福州市新型冠狀病毒全基因組測序和進化分析

陳智偉 姚栩 謝乃鴻 陳艷 張曉陽

摘要：目的 全基因組測序用于福州地區2019新冠病毒（nCov-2019）病原的基因組進化分析。方法 構建捕獲法-病毒全基因組測序方法，利用Tn5酶能夠設別切割雙鏈DNA并掛上特定標簽的特性構建SARS-cov2的測序文庫，使用MiSeq進行測序。結果 我們對5例CT值低于35的新冠核酸陽性標本進行建庫，獲得3株（FZ20LG957、FZ20LG1462和FZ20LG398）覆蓋率大于95%的病毒株序列。討論 課題數據可用于提高新型冠狀病毒監測網絡的監測能力。

【中圖分類號】R563.1 【文獻標識碼】A 【文章編號】1673-9026（2021）07-409-01

介紹

2019年12月，中國湖北省武漢市出現了一種新型冠狀病毒[1]被指定為嚴重急性呼吸系統綜合癥冠狀病毒2（SARS-CoV-2），該疾病被稱為冠狀病毒病2019（COVID-19）。世界衛生組織宣布該疾病為國際關注的突發公共衛生事件[2]，該項研究中，我們進行全基因組測序，并應用于SARS-CoV-2的臨床標本。

方法

標本采集

標本的收集與前處理：收集福州地區新型冠狀病毒qPCR陽性的標本5份，進行RNA提取并采用Random引物進行反轉錄（去人基因組gRNA的試劑）。

構建捕獲法-病毒全基因組測序方法

利用多重擴增方案快速擴增新冠病毒的全基因組序列，利用Tn5酶能夠設別切割雙鏈DNA并掛上特定標簽的特性構建SARS-cov2的測序文庫，使用MiSeq進行測序，并對下機數據通過生物信息學方法進行分析獲得福州地區SARS-cov2的全基因組序列。將福州地區的序列信息與各地公開數據比對探索福州地區新冠肺炎病人的來源。

系統發育和序列分析

結果：

我們采集的5份新冠核酸陽性標本，進行測序建庫，其中覆蓋率高于95%的病毒有三株分別是FZ20LG957、FZ20LG1462和FZ20LG398。我們進一步下載了所有完整和高覆蓋率的基因組截至2020年3月14日來自GISAID的序列。一株參考菌株（登錄號MN908947.3）從GenBank（NCBI）下載。使用MAFFT對3個序列進行比對（版本7.427）進行進一步分析。系統發育系統進化樹顯示福州的SARS-CoV-2病毒基因組位于和武漢標準株進化枝中（圖1）。這三株的與武漢新冠標準株的同源性高達99.5%、99.2%和98.9%。最分散的應變3個福州病毒序列中有FZ20LG957，顯示9個核苷酸變化（與FZ20LG1462相比）（導致5個氨基酸變化）。值得注意的是，我們在基因組位置27，848-發現了32個核苷酸（nt）序列的缺失FZ20LG1462中的27，894-27，927。

圖1. FZ20LG957、FZ20LG1462和FZ20LG398三株新冠病毒株基因組進化分析

討論

這項研究完成了3株病毒株基因組測序。利用MAGE-X軟件中的Neighbor-Joining tree構建溯源樹探究福州地區主要的病毒來源地區。通過系統發育樹分析表明這些序列位于不同的進化枝，根據測序獲得的序列和已公開序列構建fasta格式文件。3個基因組中觀察到更少的核苷酸差異。我們檢測到一個32 nt缺失，幾乎覆蓋了該序列的整個開放閱讀框。一個相似的據報道，新加坡有8名住院患者接受了觀察。在SARS冠狀病毒2003年爆發期間，觀察到ORF8缺失，這與減少人細胞中病毒復制的能力[3-4]。基因組這些病毒的變異被認為有助于成功適應環境。進一步的研究是需要調查SARS-CoV-2 nsp14在復制保真度中的功能[5]。從不同位置及時共享SASR-CoV-2的完整基因組對于監測病毒的遺傳變化，這些變化可能與病毒傳播和臨床表現[6]。我們確定了福州不同地區的SARS-CoV-2序列進化枝。

參考文獻：

[1]Zhu N， Zhang D， Wang W， Li X， Yang B， Song J， et al. A Novel Coronavirus from Patients 219 with Pneumonia in China， 2019. N Engl J Med. 2020 Feb 20;382（8）：727-33. 220

[2]Coronavirus disease （COVID-2019） situation reports. [cited 2020 March 26]; 221 https：//www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/situation-reports 222

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[4]Bolger AM， Lohse M， Usadel B. Trimmomatic： a flexible trimmer for Illumina sequence data. 225 Bioinformatics. 2014 Aug 1;30（15）：2114-20. 226

[5]Kim D， Langmead B， Salzberg SL. HISAT： a fast spliced aligner with low memory 227 requirements. Nat Methods. 2015 Apr;12（4）：357-60. 228

[6]Bankevich A， Nurk S， Antipov D， Gurevich AA， Dvorkin M， Kulikov AS， et al. SPAdes： a 229 new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. J Comput Biol. 230 2012 May;19（5）：455-77.

福州市科技局新冠肺炎項目 020-XG-026

作者簡介：陳智偉（1979-），男，博士研究生，主管技師，分子病毒學