巴什拜羊不同發育階段骨骼肌中miR-486靶基因的研究

張偉，王世銀，高莉，楊力偉，鄧雙義，劉曉娜，石國慶，甘尚權

巴什拜羊不同發育階段骨骼肌中miR-486靶基因的研究

張偉1,2，王世銀1，高莉1，楊力偉1，鄧雙義1，劉曉娜1，石國慶2，甘尚權2

1新疆農業職業技術學院，新疆昌吉 831100；2新疆農墾科學院畜牧獸醫研究所/省部共建綿羊遺傳改良與健康養殖重點實驗室，新疆石河子 832000

【】為了深入挖掘巴什拜羊不同發育階段骨骼肌中miR-486的靶基因，為最終闡明巴什拜羊優良肉質性狀形成的分子調控機制奠定基礎，同時為巴什拜羊的持續選育提供理論依據。分別采集了巴什拜羊胎兒期40，50，60，80，100和120 d，以及出生當天，出生后30，60和90 d共計10個不同發育階段的骨骼肌組織，分別利用胎兒期6個階段的混合mRNA和出生后4個階段的混合mRNA構建了胎兒期和出生后骨骼肌中miR-486調控靶基因的cDNA文庫，并利用高通量測序技術對cDNA文庫中的靶基因信息進行了深入挖掘。在對所得候選靶基因功能分析的基礎上，選擇10個候選靶基因，使用qRT-PCR檢測其在巴什拜羊上述10個不同發育階段骨骼肌中表達量的變化，結合課題組前期獲得的miR-486在巴什拜羊不同發育階段骨骼肌中的表達規律，對其靶向調控關系及生物學功能進行初步驗證和分析。進而選擇其中的4個候選靶基因使用熒光素酶報告載體試驗和巴什拜羊骨骼肌衛星細胞中的靶向調控試驗最終確認其靶向調控關系。通過對兩個cDNA文庫高通量測序數據的分析，胎兒期和出生后分別獲得了123個和118個miR-486的靶基因，因其靶向調控關系未經實驗驗證，故暫稱為候選靶基因。其中有96個為兩個階段共表達的候選靶基因，其余27個和22個分別為胎兒期和出生后骨骼肌中特異表達的候選靶基因。GO和KEGG分析結果表明所得候選靶基因顯著富集于與肌肉分化和肌纖維發育相關的代謝和信號轉導通路，諸如PI3k-Akt、MAPK、Wnt、Adherens junction和Regulation of actin cytoskeleton等。qRT-PCR檢測結果表明所選10個候選靶基因在不同發育階段巴什拜羊骨骼肌中均有表達，但其表達變化規律有所不同。、、、、、和在胎兒期巴什拜羊骨骼肌中呈高表達，出生后其表達量顯著下調，而的表達量則呈相反的變化趨勢，和在胎兒期和出生后巴什拜羊骨骼肌中的表達量未見顯著變化。對其中4個候選靶基因的進一步試驗驗證，雙熒光素酶報告載體試驗結果表明，miR-486可以高效結合在其候選靶基因、、和的靶位點上，進而極顯著抑制其后螢火蟲熒光素酶的活性；巴什拜羊骨骼肌衛星細胞中的靶向調控試驗結果亦表明miR-486可以顯著下調上述4個候選靶基因的mRNA水平，抑制其生物學功能。所以可以確證在巴什拜羊骨骼肌中miR-486可以靶向調控、、和的表達。對巴什拜羊不同發育階段骨骼肌中miR-486的靶基因進行了深入挖掘，全面解析了miR-486及其靶基因在巴什拜羊骨骼肌發育過程中參與的生物學過程和信號通路，所得候選靶基因數據可靠性高，可為闡明巴什拜羊優良肉質性狀的分子調控機制奠定基礎。

