高頻相移壓電石英凝血檢測系統

扶梅 司士輝＊ 馮浪霞 張潤

中南大學化學化工學院，湖南長沙 410083

0 引言

血液凝固[1]是由一系列不同凝血因子參與的免疫反應過程，正常情況下的血液凝固能夠防止人體意外出血，而異常的血液凝固可能會伴隨中風、血友病、新型冠狀肺炎等一系列危害人體生命健康的疾病[2-3]。臨床醫學檢驗也通常根據病人血液凝固特性來篩選出一系列遺傳性疾病，如肝臟類、血栓性疾病等[4]。因此，凝血特性的檢驗在一系列疾病防控中顯得尤為重要。臨床凝血特性的檢驗設備有半自動血凝儀和全自動血凝儀[5]。半自動血凝儀操作簡便、價格便宜，但檢測速度慢、精度低；全自動血凝儀通道多、速度快、測量精度好，但價格昂貴、對操作人員素質要求高。隨著國家醫療條件的不斷進步，上述大型、復雜的血凝儀已不能滿足社區、家庭、現場急救等應用場景下的需求，因而急需一種操作方便、成本低、應用穩定、結果可靠的實時在線檢驗（point of care testing，POCT）設備來實現凝血監測。當前，實驗室正在開發研究的小型便攜POCT凝血設備主要有：分光光度儀、石英晶體傳感器、磁彈性傳感器、表面等離子體共振儀等[6-9]。其中，石英晶體傳感器被證明是一種非常有用的血凝檢驗儀器。傳統的石英晶體傳感器已被用于測定纖維蛋白原濃度[10]、凝血因子活性[11]和凝血時間[12-13]，具有實時輸出、無標記等優點，但重復性和穩定性不好。為了克服傳統石英晶體傳感器凝血監測的缺陷，本文開發了一款高頻相移壓電石英傳感系統。該系統采用高頻33 MHz壓電石英晶體研制而成，基于固定頻率相位響應的信號表征方式，成功地實現了對凝血時間的實時在線檢測。

1 系統原理

傳統壓電石英晶體傳感器一般用傳感器的頻率來表征，頻率的變化需要連續掃頻來確定，而頻率掃描需要有最少的步長，每步長都需要時間，這使得連續數據采集擬合之間存在過渡時間。過渡時間越長，數據采集速度越慢，頻率的變化速度就越慢，將導致系統無法達到預期的測量精度，同時也影響了系統的穩定性。本文使用固定頻率驅動器[14]，在一組固定振幅和恒定頻率的位置被動激勵傳感器，每次都由相同的重復過程觸發，省略了頻率掃描步驟，加快了數據采集速度。同時，采用相位測量的信號表征方式與頻率響應相比，相位響應不易停振，性能穩定，靈敏度更高。基于固定頻率的相位響應與負載質量的關系[15]如下：

式中，Δφ表示相移，φ表示相位；Δmc=ρchc為表面涂層質量變化，hc為涂層的厚度；ml為接觸液體的質量，Δm1=ρ1δ1/2為表面溶液質量變化，δ1=(2η1/ωρ1)1/2為波在液體中的穿透深度，ω為信號角頻率；mq=πηq/2vq為石英晶體的質量，vq=(C66/ρq)1/2為波在石英晶體中的傳播速度，C66為石英晶體的壓電彈性常數，η和ρ為物質的粘度和密度。由上式可知，相移與石英晶體表面接觸物質的量有關，相位信號隨著質量的變化而變化，可以實現連續測量。

2 系統設計

2.1 系統的搭建

高頻相移壓電石英傳感系統主要由上位機控制器、Arduino Due微控制器、信號發生器、信號調理模塊、相敏檢波器、傳感元件等6部分器件組成，如圖1所示。該系統由3層電路板通過排針組裝而成，最上層為信號控制模板，Arduino Due微控制器連接上位機控制器，利用LabVIEW程序控制系統運行；中間層為信號調理模板，采用低通濾波器、信號放大器和信號衰減器等對信號進行調理和優化；下層板為信號產生和采集模板，包括信號發生器、相敏檢波器和傳感元件等。信號發生器是該系統的重要部件，其以石英晶體作為參考時鐘源，基于直接數字頻率合成（DDS）技術，采用AD9910芯片實現正弦波激勵和信號合成。相敏檢波器的功能是將信號進行采集、鑒別、調制，輸送至Arduino Due微控制器進行數據處理，最終由LED液晶顯示屏實時動態顯示。壓電石英晶體是該系統的傳感元件，可用于監測系統的信息變化。PID控溫器的作用是在測試時對系統進行精確控溫，保持凝血因子的活性。

2.2 一次性血凝檢測片的設計

石英晶體作為傳感器的核心元件，其結構對傳感器的性能具有重要的作用。近年來，為了提高儀器的靈敏度，科研工作者們開展了眾多對高頻石英晶體傳感器的研究[16-17]。實驗表明，提高基頻能夠提高儀器的響應靈敏度，但是提高基頻必須減小石英晶片的厚度，而石英晶片越薄，機械性能越差，加工和封裝工藝越復雜。為了滿足日常生活中對高頻器件的要求，通常在電路中采用倍頻技術和泛音晶體[18]。本文使用33 MHz壓電石英晶體，采用第三泛音模式（99 MHz）驅動，以實現高頻100 MHz的目的。與基頻100 MHz石英晶體相比，33 MHz石英晶體晶片尺寸更大，操作更方便，成本更低。

