鈣磷濃度對白及種子萌發的影響

楊麗麗， 劉 海， 劉 筱， 孔 嬌， 莫遠琪， 夏 與， 吳明開*

(1.貴州省農業科學院 現代中藥材研究所，貴州 貴陽 550006； 2.貴州省農業生物技術重點實驗室， 貴州 貴陽 550006； 3.安龍縣欣蔓生物科技有限責任公司，貴州 安龍 552400)

引言

【研究意義】白及(Bletillastriata)主要采集其塊莖干燥后入藥，是蘭科白及屬多年生草本植物[1]。其性苦、甘、澀，微寒，用藥歷史悠久，具有收斂止血、消腫生肌等功效，主要用于治療咯血、吐血、外傷出血、瘡瘍腫毒和皮膚皸裂等病癥[2]，同時也在醫藥、化工、美容和保健等方面得到廣泛應用[3-8]。白及是貴州道地藥材，而貴州是典型的喀斯特地貌，基巖中多為可溶性鹽類并且極富鈣(Ca)，同時土壤中磷(P)多數以難溶態存在，可以被植物直接吸收利用的有效磷含量低。因此，該環境下生長的白及遭受高 Ca、低P的雙重脅迫。【前人研究進展】白及種子無胚乳，目前白及組培快繁體系尚不完善[9]，前人主要研究不同激素對白及種子的影響，如趙垚等[10]研究了不同植物生長調節劑對白及種子萌發及生長的影響。周雨等[11]研究了不同激素對白及種子無菌萌發生長的影響。【研究切入點】到目前為止，鈣、磷不同濃度對白及種子萌發的影響尚未見報道，研究鈣、磷不同濃度脅迫下白及種子的萌發情況，對白及在貴州地區的種植和生產具有指導意義。【擬解決的關鍵問題】探明高鈣、低磷對白及種子無菌萌發的影響，揭示白及對巖溶生境高鈣、低磷環境的適應機制，為優化白及組培育苗技術提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 白及蒴果采于貴州省農業科學院中藥材資源圃，原植物經貴陽中醫學院何順志教授鑒定為蘭科植物白及(Bletillastriata)。

1.1.2 試劑 碘化鉀(分析純)、五水硫酸銅、磷酸二氫鉀，購自天津市致遠化學試劑有限公司；硫酸錳，購自重慶茂業化學試劑有限公司；硼酸、乙二胺四乙酸二鈉、肌醇、甘氨酸，購自天津市科密歐化學試劑有限公司；硫酸鋅，購自天津市大茂化學試劑廠；鉬酸鈉，購自天津市化學試劑四廠；氯化鈷，購自天津市瑞金特化學品有限公司；硫酸亞鐵、氯化鈣，購自成都市科龍化工試劑廠；VB1、VB6，購自上海山浦化工有限公司；煙酸，購自上海藍季科技發展有限公司；硝酸鉀，購自重廣江川化工有限公司；硝酸銨，購自西隴化工股份有限公司；七水硫酸鎂，購自成都金山化學試劑有限公司；6-BA，購自如吉生物科技；NAA，購自北京鼎國生物科技有限責任公司。

1.1.3 儀器MLS-3750 日本三洋(SANYO)全自動高壓蒸汽滅菌器(上海道薩生物科技發展有限公司)，SW-CJ-1G型單人凈化工作臺(蘇州凈化設備有限公司)，尼康體視顯微鏡SM800N。

1.2 培養基制備及培養條件

MS培養基中加入無水氯化鈣3.2 g/L，磷酸二氫鉀1.7 g/L。配制缺鈣的MS培養基，分別加入1/2倍鈣、1倍鈣、1.5倍鈣、2倍鈣、2.5倍鈣、3倍鈣；配制缺磷的MS培養基，分別加入1/8倍磷、1/4倍磷、1/2倍磷、1倍磷、1.5倍磷；將配制培養基置于121℃條件下高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻待用。

1.3 果實預處理

將流水沖洗成熟未開裂的白及蒴果瀝干，在超凈臺上分別利用75%乙醇溶液、8% NaClO溶液進行表面消毒1 min、10 min，再用無菌水沖洗4～6次[12]，然后用滅菌剪刀在白及碩果上開小口。