巴什拜羊；miR-486；靶基因；骨骼肌；cDNA文庫

0 引言

【研究意義】巴什拜羊（Ovis aries）是我國一個優良的肉脂兼用型地方綿羊品種，以生產優質羔羊肉而著稱，原產于新疆塔城地區裕民縣，現主要分布在塔城地區的裕民縣、額敏縣和托里縣等地，2014年存欄量約150萬只[1]，該品種羊的養殖一直是當地牧民收入的主要來源。巴什拜羊素有貴族羊之稱，其優良的肉質性狀在國內外綿羊品種中亦不多見[2]。但是，近年來隨著人們健康意識的提高以及肉食品消費觀念的轉變，低脂肪羊肉的需求量在逐漸增加。巴什拜羊由于胴體脂肪含量較高[3]，已無法滿足市場的需求，亟需進行遺傳改良[4]。本研究對巴什拜羊不同發育階段骨骼肌中miR-486的靶基因進行深入研究，將為最終闡明巴什拜羊優良肉質性狀形成的分子調控機制，進而指導其科學選育奠定基礎。【前人研究進展】miRNA（microRNA）是一類小分子非編碼RNA，約為22個核苷酸大小，在骨骼肌的發育過程中發揮著重要的調控作用[5-6]。miR-486首先是從人胚胎肝組織中鑒定出來，在心肌和骨骼肌中高表達，Alexander等發現miR-486作為PTEN/AKT 途徑中重要的調節因子在抗肌萎縮蛋白缺陷型肌肉和杜氏肌肉營養不良癥中（duchenne muscular dystrophy, DMD）發揮著重要的作用[7]。miR-486在敲除小鼠的骨骼肌中顯著上調，體外過表達miR-486 可以誘導肌管肥大，抑制miR-486可以降低AKT 的活性，說明miR-486是骨骼肌中連接MSTN信號和IGF-1/Akt/ mTOR途徑重要的中間調控因子[8]。目前對miR-486的研究主要集中在人類肌肉相關疾病方面，在綿羊等家畜肌肉發育中的相關研究鮮有報道。【本研究切入點】本課題組前期利用高通量測序技術對巴什拜羊不同發育階段骨骼肌中miRNA的差異表達進行了研究，發現miR-486在出生后巴什拜羊骨骼肌中的表達量極顯著上調，為胎兒期的100多倍[9]。進一步研究表明miR-486在巴什拜羊100 d胎兒骨骼肌和心肌中的表達量顯著高于胃腸組織（＜0.05），而極顯著高于肝、脾和肺等其他組織（＜0.01）[10]，提示miR-486在巴什拜羊骨骼肌發育中可能發揮著重要作用。miRNA通過調控其靶基因而發揮其生物學功能，但miR-486在巴什拜羊骨骼肌中的靶基因尚不清楚。【擬解決的關鍵問題】本研究通過構建miR-486靶基因cDNA文庫結合高通量測序，對巴什拜羊胎兒期和出生后骨骼肌中miR-486的靶基因進行深入研究，并對部分靶基因進行試驗驗證，將為闡明miR-486在巴什拜羊骨骼肌發育過程中的調控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及骨骼肌樣品采集

試驗用巴什拜羊購自裕民縣巴什拜種羊繁育中心。試驗羊的飼養、前期處理及樣品采集工作于2017年8月至2018年2月在新疆雪羚生物科技有限責任公司種羊場完成。

選擇20只體況良好，胎次在2—3胎，來自不同家系的巴什拜羊（Ovis aries）母羊，統一進行飼養管理。15 d后進行同期發情和人工授精處理。從輸精后的第15天開始每天分別在早上10點和下午6點觀察母羊的發情狀態，剔除返情的母羊，結合B超檢查最終選擇10只妊娠母羊進入后續實驗。分別在妊娠期的第40，50，60，80，100和120天屠宰1頭妊娠母羊，采集胎兒的四肢骨骼肌組織并投入液氮速凍，然后轉入-80 ℃冰箱保存備用。其余4只母羊繼續飼養至羔羊出生，并于出生當天，及出生后30，60和90 d屠宰羔羊，按照上述方法采集和保存骨骼肌組織。

1.2 RNA提取及基因組DNA消化

參照TRIzol（Invitrogen, USA）說明從上述骨骼肌樣品中提取總RNA，使用Bioanalyzer 2100（Agilent, Germany）評估總RNA完整性。參照Oligotex?mRNA純化試劑盒（Promega, USA）的說明，從總RNA中分離純化mRNA，然后使用RNase-free DNase I（Ambion Inc., USA）消化所得mRNA，以去除微量基因組DNA污染，避免其對cDNA文庫質量的影響。

1.3 cDNA文庫的構建和高通量測序

將胚胎期6個階段骨骼肌mRNA混合為一個樣品，出生后4個階段骨骼肌mRNA混合為另一個樣品，參照甘尚權等[11]建立的方法分別構建胎兒期和出生后巴什拜羊骨骼肌miR-486的靶基因cDNA文庫。現以胎兒期cDNA文庫為例，簡要說明建庫的過程。將胎兒期骨骼肌mRNA混合樣品分為兩份，分別用反轉錄引物A（5￠-3￠: CTCGACTGAGTTGCCG，斜體加粗堿基為巢式引物的上游引物序列，下劃線所示堿基為miR-486與其靶基因結合的種子序列）和B（5￠-3￠: AACGCG+oligodT20，下劃線所示堿基為巢式引物的下游引物互補序列），參照PrimeScript? Double Strand cDNA Synthesis Kit（TAKARA）試劑盒操作說明合成cDNA雙鏈，分別稱之為A庫和B庫。由于用于構建A庫的反轉錄引物3￠末端的10個堿基為miR-486與其靶基因結合的種子序列，只有該序列與mRNA上的序列互補結合，才能完成反轉錄，所以A庫中的cDNA應主要為miR-486的靶基因序列；用于構建B庫的反轉錄引物3￠末端是20個oligodT，所以B庫中的cDNA應是相應骨骼肌組織中所有表達功能基因序列的集合。使用酚/氯仿法抽提純化A庫和B庫的cDNA雙鏈后將二者等體積混合，95 ℃變性5 min，然后50 ℃保溫5 min形成A庫和B庫的雜交cDNA文庫。最后以雜交的cDNA為模板，使用巢式引物（上游引物5￠-3￠: TGAGTCGGCAACTCAGTCGAG和下游引物5￠-3￠: AGCGCAGCTCATCATCTGCAT）進行巢式PCR擴增。此時，只有A庫中miR-486的靶基因鏈與其在B庫中對應的互補鏈形成的雜交雙鏈同時帶有上下游巢式引物，所以在巢式PCR反應中可以被指數級擴增。而其他形式的雜交雙鏈只帶有上游或者下游巢式引物，在巢式PCR反應中只能被線性擴增。所以，經巢式PCR擴增后的產物，絕大部分為miR-486的靶基因序列，本研究中稱之為miR-486靶基因cDNA文庫。將構建的兩個cDNA文庫分別采用Illumina HiSeq 3000測序平臺進行雙向高通量測序。

