調控質粒拷貝數優化釀酒酵母異源合成真菌聚酮10,11-dehydrocurvularin

嚴豪，王志遠，龐子萱，林蘋鑫，吳疆，李業*，白仲虎*

1(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)2(糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)

聚酮類化合物(polyketides)是細菌、真菌及植物產生的一類次級代謝產物[1]，由聚酮合酶(polyketide synthase，PKSs)以酰基-輔酶A(coenzyme A，CoA)為前體進行連續縮合，經環化、修飾最后釋放的一類天然產物。其中真菌是該類次級代謝產物的主要來源[2]。許多聚酮類化合物因其具有重要而豐富的生物活性而在臨床上得到了廣泛的應用，如抗菌的紅霉素、抗癌藥物阿霉素、殺蟲劑多殺菌素、抗寄生蟲藥物阿維菌素以及免疫抑制劑雷帕霉素等[3]。10,11-dehydrocurvularin屬于二羥基苯乙酸內酯[4](dihydroxyphenylacetic acid lactones，DAL)類化合物，其因具有熱休克活性擁有優異的廣譜抗腫瘤活性[5]。目前的研究方向大多為改造聚酮合酶以獲得結構多樣性的活性分子[6-7]，已發現的一些聚酮類活性化合物普遍存在生產成本高、天然宿主產量低的問題。

近年來，微生物代謝工程的發展使得一些生產成本昂貴的藥物低成本化、高效率化[8]。釀酒酵母作為最簡單且安全的真核模式菌株[9]，人們對其的分子生物學改造手段及應用十分豐富。釀酒酵母在食品和發酵過程中用于生產酒精飲料和面包的歷史悠久[10]，已被廣泛用于代謝途徑改造、外源合成真核生物代謝產物，是食品、醫藥和生物能源方面的重要生產用微生物[11]。釀酒酵母BJ5464-NpgA(MATαura3-52his3-Δ200leu2-Δ1trp1pep4∶HIS3prb1Δ1.6Rcan1GAL)是一種生產聚酮類化合物的合適宿主[12]。Pep4和Prb1的功能缺陷能有效降低外源蛋白的降解；引入了一個來源于其他真菌中的泛酰基轉移酶NpgA，該酶能夠活化真菌聚酮類化合物合成酶(PKSs)里的酰基載體蛋白(acyl carrier protein，ACP)結構域。

質粒是游離在基因組之外的環狀DNA分子，質粒的拷貝數越高，意味著跟隨質粒的外源基因復制越多，相對而言外源基因表達得到的蛋白就會越多。同時，通過可控質粒拷貝數，調整多酶體系的不同酶的通量，優化目標產物的代謝途徑。對于質粒拷貝數的研究，目前，LIAN等[13]以釀酒酵母INVSc1為出發菌株，篩選出了具有拷貝梯度的幾種篩選標記，使用該體系組合優化正丁醇代謝途徑，產量較出發菌株提高了100倍。也有研究構建了拷貝數依賴的方式在酵母中表達赤點石斑魚壞死病毒衣殼蛋白，與野生型菌株相比產量增加了150倍[14]。本研究在釀酒酵母BJ5464-NpgA異源表達來源于Aspergillusterreus的聚酮化合物合酶(S1與S2)，以得到產物10,11-dehydrocurvularin，并通過截短啟動子構建轉錄結合缺陷的整合盒，使用抗生素篩選壓調控質粒拷貝數，以此優化產物合成途徑獲得更高產量。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒和引物

釀酒酵母BJ5464-NpgA、原始質粒pXK30-FLAG 30F、pXW06-FLAG 06F，攜帶土曲霉來源的聚酮合酶基因片段的質粒pYX003-pXW06F_AtF7_RedPKS、pYX004-pXK30F_AtF7_nrPKS來自亞利桑那大學；質粒pYTK-034、pYTK-077、pYTK-079通過Addgene向加州大學伯克利分校生物工程系購買，所用的大腸桿菌DH5α由本實驗室保藏。在本研究中使用的質粒如表1所示，本文中所用到的引物見表2，因KanMX和HygB抗生素表達盒的啟動子均為AgTEF Promoter，其20 bp截短及更長的截短的擴增引物均完全在啟動子上，兩者的5′到3′端引物可通用；且兩者所用終止子均為AgTEF Terminator，其截短標記的3′到5′端引物可通用。引物合成以及質粒測序由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。