1.4 種子培養

將預處理的果實用鑷子夾緊蒴果表面，輕輕將粉末狀的種子均勻抖落至培養基表面，放置入溫度(25±1)℃、光照度1 200 lx、光/暗周期為12 h/12 h的環境下培養。期間觀察白及種子形態以及萌動期和發芽期的動態。

2 結果與分析

2.1 白及種子形態

肉眼下白及種子極小，黃褐色。10倍顯微鏡下呈兩端稍尖的紡錘形，中間有一細小橢圓狀的胚，無胚乳。30倍顯微鏡下種子的胚外層具有透明的種皮，種皮為一層薄壁細胞，細胞透明，無內容物[13]，種皮有薄有厚(圖1)。

圖1 放大10 倍和30 倍的白及種子

2.2 萌動期動態

白及種子接種至培養基后開始吸水膨脹，種胚和種皮膨大。接種5 d時開始明顯吸脹，且高鈣濃度處理的種子吸脹較快，而低磷濃度對種子吸脹無明顯促進作用。接種10 d種子顏色由淡黃色轉變為綠色。隨著鈣濃度的增加白及種子膨脹體積越大(圖2)；低磷處理條件下，白及種子也在吸脹，逐漸膨大。但各濃度間無明顯差距(圖3)。由圖2、圖3可見，接種10 d白及種皮仍完整，白及種子先經歷吸脹作用，待其膨大、轉綠后突破種皮。白及種子的胚不斷膨大，當接種15 d時，部分種子沖破種皮，發育成圓球莖并不斷長大，種皮因此沿著長軸被不斷撕開，其他部分保持相對完整。

圖2 鈣處理播種10 d的白及種子(2×10 倍)

圖3 磷處理播種10 d的白及種子(2×10 倍)

2.3 發芽期動態

培養至20 d時，大部分種子已突破種皮，并形成子葉，甚至有的圓球莖尾部長出很細的根。由圖4可見，在加入2倍鈣、2.5倍鈣、3倍鈣中的幼苗長出第2片子葉。培養至30 d時，在不同磷濃度的培養基中，1/2磷濃度條件下長出第2片子葉(圖5)，而低濃度磷對子葉生長起促進作用。

圖4 鈣處理播種30 d的白及種子(4×10 倍)

圖5 磷處理播種30 d的白及種子(4×10 倍)

3 討論

白及種子自然條件下萌發率極低，應用和開發繁殖技術體系以保護白及資源及開展規模化生產。試驗配制缺鈣、磷和鈣、磷不同濃度的MS培養基培養白及種子，5 d后開始吸脹，第10天白及種子逐漸膨大，但各濃度間無明顯差距。說明，萌發10 d是白及種子的膨脹期，適當增加鈣濃度可促進白及種子體積膨大，磷濃度對其影響不大，且高鈣、低磷處理的種子均發育較快。隨著鈣濃度的增加，白及種子的吸脹、萌動、發芽均呈明顯促進作用，而在試驗濃度范圍內，隨著鈣濃度的增加，促進作用越明顯。說明，白及種子對于喀斯特地區高鈣環境有較好的適應性。低磷處理時，吸脹、萌動期有促進作用，在發芽期1/2倍磷也促進子葉的萌發。說明白及種子對于喀斯特地區低磷環境同樣有較好的適應性。因此，貴州喀斯特地區高鈣低磷土壤環境適合白及種子萌發。

4 結論

鈣、磷不同濃度的MS培養基接種第5天時白及種子均開始明顯吸脹，且高濃度鈣對白及種子吸脹有促進作用，而低濃度磷對種子吸脹影響較小；接種第10天不同培養基種子顏色由淡黃色轉變為綠色；接種第20天不同培養基大部分種子已突破種皮，并形成子葉，甚至有的圓球莖尾部長出很細的根。在加入2倍鈣、2.5倍鈣、3倍鈣培養基中的幼苗長出第2片子葉；1/2磷培養基中長出第2片子葉。適當增加鈣濃度可促進白及種子無菌萌發后子葉生長，且隨著鈣濃度的增大子葉生長加快；適當減小磷濃度可促進子葉生長。