1.4 高通量測序數據處理

測序原始數據使用SOAPnuke過濾，除去接頭序列以及未知堿基超過10%和低質量堿基（Q≤10）超過50%的低質量reads。獲得的clean reads使用SOAPaligner和SOAP2以牛（v3.1）和綿羊（v3.1）基因組序列為參考進行拼接組裝和注釋。

1.5 候選靶基因序列篩選及分析

按照靶基因cDNA文庫建庫原理，所得miR-486靶基因序列應該含有反轉錄引物A的末端10堿基序列（GTCATGTCCT）。因此以該10堿基序列為種子序列對上述分析獲得的基因序列進行比對篩選，含有該序列的基因序列即為miR-486靶基因序列，由于所得靶基因尚未經過實驗驗證，存在一定數量的假陽性結果，所以暫時稱為候選靶基因。為了深入了解所得候選靶基因的生物學功能，利用David在線軟件進行基因本體論[12]（gene ontology, GO）（http://geneontology. org）分析，從細胞組分、生物學過程和分子功能3方面對其進行功能注釋，然后利用京都基因和基因組百科全書[13]（Kyoto encyclopedia of genes and genome, KEGG）數據庫（http://www.kegg.jp/kegg ）分析所得miR-486候選靶基因參與調控的信號通路，設置≤0.05為顯著性閾值。

1.6 部分候選靶基因在巴什拜羊不同發育階段骨骼肌中表達量檢測

在以上靶基因cDNA文庫測序結果分析的基礎上，查閱近年來骨骼肌發育相關信號通路的文獻報道，從靶基因cDNA文庫中選擇10個與骨骼肌生長發育調控密切相關的候選靶基因，以-actin為內參基因，以出生后第90天的表達量為對照，使用qRT-PCR對其在巴什拜羊不同發育階段骨骼肌中的表達量進行相對定量，并參照課題組前期檢測的miR-486的表達規律[10]，對10個候選靶基因與巴什拜羊骨骼肌發育的關聯性，及其與miR-486的靶向調控關系進行初步分析。10個候選靶基因及內參基因在Ensemble數據庫（http://asia.ensembl.org/index.html）中的登錄號及qRT-PCR引物信息見表1。引物使用oligo6.0設計，由生工生物工程（上海）有限公司合成。mRNA的反轉錄參照PrimeScript Ⅳ 1st strand cDNA Synthesis Mix（TAKARA）完成，qRT-PCR擴增采用20 μL體系：TB Green Premix ExⅡTli RNaseH Plus）（2×）（TAKARA, 大連）10 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各 0.8 μL，cDNA模板 2 μL，ddH2O 6.4 μL。擴增條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40個循環。擴增反應結束后以 0.1 ℃/s 的速度進行熔解曲線分析。qRT-PCR檢測由LightCycler 96（Roche, Germany）完成。

表1 10個候選靶基因qRT-PCR引物信息表

*登錄號指基因在Ensemble數據庫（http://asia.ensembl.org/index.html）中的Transcript ID

*Accession number means the transcript ID of gene in Ensemble database (http://asia.ensembl.org/index.html)

1.7 miR-486與部分候選靶基因靶向調控關系的驗證

由于通過構建靶基因文庫獲取的靶基因存在一定比例的假陽性結果，為了驗證上述靶基因文庫的可靠性，結合上述10個候選靶基因在巴什拜羊不同發育階段表達量的變化規律，以及課題組前期檢測到的miR-486的表達規律[10]，從上述10個候選靶基因中選擇、、和4個表達量與miR-486的表達量呈明顯負相關的候選靶基因作進一步驗證。

1.7.1 雙熒光素酶報告載體試驗 在候選靶基因序列上miR-486結合靶位點上下游約100 bp片段范圍設計PCR引物，以巴什拜羊基因組為模板PCR擴增獲得靶位點區域約200 bp大小的野生型片段，同時根據種子序列設計突變引物，與上述PCR引物進行重疊PCR對靶位點進行點突變，獲得靶位點處4個堿基突變的突變型片段。將野生型片段和突變型片段經I和dIII雙酶切后連入PGL4雙熒光素酶報告載體（Promega, USA），并使用雙酶切和測序確認載體構建的正確性。上述載體構建引物信息見表2。