表1 本研究使用的質粒Table 1 Plasmids used in this study

表2 本研究所用的引物Table 2 Primers in this study

1.2 酶和試劑

所有限制性內切酶，Thermo Fisher Scientific；2×Es Taq MasterMix(Dye)，北京康為世紀生物科技有限公司；DNA高效連接液，TaKaRa公司；同源重組酶、HiScript II Q Select RT SuperMix for qPCR，諾唯贊公司；質粒提取試劑盒、PCR產物純化試劑盒、膠回收試劑盒，Axygen公司；遺傳霉素、潮霉素、酵母DNA提取試劑[V(酚)∶V(氯仿)∶V(異戊醇)=25∶24∶1]，北京索萊寶科技有限公司；氨芐青霉素，上海生工；酵母-Trp/-Ura雙缺培養基，上海懋康生物科技有限公司；10,11-dehydrocurvularin標準品，Toronto Research Chemicals。

1.3 培養基和搖瓶培養條件

大腸桿菌使用LB培養基在37 ℃培養，抗生素使用氨芐青霉素，終質量濃度為50 μg/mL。釀酒酵母使用YPD(質量分數為1%酵母提取物+2%蛋白胨+2%葡萄糖)與合成培養基在250 mL 搖瓶中培養，裝液量50 mL，接種量2%，培養溫度為30 ℃，轉速為220 r/min。使用深孔培養板進行培養時，裝液量為2 mL，其他條件同上。

1.4 質粒構建

為得到攜帶mruby2熒光的表征載體pBL001-30F-mruby2，用引物mruby2-F/mruby2-R擴增兩端帶有pXK30-FLAG 30F質粒的同源臂的mruby2基因片段。將擴增片段與SwaI內切酶線性化過的pXK30-FLAG 30F質粒利用同源重組酶重組，轉化至大腸桿菌感受態，挑取單克隆測序驗證。

用內切酶PstI和XbaI線性化質粒pBL001-30F-mruby2。利用相應引物對質粒pYTK-077擴增得到不同截短長度啟動子的KanMX表達盒片段，對質粒pYTK-079擴增得到不同截短長度啟動子的HygB表達盒片段，將表達盒片段使用內切酶PstI和XbaI酶切處理后，使用DNA連接酶連接線性化質粒pBL001-30F-mruby2和表達盒片段，轉化大腸桿菌，測序驗證得到30F-mruby2-Kan系列和30F-mruby2-Hyg系列質粒。

用內切酶SbfI對pYX003-pXW06F_AtF7_RedPKS和pYX004-pXK30F_AtF7_nrPKS進行線性化。利用相應引物對質粒pYTK-077擴增得到不同截短長度啟動子的KanMX表達盒片段，對質粒pYTK-079擴增得到不同截短長度啟動子的HygB表達盒片段，將表達盒片段使用內切酶SbfI酶切處理后，使用DNA連接酶連接線性化質粒pYX003-pXW06F_AtF7_RedPKS和不同截短長度啟動子的KanMX表達盒片段，不同截短長度啟動子的HygB表達盒片段與線性化質粒pYX004-pXK30F_AtF7_nrPKS連接，轉化至大腸桿菌感受態，挑取單克隆測序驗證得到06F-003-Kan系列質粒和30F-004-Hyg系列質粒。

1.5 mruby2熒光蛋白強度的測定

將質粒pBL001-30F-mruby2、pXW06-FLAG 06F使用醋酸鋰轉化法[16]轉化至BJ5464-NpgA，使用-Trp/-Ura雙缺缺陷型固體培養基進行篩選，每個轉化從瓊脂培養基上挑取3個單克隆，使用24孔深孔板在合成培養基中進行預培養，以2%轉接至含300 mg/L相應抗生素的YPD培養基中培養24 h，吸取10 μL發酵液加190 μL去離子水稀釋在酶標板里，使用酶標儀測定OD600和熒光強度。激發波長為559 nm，發射波長為600 nm。

