寧夏賀蘭山東麓赤霞珠葡萄籽提取物抑菌活性的研究*

陳 彬 劉永衡 王學英

（寧夏工商職業技術學院能源化工學院，寧夏銀川 750021）

近年來，寧夏葡萄產業發展迅速，寧夏賀蘭山東麓成為業界公認的世界上最適合種植釀酒葡萄和生產高端葡萄酒的黃金地帶之一。2021 年1 月，寧夏九大重點產業之一葡萄酒產業的高質量發展實施方案出臺，其總體任務是力爭用5—10 年時間，釀酒葡萄基地規模達到666 7 萬公頃，年產優質葡萄酒3 億瓶以上，努力實現葡萄酒產業綜合產值1 000億元、賀蘭山東麓葡萄酒品牌價值翻番的目標。隨著葡萄種植、加工產業的發展，產生了大量的葡萄皮渣據估計，目前每年產生約占葡萄加工量25%左右的皮渣。張瑩等研究表明，釀酒后的葡萄皮渣中含有大量花色苷、白藜蘆醇、膳食纖維等功能性成分，具有良好的醫療、保健作用。然而只有少量的皮渣被回收利用，絕大部分被用做肥料、飼料甚至當垃圾處理掉，造成了資源的極大浪費。同時，隨著人們對食品安全問題愈加重視，使得從草藥、香料等植物中提取天然抗菌化合物的研究也愈加迫切。本試驗選用寧夏賀蘭山東麓產區赤霞珠葡萄籽為材料，對不同溶劑提取物的抑菌效果進行了對比研究，旨在為深入研究葡萄籽的抑菌活性機理及其在食品保鮮中的應用提供一定的理論基礎，也為提升葡萄酒釀造產品附加值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗材料

釀酒葡萄：赤霞珠由寧夏西夏王葡萄酒業（集團）有限公司提供。

菌株：供試菌種金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），均購自中國工業微生物菌種保藏管理中心（CICC），試驗室低溫保存。

1.1.2 試劑

營養瓊脂、牛肉膏、蛋白胨（購自北京奧海星生物技術有限公司）、氯化鈉、95%乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇（購自廣東省化學試劑工程技術研究開發中心），均為國產AR 級別試劑。

1.1.3 儀器

R-3 旋轉蒸發儀，瑞士BUCHI 公司；SPX-150B-Z 型生化培養箱，上海博訊實業有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業有限公司；SW-CJ-2FD 型無菌操作臺，上海博訊實業有限公司；PHSJ-4F 型試驗室pH 計，上海儀電科學儀器股份有限公司；梅特勒ME3002E 型分析天平，梅特勒-托利多國際股份有限公司；T6 紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗樣品制備

采用傳統工藝釀造葡萄酒后收集皮渣，于烘箱中60 ℃～70 ℃烘干，分離葡萄籽和葡萄皮。將葡萄籽研磨至粉末狀，浸漬于95%乙醇，避光密閉保存1 個月，備用。取葡萄籽95%乙醇浸漬液減壓蒸餾除去溶劑后得265.3 g 粗浸膏（即95%乙醇總提取物樣品），將粗浸膏溶于1 L 溫水中（60 ℃），再用石油醚（60 ℃～90 ℃）、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，萃取溶劑均為1 L。石油醚萃取層減壓濃縮得18.5 g 浸膏（即95%乙醇總提取物石油醚萃取樣品），乙酸乙酯萃取層減壓濃縮得10.2 g 浸膏，正丁醇萃取層減壓濃縮得26.3 g 浸膏。各提取浸膏用二甲基亞砜DMSO 溶解，制備成5 g/mL 的原始溶液，保藏備用。

1.2.2 供試菌株的活化及平板涂布培養

制備牛肉膏蛋白胨培養基，在121 ℃、0.1 Mpa～0.15 Mpa 條件下高壓滅菌30 min，一部分制備試管斜面培養基，接種供試菌種后置于恒溫培養箱內37 ℃培養24 h。另一部分制備平板培養基，挑取斜面培養菌落于EP 管中，接種于250 mL 三角瓶中，置于恒溫振蕩培養箱中37 ℃振蕩培養12 h 后，將菌液取出，無菌水稀釋成濃度為每毫升106 個細胞的菌液，即OD 值0.5～0.6 的菌液。取5 mL 稀釋菌液分散涂布于直徑100 mm 培養皿上，恒溫培養箱內37 ℃培養12 h。

1.2.3 抑菌圈及抑菌效果的評價方法

抑菌試驗采用濾紙片擴散法，將1.2.1 中DMSO溶解試驗樣品溶液分別配成質量濃度為1.0 g/mL、0.50 g/mL、0.25 g/mL 的標準溶液。用打孔器制作直徑5 mm 濾紙圓片，高壓滅菌后將濾紙片放入各濃度試驗樣品溶液中浸泡30 min，以浸泡過DMSO 溶液的濾紙片作為空白對照（CK），干燥備用。無菌條件下，將供試樣品浸泡干燥濾紙片用無菌鑷子放置在含菌平板上，每個平皿放置4 片，且間隔一定的距離，然后將培養皿置于恒溫生化箱37 ℃培養24 h，最后觀察菌落生長情況，并用精密測量尺測定抑菌圈直徑。