表2 熒光素酶報告載體構建引物

用于載體構建引物序列中小寫字母為限制性內切酶I和dIII的切割序列及保護堿基；用于靶位點突變引物中小寫字母為致突變堿基

The bases in lowercase of vector construction primer were restriction enzyme cutting sites (italics and bold) and protective bases ofI anddIII restriction enzyme cutting sites and protective bases, the ones of mutating bind site primer were mutated bases of the miR-27b target site in MSTN 3-UTR

參照Lipofectamine 2000（Invitrogen, USA）的操作說明，將構建好的報告載體及miR-486 mimics（表3）分別轉入Hela細胞，培養48 h后裂解細胞，按照Dual-Luriferase Reporter Assay System（Promega, USA）的操作說明檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性。

1.7.2 骨骼肌衛星細胞中miR-486干擾表達試驗 檢索miRBase數據庫，根據其收錄的bta-miR-486序列（MIMAT0009329）設計其模擬物miR-486 mimics，抑制物miR-486 inhibitor及其陰性對照negative control（表3）并由上海吉瑪基因合成。擴大培養巴什拜羊骨骼肌衛星細胞（通過原代培養獲得），參照Lipofectamine 2000（Invitrogen, USA）的操作說明將miR-486 mimics，miR-486 mimics negative control，miR-486 inhibitor和miR-486 inhibitor negative control分別轉入骨骼肌衛星細胞，以不轉染任何試劑的細胞組作為空白對照。轉染后的細胞繼續培養至24、48和72 h時分別消化收集細胞，按照1.2所述方法提取總RNA，并按照1.6所述方法及引物檢測不同處理組骨骼肌衛星細胞中4個候選靶基因mRNA的水平。

表3 miR-486 mimics、miR-486 inhibitor及其陰性對照序列

1.8 數據分析

qRT-PCR結果采用2-△△Ct法進行計算，雙熒光素酶檢測結果采用螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性計算。試驗均重復3次，結果用“平均值±標準差”表示，使用SPSS13.0進行單因素方差分析，<0.05表示差異顯著，<0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 靶基因cDNA文庫高通量測序及分析

胎兒期和出生后miR-486靶基因cDNA文庫高通量測序分別得到6.21M和5.94M原始數據，剔除接頭序列以及低質量reads后分別獲得5.73M和5.42M的clean reads。進一步拼接組裝、剔除冗余序列后分別得到283條和276條Unigenes，平均序列長度分別為673 bp和681 bp。將胎兒期和出生后Unigenes序列進行blastn比對，發現分別有68和61個為胎兒期和出生后特異表達Unigenes，有215個為兩個時期的共表達Unigenes。

2.2 候選靶基因注釋及功能分析

按照靶基因cDNA文庫建庫原理，所得miR-486候選靶基因序列應該含有反轉錄引物A的末端10堿基序列（GTCATGTCCT）。因此以該10堿基序列為種子序列對上述分析獲得的Unigenes序列進行比對篩選，胎兒期和出生后分別獲得123個和118個符合條件的Unigenes，其中96個為兩個階段共表達Unigenes，其余27個和22個分別為胎兒期和出生后骨骼肌中特異表達的Unigenes。由于miR-486與所得Unigenes的靶向調控關系尚未經過試驗驗證，所以暫時稱之為miR-486的候選靶基因。

GO分析結果表明，胎兒期和出生后分別有96個和87個候選靶基因得到注釋信息，胎兒期的候選靶基因顯著富集于26個細胞組分條目，32個生物學過程條目和18個分子功能條目。出生后的候選靶基因顯著富集于20個細胞組分條目，36個生物學過程條目和23個分子功能條目，富集基因數前10的GO條目及富集于相應條目的候選靶基因占該階段檢測到候選靶基因的比例見圖1。

KEGG通路富集分析結果表明，胎兒期和出生后候選靶基因顯著富集于多個與肌肉發育相關的信號通路，如PI3k-Akt、MAPK、Wnt和Adherens junction等，提示miR-486可能通過調控一些與肌肉發育相關的基因及信號通路，在巴什拜羊骨骼肌發育調控中發揮著重要的作用。胎兒期和出生后候選靶基因顯著富集的前20個信號通路見圖2。