1.6 總DNA的提取及實時熒光定量PCR

收集約OD600=20的菌體至破碎管中，加入與細胞體積相當的酸性玻璃球，加400 μL STES(20 mmol/L Tris，50 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，pH=7.5)溶液，再加400 μL 酵母DNA提取試劑，劇烈振蕩10×30 s，每次間隔30 s，置于冰上。加入200 μL TE吹吸混勻，10 000 r/min離心5 min，溶液分4層，吸取最上層300 μL至1.5 mL離心管中，加入10%體積分數的3.0 mol/L醋酸鈉，2倍體積無水乙醇，稍混勻，在-80 ℃靜置30 min后，10 000 r/min離心10 min棄上清液。加入500 μL無水乙醇洗滌，10 000 r/min離心5 min，棄盡上清液，55 ℃干燥DNA 20 min，加入40 μL TE(含RNase 20 μg/mL)，在55 ℃水浴30 min以消化RNA，得到無RNA雜質的釀酒酵母總DNA。

得到上述的總DNA后，將其質量濃度稀釋為100 ng/μL，用于qPCR分析。以染色體上的ALG9基因作為內參基因，使用絕對定量法[17-18]分別測定目標基因KanamycinR和HygromycinR的拷貝數與Ct值的標準曲線。

1.7 在釀酒酵母BJ5464-NpgA中合成10,11-dehydrocurvularin

將攜帶Aspergillusterreus來源的聚酮合酶基因片段的質粒pYX003-pXW06F_AtF7_RedPKS、pYX004-pXK30F_AtF7_nrPKS轉化至BJ5464-NpgA[15]，每個轉化從瓊脂培養基上挑取3個單克隆，在多孔板接種2 mL合成培養基中，30 ℃，220 r/min 搖床培養1 d。隨后以2%的接種量轉接至2 mL合成培養基中，30 ℃，220 r/min 搖床培養2 d。

1.8 發酵產物的處理及HPLC檢測方法

使用鹽酸將發酵液pH值調節至5，在12 000 r/min 下離心10 min，用等體積的乙酸乙酯萃取上清液3次，取500 μL進行真空離心濃縮，濃縮物使用100 μL甲醇溶解，12 000 r/min離心10 min，取上清液進行HPLC分析，進樣量為20 μL。

HPLC分析程序：0～5 min流動相為體積分數為5%的乙腈和95%的0.1%乙酸溶液，5～15 min流動相為乙腈在0.1%乙酸溶液的線性梯度為5%～95%，15～25 min流動相為95%的乙腈和5%的0.1%乙酸溶液；流速為0.8 mL/min；島津inertsustain?C18色譜柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)；檢測波長為300 nm[19]。

1.9 優化10,11-dehydrocurvularin合成途徑以提高產量

將攜帶Aspergillusterreus來源的聚酮合酶基因片段且整合了抗生素抗性基因整合盒的質粒轉化至BJ5464-NpgA，每個轉化從瓊脂培養基上挑取3個單克隆，使用24孔深孔板在SC培養基中進行預配養，以2%接種量轉接至添加相應抗生素的SC培養基中培養48 h，發酵液的處理與產物檢測方法如上。

2 結果與分析

2.1 轉錄結合缺陷抗生素抗性基因整合盒的構建

將mruby2基因利用同源重組整合到pXK30-FLAG 30F得到質粒pBL001-30F-mruby2，經測序驗證后，在質粒pBL001-30F-mruby2基礎上構建轉錄結合缺陷抗生素抗性基因整合盒如圖1-a和圖1-b所示，將構建的質粒分別用XbaI和PstI酶切,結果如圖1-c和圖1-d所示，所的條帶大小與理論值相符，測序結果表明表達盒已成功構建。

2.2 轉錄結合缺陷抗生素抗性基因整合盒的mruby2表征

將帶有mruby2的整合盒里的質粒轉化至BJ5464-NpgA表達，在抗生素質量濃度都為300 mg/L的YPD中發酵，結果如圖2所示。結果表明，截短抗生素抗性基因的啟動子會使得在同一個質粒上的熒光蛋白基因表達增強，且熒光蛋白的強度與啟動子長度一定程度上呈負相關。

2.3 拷貝數絕對定量的標準曲線的建立

根據已報道的方法分別構建2種基因標準曲線所需的單拷貝質粒。在KanamycinR基因和ALG9基因是單拷貝的質粒中，KanamycinR基因和ALG9基因標準曲線見圖3-a，KanamycinR基因標準曲線的回歸方程為y=-3.221x+35.92(R2=0.996 3)，ALG9基因的標準曲線的回歸方程為y=-3.329x+35.83(R2=0.995 9)；在HygromycinR基因和ALG9基因是單拷貝的質粒中，HygromycinR基因和ALG9基因的標準曲線見圖3-b，HygromycinR基因標準曲線的回歸方程為y=-3.267x+36.75(R2=0.996 0)，ALG9基因的標準曲線的回歸方程為y=-3.344x+36.28(R2=0.994 2)。

