-1[16],隨后mcr基因被頻繁檢出。在2018年,Wu等[18]調(diào)查了2008～2014年期間我國(guó)不同省份的821株雞源大腸桿菌,檢測(cè)出44株攜帶mcr-1的菌株。同年,Tong等通過(guò)檢測(cè)采集的豬糞便樣品發(fā)現(xiàn),mcr-1的攜帶率高達(dá)76.2%(457/600)[19]。在2019年,烏拉圭首次從病人血液、尿液和直腸拭子分離出攜帶mcr-1的大腸桿菌[17]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的推移,攜帶blaCTX-M型雞源大腸桿菌中對(duì)黏菌素耐藥的菌株明顯增加,耐藥率從2007年的0%增加至2016年的42.2%。

接合試驗(yàn)結(jié)果顯示,在單一藥物(頭孢噻肟或黏菌素)的選擇性壓力下,有部分菌株的mcr-1和blaCTX-M基因同時(shí)發(fā)生水平轉(zhuǎn)移。原因可能有二:一是可能部分菌株的兩種基因位于同一個(gè)質(zhì)粒上;二是這兩種基因盡管不在同一個(gè)質(zhì)粒上,但可能更易于同時(shí)水平轉(zhuǎn)移。Zhang等在2019年發(fā)現(xiàn)在單一頭孢噻肟的選擇性壓力下,mcr-1和blaCTX-M可同時(shí)發(fā)生轉(zhuǎn)移；但在黏菌素的單一選擇性壓力下,兩者不能實(shí)現(xiàn)同時(shí)轉(zhuǎn)移[20]。我們近期已初步發(fā)現(xiàn)當(dāng)某一臨床菌株同時(shí)含有兩個(gè)質(zhì)粒,即攜帶mcr-1基因的最常見(jiàn)質(zhì)粒IncI2和攜帶blaCTX-M的流行質(zhì)粒IncFⅡ時(shí),前者能明顯促進(jìn)后者的接合轉(zhuǎn)移。上述結(jié)果說(shuō)明要想有效遏制黏菌素耐藥菌的廣泛散播,單一控制黏菌素在飼料添加劑中的應(yīng)用是不夠的。

通過(guò)對(duì)14株原菌和接合子進(jìn)行blaCTX-M檢測(cè)發(fā)現(xiàn),有4株原菌同時(shí)攜帶blaCTX-M-1和blaCTX-M-9兩種亞群,有10株原菌僅攜帶blaCTX-M-9亞群;但接合子均僅攜帶blaCTX-M-9亞群,推測(cè)blaCTX-M-9亞群較blaCTX-M-1亞群更易發(fā)生水平傳播。本研究結(jié)果與blaCTX-M各亞群在臨床大腸桿菌分離菌中的流行特征一致,即在亞洲地區(qū)blaCTX-M-9是流行的最主要亞群。在2019年,Xiao等[12]在50株大腸桿菌中檢測(cè)出blaCTX-Ms,其中blaCTX-M-9亞群(blaCTX-M-148株、blaCTX-M-273株、blaCTX-M-651株)檢出12株,成功接合10株,而blaCTX-M-1亞群只有2株(blaCTX-M-552株)。