2.3 miR-486及其部分候選靶基因在巴什拜羊不同發育階段骨骼肌中的表達規律

qRT-PCR檢測結果表明所選10個候選靶基因在巴什拜羊骨骼肌中均有表達（圖3），但在不同發育階段的表達量存在差異。表達量在胎兒期呈持續下降趨勢，在胎兒期第40和50 天表達量最高，極顯著高于其他時期（＜0.01），胎兒期第60天開始逐步下降，至出生后降至最低且保持相對穩定（圖3-A）。表達量從胎兒期至出生后呈持續下降趨勢，在胎兒期第40、50和60天表達量最高且差異不顯著（＞0.05），但極顯著高于其他時期（＜0.01）；胎兒期第80、100和120天時表達量下調，但仍極顯著高于出生后各階段（＜0.01）；出生當天至出生后第30天表達量進一步下降，這2個時期差異不顯著（＞0.05），但極顯著高于出生后第60和90天的表達量（＜0.01），至出生后第90天降至最低（圖3-B）。和在胎兒期前期高表達，胎兒期第40、50、60和80天均極顯著高于其他各階段（＜0.01），但至胎兒期第100天迅速下調，至出生后第90天一直保持較低的表達水平（圖3-C和D）。表達量在胎兒期第40、50和60天表達量最高且差異不顯著（＞0.05），至胎兒期第80和100天時表達量極顯著下調（＜0.01），至胎兒期第120天時又出現極顯著上調（＜0.01），但至出生后即出現極顯著下調（＜0.01），直至出生后第90天降至最低水平（圖3-G）。在胎兒期第40和50天時呈高表達，至胎兒期第60和100天時出現2次極顯著下調（＜0.01），而胎兒期第80和120天時出現2次極顯著上調（＜0.01），至出生后一直呈現持續下調趨勢（圖3-H）。基因在胎兒期第40、50、60和80天表達量最高且差異不顯著（＞0.05），胎兒期第100 d時表達量極顯著下調（＜0.01），胎兒期第120 d時又出現極顯著上調（＜0.01），至出生后再次出現極顯著下調（＜0.01），并在出生當天及出生后30、60和90 d保持穩定表達（圖3-I）。上述7個基因在巴什拜羊不同發育階段骨骼肌中的表達變化存在一定差異，但是總體而言呈胎兒期高表達，出生后低表達的趨勢。已有的研究結果表明miRNA對其靶基因的調控一般為負調控，而課題組前期研究發現miR-486在巴什拜羊胎兒期總體呈低表達，出生后表達量逐漸上調[10]。由此可以推斷，在上述7個候選靶基因與miR-486巴什拜羊骨骼肌中存在靶向調控關系的可能性很大。

A和B分別為胎兒期和出生后候選靶基因GO分析結果，Y軸為GO條目名稱，X軸為相應條目富集的候選靶基因占注釋于該類型候選靶基因的比例

A和B分別為胎兒期和出生后候選靶基因參與通路分析結果，Y軸為pathway名稱，X軸為富集因子，氣泡大小反映了富集到某個信號通路中的候選靶基因的數量占該通路已發現參與基因的比例，顏色變化反映了某個通路富集的顯著性水平

A-J分別為10個候選靶基因在巴什拜羊不同發育階段骨骼肌中相對表達量的qRT-PCR檢測結果，橫軸為巴什拜羊骨骼肌不同發育階段，1-10分別指胎兒期第40、50、60、80、100和120天，以及出生當天，出生后30、60和90 d共10個不同的發育階段，縱軸為相應基因的相對表達量，圖中相同字母或無字母表示差異不顯著（P＞0.05），不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05），不同大寫字母表示差異極顯著（P＜0.01）。下同

和在胎兒期和出生后巴什拜羊骨骼肌中的表達量未見顯著變化（圖3-E和3-J），推測這2個基因的表達可能是巴什拜羊骨骼肌生長發育所必需，故其表達量保持相對穩定；而胎兒期呈低表達，但表達量逐步上調，至出生后第90 天達到較高的表達水平（圖3-F）。結合miRNA與其靶基因靶向調控的規律，推測這3個候選靶基因與miR-486存在靶向調控關系的可能性不大。

2.4 熒光素酶報告載體驗證

為了進一步驗證miR-486與候選靶基因的靶向調控關系，從上述10個候選靶基因中選擇、、和4個候選靶基因進行雙熒光素酶報告載體實驗驗證。將4個候選靶基因野生型（WT）和突變型（Mut）靶位點序列插入到雙熒光素酶報告載體海腎熒光素酶和螢火蟲熒光素酶之間（圖4-A），熒光素酶活性檢測結果表明miR-486與插入野生型靶位點序列報告載體共轉染細胞中螢火蟲熒光素酶的活性均極顯著低于對照組（＜0.01），而miR-486與插入突變型靶位點序列報告載體共轉染細胞中螢火蟲熒光素酶的活性與對照組無顯著差異（＞0.05，圖4-B），說明miR-486可與候選靶基因靶位點序列高效結合，從而抑制其后螢火蟲熒光素酶的表達，由此也初步證明miR-486與、、和4個基因存在靶向調控關系。