2.4 實時熒光定量PCR測定質粒拷貝數

按照方法1.6提取帶熒光蛋白的重組菌的總DNA并進行實時熒光定量PCR測定質粒拷貝數，經定量換算后的質粒拷貝數結果如表3和表4所示。從結果中可以看出，通過截短抗生素抗性基因的啟動子，轉錄結合缺陷使得其耐抗生素能力下降，細胞會通過增加質粒拷貝數來維持一定水平的耐抗生素能力。在一定范圍內，熒光強度隨著抗生素抗性基因啟動子越短而增強，是因為熒光蛋白基因mruby2的拷貝數在增加。

表3 RT-PCR檢測KanMX整合盒質粒拷貝數Table 3 RT-PCR to detect the plasmid copy number of truncated KanMX

表4 RT-PCR檢測HygB整合盒的質粒拷貝數Table 4 RT-PCR to detect the plasmid copy number of truncated HygB

2.5 10,11-dehydrocurvularin的合成與檢測

帶有質粒pYX003-pXW06F_AtF7_RedPKS、pYX004-pXK30F_AtF7_nrPKS的BJ5464-NpgA菌株與對照菌株在SC培養基發酵2 d的發酵產物經HPLC處理結果如圖4所示。在標準品的HPLC結果對比下，表明10,11-dehydrocurvularin成功在釀酒酵母中合成。

2.6 使用優化10,11-dehydrocurvularin合成途徑以提高產量

將分別攜帶1種轉錄缺陷表達盒與聚酮合酶的兩類質粒進行組合轉化至BJ5464-NpgA表達，共有5×5即25種組合。每個轉化挑取3個單克隆，使用24孔深孔板在SC培養基中進行預培養1 d，以2%轉接含300 mg/L G418與300 mg/L潮霉素B的SC培養基中培養2 d，經上述處理方法后，測得其發酵產量如圖5所示。

在2種抗生素基因啟動子完整的情況下，10,11-dehydrocurvularin產量為0.098 8 mg/L，在使用整合盒的情況下，產量最高的組合能使產量達到0.359 mg/L，是對照組即完整啟動子組合的3.63倍。

3 結論與討論

已有報道質粒拷貝數一定程度與目標蛋白表達量成正相關[20]。本研究顯示出所使用的轉錄結合缺陷抗生素抗性基因整合盒或許能夠作為一種提高質粒拷貝數從而增強基因表達元件被開發[13]。其獨立性和通用性仍需從2個方面進行考量：拷貝數的變化是否獨立于待表達基因、應用到原核生物是否可行。即不同基因攜帶轉錄結合缺陷抗生素抗性基因整合盒是否具有相同的增強功能，在不同的宿主內使用這種方法能否達到相同的效果。

異源表達生產有價值的產品有很大的優勢，以截短側耳素為例，截短側耳素是一種由擔子菌產生的抗生素，其在天然宿主中的產量不足以用于遺傳改造，但其在米曲霉中的異源表達使效價提高了2 000%，這使得這種重要抗生素首次可持續生產[6]。除了本文使用的調控質粒拷貝數來優化聚酮類化合物產量的方法，也有一些研究是通過優化氧化代謝途徑提高產量[1]。氧化，是聚酮類化合物翻譯后修飾的重要步驟[3]，而大腸桿菌由于缺少一些后修飾功能，不是普適性的聚酮類化合物異源表達宿主[21]。

本課題在釀酒酵母中異源表達來自土曲霉的聚酮合酶合成10,11-dehydrocurvularin，并對該酶的代謝途徑進行了優化，提高產量。本研究發現，該表達盒在KanamycinR和HygromycinR基因啟動子分別為完整長度和100 bp時異源合成10,11-dehydrocurvularin能獲得最大產量，最高產量約為0.359 mg/L。我們可以發現，并非合成酶基因拷貝越多，產量越高，發酵過程中合理的資源利用更有利于目的產物的合成。此研究將有利于今后非天然聚酮化合物的發現及優化生產，隨著越來越多的聚酮類化合物的活性被挖掘出來，如何去大量獲取這些活性分子是不可缺少的研究方向。