從獸醫化驗員技能競賽分析ELISA試驗注意事項

朱國強 陳偉 徐鴻 徐聰 孫圣福*

（1，山東省濟南市章丘區畜牧獸醫事業發展中心 250200；2，山東省濟南市動物疫病預防與控制中心 250100；3，山東省動物疫病預防與控制中心 250100）

獸醫實驗室承擔著動物疫病檢測、診斷、動物疫情和免疫狀況監測、動物疫病防控科學研究等職責，對動物疫病防控發揮著重要的支撐作用。獸醫化驗員作為獸醫實驗室檢測人員，操作的規范性直接決定檢測結果的正確與否。ELISA 作為獸醫實驗室常用的檢測方法，常用于口蹄疫、豬瘟等疫病的免疫效果檢測，也可用于動物疫病的病原檢測。為考核獸醫系統實驗室操作人員的技能，選取ELISA 作為技能考核的一項，主要考查選手對ELISA 試驗的基本操作、試驗過程中的生物安全以及對結果的判定等內容，從考核結果看基本滿意，但也暴露了ELISA 過程中一些不容忽視的細節。

1 樣品和材料

1.1 樣品

待檢血清樣品為10 份，含陰性、弱陽性和強陽性3 個不同滴度，由國家口蹄疫參考實驗室制備，由省動物疫病預防與控制中心統一編號和致盲；改進型口蹄疫O 型液相阻斷酶聯免疫吸附試驗試劑盒由中國農業科學院蘭州獸醫研究所提供；酶標儀、移液器等儀器和耗材由山東畜牧獸醫職業學院準備和提供。

1.2 判定依據

操作依據《試劑盒說明書》（改進型口蹄疫病毒O 型液相阻斷酶聯免疫吸附試驗）進行。

每份樣品滿分2 分，檢測結果與參考值一致得2 分，檢測結果與參考值誤差在±1 個滴度范圍內得1 分，檢測結果與參考值相差超過±1 個滴度不得分。

2 結果

試驗從樣品稀釋開始，到工作液配制、測定OD 值，計算檢測數據，判定結果。主要考察選手移液加液的規范性、移液器、酶標儀的規范使用，對溫度反應條件、生物安全注意事項及對檢測結果正確性的掌握，選手ELISA 得分情況見附表。

附表 選手ELISA 得分情況

3 分析與討論

總體成績看，選手得分從68.5～97 不等，分數差近30 分，說明選手之間的差別比較大；中位數為90.5，說明至少一半的選手對于該項技能競賽結果良好。從各項得分看，選手主要扣分點集中在結果的準確性＞生物安全＞基本操作。

從結果得分情況看，選手得分分差較大，從3～27 分不等，2 位選手得分在10 分以下，結果偏離參考值較大，病毒抗原對照和陰陽性判定出現錯誤，這可能與操作過程不規范有關，操作不熟練，對該方法沒有完全掌握；其余選手得分均在18 分以上，僅有個別樣本的結果偏離參考值較大，大多數樣本的檢測結果與參考值相差1 個滴度以內。

從生物安全得分情況看，大部分選手對實驗室生物安全有較高的認識，扣分點主要集中在個別選手，表現在試驗過程中口罩拉到口鼻以下，洗板過程中產生的廢液沒有倒在標識有“生物安全”的垃圾桶中。

基本操作包括工作液（洗滌液、病毒抗原工作液、底物）配制、樣本稀釋、抗原稀釋、加酶標抗體、底物、終止液，基本操作主要是移液的規范性、準確性以及洗滌酶標板后有沒有殘液，這與檢測結果直接相關。從選手操作看，主要集中在移液不規范，移液器與TiP 吸頭沒有卡緊，導致移液不準確，尤其是使用多道移液器時液面沒有處于同一水平線，個別樣本移液量不足；加同樣液體的順序沒有從低濃度到高濃度；移液器使用完沒有調至最大量程，沒有放置在移液器架上等；洗滌酶標板后，液體沒有拍干，殘留有部分液體；拍酶標板沒有垂直拍板，有一定角度，導致板孔中的液體上流入到下面的孔中，導致交叉污染。

從ELISA 本身看，該方法是一種免疫檢測中最常用的檢測方法之一，也是比較成熟的實驗室檢測方法，檢測結果受試劑、人員、儀器設備及環境溫度操作過程的影響。試劑質量包括敏感性、特異性和重復性，試劑的運輸是否符合試劑盒要求，是否全程冷鏈，保存是否低溫保存，冰箱的溫度是否穩定，使用前是否恢復到室溫等；人員是否經過專業的技術培訓，培訓后是否考核上崗，上崗后是否進行過監督；移液器、酶標儀等關鍵儀器設備是否經過計量認證，精確度是否能達到要求等；操作過程是否嚴格按照標準或作業指導書的要求執行。ELISA 試驗應至少但不僅限于以上因素才能做到檢測結果的客觀科學。