2.5 骨骼肌衛星細胞中靶向調控關系驗證

巴什拜羊骨骼肌衛星細胞中的驗證結果表明，對于和，當轉入miR-486 mimics造成細胞中miR-486的表達水平呈上調狀態時，繼續培養至24、48和72 h的細胞中均檢測到和的mRNA水平隨著培養時間的延長呈顯著下調趨勢（＜0.05），空白對照組、miR-486 inhibitor組和兩個陰性對照組細胞中和的mRNA水平未見顯著變化（＞0.05）（圖5-A和C）；的mRNA水平在培養至24 h細胞中未見顯著變化（＞0.05），48 和72 h的mRNA水平變化與和相同（圖5-D）；mRNA水平在miR-486 inhibitor組24、48和72 h的細胞中均呈顯著上調趨勢（＜0.05），在miR-486 mimics組48和72 h的細胞中均呈顯著下調趨勢（＜0.05），其余處理組之間無顯著差異（＞0.05）（圖5-B）。

A為候選靶基因片段插入雙熒光素酶報告載體位置及4個候選靶基因野生型（WT）和突變型（Mut）靶位點序列，序列中帶下劃線的堿基為通過重疊PCR獲得的突變堿基；B為插入野生型和突變型靶位點片段熒光素酶報告載體的熒光素酶相對活性檢測結果，NC指miR-486的陰性對照（Negative control）

綜合熒光素酶報告載體實驗和骨骼肌衛星細胞中靶向調控關系驗證實驗結果，可以確認在巴什拜羊骨骼肌中miR-486可以靶向調控、、和4個基因。

A、B、C和D分別為候選靶基因PTEN、Foxo1、IGF1R和 PIK3R1在轉染細胞中24、48和72 h的相對表達量

3 討論

動物的骨骼肌是由單核的成肌細胞相互融合而成的多核肌纖維構成的[14]。成肌細胞來源于中胚層，遷移至軀干和四肢等骨骼肌發育的位置后，成肌細胞先增殖達到一定的數量，然后相互融合為肌管，并最終發育成肌纖維[15-16]，這一過程一直持續至動物出生前才結束。在不同的動物中，肌管的形成可以明顯的區分為兩至三個時期。就大部分動物而言，第一波和第二波肌管分別來自于胚胎和胎兒成肌細胞，并分別發育成初級和次級肌纖維[15]。但在一些大型動物中，例如牛、綿羊、豬和人，在妊娠后期還會有第三波肌管形成[17-20]，這可能與這些動物具有發達的骨骼肌有一定的關系。利用光學顯微鏡定量研究綿羊骨骼肌的超微結構，發現胎兒期的40—80 d和100—120 d為骨骼肌生長發育的關鍵時期[17]。李雪嬌等對中國美利奴羊骨骼肌發育進行了系統研究，發現胎兒期第75天前后肌纖維的形成基本完成，至第105天時肌纖維的數量基本恒定，此后骨骼肌的發育主要表現為肌纖維直徑和長度的增加[21-22]。石田培等利用全轉錄組測序對中國美利奴羊胎兒期骨骼肌中circRNA的表達情況進行研究，發現胎兒期第85、105和135天這3個階段顯著富集了大量與肌肉發育相關的基因和通路[23]。提示這些階段骨骼肌中的基因表達模式發生了變化，以支持骨骼肌細胞不同生長發育狀態的轉換和維持。鑒于此，本研究進一步細化采樣階段，對巴什拜羊胎兒期第40、50、60、80、100和120天，以及出生當天，出生后第30，60和90天骨骼肌中miR-486的靶基因進行深入挖掘，發現有96個候選靶基因在胎兒期和出生后均有表達，有27個和22個候選靶基因分別在胎兒期和出生后特異表達。對其中10個候選靶基因mRNA水平的定量研究結果表明，即使是共表達的候選靶基因，在巴什拜羊不同發育階段骨骼肌中的表達量亦有很大的變化，、和等7個候選靶基因在胎兒期巴什拜羊骨骼肌中呈高表達，出生后其表達量顯著下調，而在胎兒期低表達，出生后表達量出現顯著上調，僅有和兩個候選靶基因的表達量未見顯著變化。結合前人研究結果，推測這些候選靶基因可能在維持不同發育階段骨骼肌細胞增殖和分化過程中發揮著重要的作用。