抑菌活性大小依據抑菌圈試驗判定標準：即抑菌圈直徑大于20 mm，為極度敏感；抑菌圈直徑介于15 mm～20 mm 之間，為高度敏感；抑菌圈直徑介于10 mm～14 mm 之間，為中度敏感；抑菌圈直徑介于7 mm～9 mm 之間，為低度敏感；小于7 mm為不敏感；直徑越大抗菌活性越強。

1.3 數據處理與分析

所有試驗重復3 次，利用Excel2007、IBM SPSS Statistics 19 進行數據統計和方差分析。

2 結果與分析

2.1 石油醚萃取物抑菌效果

赤霞珠葡萄籽95%乙醇總提取物石油醚萃取物在質量濃度為0.20 g/mL、0.10 g/mL、0.05 g/mL3 個水平下對3 種典型細菌的生長有一定的影響，結果如下頁表1 所示。

從表1 中可以看出，石油醚萃取物質量濃度為0.20 g/mL、0.10 g/mL 時對金黃色葡萄球菌有較好的抑菌效果，達到了中等抑菌效果，而當質量濃度為0.05 g/mL 時抑菌作用不明顯。石油醚萃取物對大腸桿菌抑菌作用不明顯，在0.20 g/mL、0.10 g/mL 濃度下，雖然表現出一定的抑菌作用，但抑菌圈直徑均小于7 mm，說明大腸桿菌對這2 個濃度的萃取物不敏感。同樣，枯草芽孢桿菌對3 個濃度梯度的樣品液均不敏感。

表1 赤霞珠葡萄籽95%乙醇總提取物石油醚萃取物的抑菌活性

2.2 乙酸乙酯萃取物抑菌效果

從表2 中可以看出，乙酸乙酯萃取物對大腸桿菌沒有抑菌作用，對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌在樣品質量濃度為0.20 g/mL 時表現出較弱的抑制作用，低于0.20 g/mL 時無抑菌效果。

表2 葡萄籽95%乙醇總提取物乙酸乙酯萃取物的抑菌活性

2.3 正丁醇萃取物抑菌效果

從表3 中可以看出，正丁醇萃取物對金黃色葡萄球菌表現出明顯的抑菌效果，樣品質量濃度為0.20 g/mL 時，抑菌圈的直徑到達21.3 mm 以上，表現出極強的抑菌效果，樣品質量濃度為0.05 g/mL時，抑菌圈直徑在15 mm～20 mm 之間，說明對菌體高度敏感。質量濃度為0.20 g/mL、0.10 g/mL 正丁醇萃取物對金黃色葡萄球菌的抑菌效果與對大腸桿菌的抑菌效果無顯著差異，但對枯草芽孢桿菌的抑菌效果具有顯著差異；質量濃度為0.05 g/mL 的樣品對3 種菌種的抑菌效果均具有顯著性差異。金黃色葡萄球菌和大腸桿菌對正丁醇萃取物的敏感性明顯強于枯草芽孢桿菌。

表3 葡萄籽95%乙醇總提取物正丁醇萃取物的抑菌活性

2.4 赤霞珠葡萄籽各溶劑萃取物的抑菌活性分析

赤霞珠葡萄籽各極性萃取物在質量濃度為0.20 g/mL 時對3 種典型的腐敗菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌）的抑菌活性結果如下頁圖1 所示。

由圖1 可知，赤霞珠葡萄籽各極性萃取物對三種典型腐敗菌的抑菌能力由強到弱為：正丁醇萃取物>石油醚萃取物>乙酸乙酯萃取物，結果表明，發揮主要抑菌能力的活性成分主要集中在高極性的正丁醇萃取物中，因此，在后續分析、分離及應用研究中，可將正丁醇萃取物作為重點研究對象。

圖1 赤霞珠葡萄籽各溶劑萃取物的抑菌活性

3 討論

植物提取物對不同微生物有不同程度的抑制效果，同一種植物提取的活性物質對不同細菌的抑制程度不一樣，同一細菌對不同提取物的敏感性亦有差異。Subramanian M 等研究表明，葡萄籽中含有的白藜蘆醇等酚類化合物具有抑菌活性；此外，葡萄籽中含有的原花青素也屬于多酚類化合物，也具有一定的抑菌活性。本試驗研究了赤霞珠葡萄籽不同溶劑提取物對3 種典型細菌的抑菌效果，結果表明，葡萄籽95%乙醇總提取物石油醚萃取物對革蘭氏陽性菌（特別是金黃色葡萄球）抑菌活性強，對革蘭氏陰性菌抑菌效果較弱；葡萄籽95%乙醇總提取物正丁醇萃取物對3 種典型菌表現出較強的抗菌活性，這可能是由于正丁醇萃取物含有大量生物堿、多酚之類的大極性化合物，對細菌有較明顯的廣譜抑菌作用；與正丁醇、石油醚萃取樣品相比，乙酸乙酯萃取物對3 種細菌的抑菌效果最差。各極性萃取物的抑菌能力由強到弱為：正丁醇萃取物>石油醚萃取物>乙酸乙酯萃取物。枯草芽孢桿菌對所有樣品溶液的敏感性均弱于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，這可能是因為芽孢對外界不良環境抵抗能力較強的緣故。

赤霞珠品種在寧夏賀蘭山東麓地區的種植面積占到紅色品種的70%以上，本試驗對赤霞珠葡萄籽提取物的抑菌活性進行了初步研究，為葡萄籽的開發利用及其作為抑菌劑在食品保鮮加工中的應用提供一定的理論基礎。