本文利用33 MHz薄片式鍍銀石英晶體作為傳感元件，自制了一次性微型檢測片，如圖2所示。根據石英晶體的直徑，用打孔器將薄膠片打出相應大小的孔洞，將石英晶體薄片粘貼在鑲嵌有銅電極的塑料片上。與傳統檢測池[19]相比，該檢測片小巧便攜、安裝方便，有利于更好地實現實時現場檢測。

由于石英晶體表面電極是疏水性的，凝血因子不能完全吸附在其表面，反應時血液不與石英晶體充分接觸，因而檢測到的響應不完全。為了解決這一問題，需要對石英晶體進行表面改性[20]。聚苯乙烯是一種價格便宜、性能穩定的高分子聚合物，即使在較高的涂層厚度下也不會產生明顯的阻尼而影響傳感器性能，且修飾過程方便、快速，修飾后的表面均勻、光滑，可以通過物理吸附結合抗原、抗體。因此，本文采用聚苯乙烯的氯仿溶液[21]修飾石英晶體，將凝血試劑以干粉狀態固定在壓電石英晶體表面，組成一次性血凝檢測片。

3 凝血實驗與結果分析

3.1 液血時間的測定

將壓電石英晶體經乙醇、蒸餾水、磷酸緩沖鹽溶液反復清洗干凈，氮氣吹干。將控溫器和未修飾的檢測片組裝好連入傳感系統中，開機預熱5分鐘，記錄初始響應信號。取一定量聚苯乙烯粉末溶于氯仿溶液，配制成1 g/L聚苯乙烯的氯仿溶液。取5 μL聚苯乙烯的氯仿溶液均勻滴加到石英晶體表面，用紫外燈照射10分鐘，待氯仿揮發完，形成一層光滑的涂層，待基線穩定，記錄涂層的響應信號。用移液槍分別取20 μL凝血酶時間（thrombin time，TT）標準試劑、凝血酶原時間（Prothrombin time，PT）標準試劑和活化部分凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time，APTT）標準試劑，均勻噴涂在表面改性后的石英晶體表面，冷卻干燥，依次組裝成不同類型的一次性血凝檢測片，記錄凝血試劑干粉的響應信號。用移液槍移取10 μL血漿加入到血凝檢測片，與凝血標準試劑充分反應，記錄響應信號與響應時間，計算凝血時間，重復30次，與標準凝血時間進行對比，計算誤差。

3.2 結果分析

高頻相移壓電石英傳感系統具有優越的質量敏感特性，能夠對其表面的質量變化產生響應，圖3反映了凝血檢測過程中系統的響應信號變化。凝血檢測主要分為2個過程，分別為血凝檢測片的制備和血液凝固時間的測定。

圖3中，響應信號的變化規律如實地反映了凝血檢測的全過程，符合公式（1）中相移信號與表面負載質量的響應規律。聚苯乙烯的修飾和凝血因子的固定增加了表面涂層質量，系統的響應信號隨著涂層質量的增加而下降，直至穩定。血液凝固過程中，以凝血酶時間（TT）的測定為例，加入血漿，啟動凝血反應，凝血酶標準試劑將血漿中可溶性纖維蛋白原裂解成可溶性纖維蛋白，同時可溶性纖維蛋白聚合形成不溶性的纖維蛋白。該過程中，體系的粘度逐漸增加，系統的響應信號快速下降，圖中，A點表示凝血反應的開始，對應時間為t1；B點表示纖維蛋白的生成，對應時間為t2。隨后，生成的纖維蛋白凝聚體附著在石英晶體表面，體系粘度逐漸減少，晶體表面負載質量逐漸增加，因而響應信號下降速率開始減緩。隨著纖維蛋白凝聚體的完全吸附，系統的響應信號達到穩定，C點表示反應結束，對應時間為t3。t1和t3的值可直接讀出。

為了測量凝血時間，對圖3中血液凝固過程的響應信號差隨響應時間作圖，將得到的凝血反應曲線分別進行一階和二階微分，得到圖4。圖中，t2對應一階導數最大值點和二階導數左右符號相反的點，因此，根據微分曲線的特殊性可以求得凝血時間，TT=t2-t1=(256-240)s=16 s。重復測量30次，得到圖5所示的凝血酶時間。

表1 血漿凝血時間的測定

與臨床標準凝血時間相比，該系統的測量誤差低于10%，可認為該系統的測量結果準確性好，能實際應用于血漿凝血時間的測定。

4 結論

本研究開發了一種高頻相移壓電石英凝血檢測系統，制備了一次性血凝檢測片，基于凝血試劑的干法修飾和微分數據處理方式，成功地實現了對血漿凝血時間的實時在線檢測。與傳統壓電石英晶體傳感器相比，使用高頻33 MHz石英晶體作為傳感元件，采用固定頻率相位響應的信號表征系統，增強了系統靈敏度，提高了系統穩定性，同時顯著降低了數據采集擬合時間，提高了時間分辨率。

未來，我們希望在此基礎上開發出一款便攜式、無標簽的血凝檢測儀，用于快速、準確地檢測人類指尖血，為社區、家庭、現場急救等應用場景下的實時在線血凝檢測創造條件。