miR-486由（）的第40個內含子編碼[24]，第40—42外顯子編碼的一個小分子Ank1蛋白僅在肌肉中表達，可將肌小節連接在肌質網上[25]。到目前為止未發現miR-486尚有其他家族成員，且僅在哺乳動物中表達，其序列高度保守，在鳥類、魚類、兩棲類和更低等的后生動物中均未檢測到miR-486的表達[24]。miR-486在巴什拜羊的骨骼肌和心肌中高表達[10]，且其表達量在出生后巴什拜羊骨骼肌中極顯著上調[9]，推測miR-486在巴什拜羊骨骼肌發育過程中可能發揮著重要的作用，本研究中發現的miR-486部分候選靶基因已證明與骨骼肌發育調控和機能維持密切相關，初步支持這一推測的可靠性。（phosphatase and tensin homolog）是一個重要的腫瘤抑制基因，可以通過抑制PI3K的活性以及降低Akt的磷酸化水平影響下游mTOR信號通路，最終影響細胞的生長和存活[26]。在成年人的骨骼肌中，骨骼肌衛星細胞處于靜止、激活和分化的動態平衡狀態，但是當被敲除，大量的骨骼肌衛星細胞將不經過增殖即進入激活、提前成熟分化狀態，進而造成骨骼肌中衛星細胞的消耗而最終影響骨骼肌損傷的修復和再生[27]。可以促進小鼠肌細胞融合，同時參與骨骼肌纖維分化的調控，在富含快肌纖維的骨骼肌組織中的表達量顯著高于富含慢肌纖維的骨骼肌組織[28-29]。在小鼠肌細胞中，miR-486抑制其靶基因和的表達進而激活PI3K/Akt信號通路參與肌肉的生長的調控和內穩態的維持[24]。在杜氏肌應用不良癥（duchenne muscular dystrophy, DMD）患者的肌肉組織中miR-486的表達量顯著下調，同時在DMD動物模型骨骼肌中過表達miR-486，可降低DOCK3和PTEN的水平，進而提高AKT的磷酸化水平并使肌營養不良癥狀得到明顯緩解[30]。慢性腎病（chronic kidney disease, CKD）患者由于E3連接酶的激活，泛素蛋白酶體系統被活化，進而引起肌肉中蛋白質的分解，但是若上調肌肉中miR-486的水平可顯著抑制E3連接酶的表達，使患者的肌肉量明顯增多，進一步研究表明這一過程是miR-486通過抑制的轉錄，同時增加Foxo1磷酸化水平，降低PTEN磷酸化水平，最終使Akt的磷酸化水平顯著升高進而激活相關信號通路而實現[31-32]。本研究已證實，在巴什拜羊骨骼肌中miR-486可以靶向調控、、和4個基因的表達，但其在巴什拜羊骨骼肌發育過程中的生物學功能尚有待后續試驗闡明。

KEGG分析結果表明，miR-486通過調控其候選靶基因的表達同時參與多個信號通路的調控。例如同時參與mTOR signaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway、FoxO signaling pathway、MAPK signaling pathway、Ras signaling pathway 和Adherens junction等信號通路的調控，同時參與Phosphatidylinositol signaling system、PI3K-Akt signaling pathway、FoxO signaling pathway、mTOR signaling pathway和Insulin signaling pathway等信號通路的調控，很多信號通路已證明與骨骼肌生長發育的調控密切相關[33-37]，在小鼠中的研究結果表明，其骨骼肌中miR-486的表達受的調控，通過miR-486轉錄水平的調控可將myostatin信號通路和IGF-1/Akt/ mTOR信號通路有效整合[8]。在人類骨骼肌中，miR-486可通過調控PI3K-Akt、ubiquitin proteasome、FoxO和mTOR信號通路，使骨骼肌組織很好地適應有氧運動訓練[38-39]，提示miR-486可能在溝通和協調巴什拜羊骨骼肌內相關信號通路中發揮著重要作用。

在細胞質中miRNA首先與Argonaute蛋白組裝成為miRNA誘導的沉默復合體（miRISC），然后miRNA通過其種子序列與靶基因mRNA互補結合引導miRISC結合到其靶基因mRNA的靶位點上，進而調控其靶基因的翻譯[40-41]，但在動物中miRNA是通過抑制其靶基因mRNA的翻譯還是誘導其降解實現其對靶基因的調控尚存在爭議，有研究結果表明在動物細胞中miRNA主要是抑制其靶基因mRNA的翻譯，并不會誘導mRNA的降解[42]，但也有相關研究檢測到了miRNA誘導的mRNA降解[43]。或許Djuranovic等的研究可以更好地解釋這一問題，他們利用果蠅S2細胞建立了一個可控的表達系統，并以此研究了miRNA對其靶基因調控的動力學特征，發現miRNA不論跟天然的或者人工合成的3′ UTR區靶位點結合，首先是抑制其翻譯，進而引起mRNA的脫腺苷化和降解，所以miRNA可能是先抑制其靶基因mRNA的翻譯，然后再誘導其降解來實現其對靶基因的調控，若在抑制階段檢測細胞中mRNA的水平，則會得出miRNA不會誘導mRNA降解的結論[44- 45]。本研究中上調巴什拜羊骨骼肌衛星細胞中miR-486的水平，至24 h其靶基因和的mRNA水平未見顯著降低（＞0.05），但是至48和72 h時和的mRNA水平顯著低于對照組（＜0.05），與此不同的是和的mRNA水平至24 h時即可檢測到顯著降低（＜0.05）。同為miR-486的靶基因，其調控方式卻存在不同，其機理尚有待進一步研究。通過靶位點分析發現，miR-486在的mRNA上有3個靶位點，其中一個位于CDS區，在的mRNA上有2個靶位點，而在和的mRNA上僅檢測到1個靶位點，這種調控方式的差異是否與靶位點的位置和數量有關尚有待后續實驗驗證。另外，當下調巴什拜羊骨骼肌衛星細胞中miR-486時，僅檢測到的mRNA水平較對照組顯著升高，其他3個靶基因mRNA水平未見顯著變化（＞0.05），其機理亦有待進一步闡明。

4 結論

本研究采用構建cDNA文庫結合高通量測序的方法首次對巴什拜羊不同發育階段骨骼肌中miR-486的靶基因進行了深入研究，在胎兒期和出生后骨骼肌中分別檢測到123個和118個miR-486的候選靶基因，功能分析結果表明候選靶基因顯著富集于PI3k-Akt、Wnt和MAPK等已證明與肌肉發育調控密切相關的信號通路。其中、、、、、和7個候選靶基因在胎兒期巴什拜羊骨骼肌中呈高表達，出生后其表達量顯著下調，而候選靶基因呈相反的表達趨勢，提示這些基因在巴什拜羊胎兒期和出生后骨骼肌發育狀態轉換中可能發揮著重要作用。選擇、、和4個候選靶基因進行實驗驗證，確認miR-486與所選4個候選靶基因存在靶向調控關系，說明本研究獲得的miR-486的靶基因數據可靠性高。

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Investigation of miR-486 Target Genes in Skeletal Muscle of Bashbay Sheep in Different Development Periods

ZHANG Wei1, 2, WANG ShiYin1, GAO Li1, YANG LiWei1, DENG ShuangYi1, LIU XiaoNa1, SHI GuoQing2, GAN ShangQuan2

1Xinjiang Agricultural Professional Technological College, Changji 831100, Xinjiang;2State Key Laboratory of Sheep Genetic Improvement and Healthy Production/Institute of Animal Husbandry and Veterinary, Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Sciences, Shihezi 832000, Xinjiang

【】The aim of this study was to deeply reveal the target genes of miR-486 in skeletal muscle of Bashbay sheep during different development periods, and to get basic data for finally uncover the molecular regulation mechanism of excellent meat traits of this sheep breed, then finally to support to further breeding. 【】The skeletal muscle of Bashbay sheep were collected during 40 d, 50 d, 60 d, 80 d, 100 d and 120 d of fetal period, and 1, 2, and 3 months old of new born sheep. The total RNA was extracted, and two cDNA libraries of miR-486 target genes were constructed using mRNA of fetal and postnatal period, respectively, then the library was sequenced applied high-throughput sequencing technology. Based on the function analysis, 10 candidate target genes were selected, and their express patterns in Bashbay sheep skeletal muscle of 10 development periods mentioned above were detected by qRT-PCR. By analyzing the expression pattern of these 10 candidate target genes and miR-486 in skeletal muscle of Bashbay sheep, their target regulation relationship and functions were primarily verified. Finally, 4 candidate target genes were chosen to confirm their regulation relationship using the double luciferase reporter assay and target regulation assay in satellite cell of skeletal muscle of Bashbay sheep. 【】Total 123 and 118 target genes of fetal and postnatal period were obtained, respectively. Due to these target genes were not confirmed by further function assay, so they were called candidate target genes temporarily. Among of them, 96 genes were expressed in skeletal muscle of fetal and postnatal period, 27 and 22 genes were specially expressed in these two periods respectively. The result of GO and KEGG analysis showed that these candidate target genes regulated mass pathways related to muscle cell differentiation and development, just like PI3k-Akt, MAPK, Wnt, Adherens junction and Regulation of actin cytoskeleton, etc. All 10 candidate target genes were expressed in skeletal muscle of Bashbay sheep, but their expression patterns were different. Among of them,,,,,,andwere expressed at a relatively high level in the fetal period skeletal muscle of Bashbay sheep, but were significantly down regulated during postnatal period, andshowed an opposite expression pattern compared with above 7 genes. The expression ofandgene did not found significantly change in all 10 development periods of Bashbay sheep. The result of double luciferase reporter assay showed that miR-486 could bind the target sites of,,andefficiently, and significantly suppressed the activity of firefly luciferase. In skeletal muscle satellite cell, mir-486 also could down-regulate mRNA of these four genes significantly, and finally suppressed their biology functions. So it was ultimately confirmed that miR-486 could regulate these 4 target genes indeed in skeletal muscle of Bashbay sheep. 【】The investigation deeply revealed the target genes of miR-486 in skeletal muscle of Bashbay sheep during different development periods for the first time, and comprehensively analyzed the biology process and signaling pathway they participated. The further function assay proved that the data of target genes were reliable. These data would help to uncover the molecular regulation mechanisms related to excellent meat traits of Bashbay sheep.

Bashbay sheep; miR-486; target gene; skeletal muscle; cDNA library

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.14.018

2020-06-03；

2020-10-30

新疆維吾爾自治區自然科學基金面上項目（2017D01A51）

張偉，E-mail：zhangweigsau@163.com。通信作者王世銀，E-mail：wangshiyinxjnzy@163.com。通信作者甘尚權，E-mail：shangquangan @163.com

（責任編輯 林鑒非）