上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌耐藥性及其耐藥基因檢測分析

高曉華 安偉 張明輝

摘要：【目的】掌握上海地區養殖凡納濱對蝦源副溶血弧菌的耐藥性及耐藥基因攜帶情況，并明確耐藥表型與耐藥基因間的相關性，為科學防控凡納濱對蝦副溶血弧菌病及揭示耐藥機制提供理論依據。【方法】通過K-B紙片擴散法檢測21株上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌對14種常見抗生素的敏感性，采用二倍稀釋法測定高度敏感抗生素對副溶血弧菌的最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC），并以PCR檢測其耐藥基因的攜帶情況，包括β-內酰胺類耐藥基因blaTEM和blaCARB、磺胺類耐藥基因 Sul II和Sul III、氨基糖苷類耐藥基因strA和strB、四環素類耐藥基因tetA及 I類整合子inT1基因?！窘Y果】21株上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌對14種常見抗生素表現出不同程度的多重耐藥性，六重耐藥1株（4.76%），五重耐藥3株（14.29%），四重耐藥5株（23.81%），三重耐藥8株（38.10%），二重耐藥4株（19.05%）;AMP/PG/SMX和PG/SMX為優勢耐藥菌譜。上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌對恩諾沙星的敏感率最高（90.48%），對應的MIC為0.10～1.60 μg/mL、MBC為3.20～12.80 μg/mL。blaTEM、blaCARB、Sul II、Sul III、strB和inT1等耐藥基因的檢出率分別為23.81%、71.43%、33.33%、19.05%、9.52%和23.81%，未檢測出strA和tetA基因。從21株上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌中共檢出11種耐藥基因型，其優勢耐藥基因型有blaCARB（28.57%）、blaCARB-blaTEM（14.29%）、blaCARB-Sul II（14.29%）和Sul III-inT1（9.52%）。除strA基因和tetA基因外，其余耐藥基因與其對應抗生素耐藥表型間均存在相關性，但其相關性不顯著（P>0.05）。【結論】上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌對14種常見抗生素表現出不同程度的敏感性，對恩諾沙星的敏感性最高，故可考慮將恩諾沙星作為上海地區凡納濱對蝦副溶血弧菌病防控的備選藥物。此外，針對對蝦源副溶血弧菌日趨嚴重的多重耐藥問題，應同時加強副溶血弧菌耐藥基因及整合子攜帶情況的監測，掌握其流行趨勢，以提高對蝦副溶血弧菌病的防控策略。

關鍵詞： 凡納濱對蝦;副溶血弧菌;耐藥性;耐藥基因;上海

中圖分類號： S945.49? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）03-0827-10

Resistance of Litopenaeus vannamei from Shanghai to Vibrio parahaemolyticus and detection and analysis of resistance genes

GAO Xiao-hua， AN Wei， ZHANG Ming-hui*

（Shanghai Fisheries Research Institute/Shanghai Fisheries Technical Extension Station， Shanghai? 200433， China）

Abstract：【Objective】In order to provide theoretical basis for scientific control of Vibrio parahaemolyticus disease in Litopenaeus vannamei and further reveal the antibiotics resistance mechanism of V. parahaemolyticus， the antibiotics resistance and the carrying status of related resistance genes were detected in V. parahaemolyticus isolated from L. vannamei in Shanghai， the correlation between resistance phenotype and resistance genes was also studied. 【Method】The susceptibility of 21 strains of V. parahaemolyticus （isolated from L. vannamei in Shanghai） against 14 common antibiotics were detected by K-B disc diffusion test， and the minimum inhibitory concentration（MIC） and minimum bactericidal concentration（MBC） of more sensitive antibiotics were determined by double dilution method. The carrying statuses of blaTEM and blaCARB of β-lactam resistance genes， Sul II and Sul III of sulfanilamide resistance genes， strA and strB of aminoglycoside resistance genes， tetA of tetracycline resistance genes and inT1 of integrons of class I genes in V. parahaemolyticus were detected by PCR method. 【Result】The 21 strains of V. parahaemolyticus showed multi-drug resistance to 14 antibiotics， which were one strain of resistance manifested to 6（4.76%）， three strains of resistance manifested to 5（14.29%）， five strains of resistance manifested to 4（23.81%）， eight strains of resistance manifested to 3（38.10%） and four strains of resistance manifested to 2（19.05%）. The dominant antibiotic resistance phenotypes were AMP/PG/SMX and PG/SMX. For the sensitivity rates of the tested antibiotics in the strains of V. parahaemolyticus，enrofloxacin was the most sensitive antibiotic（90.48%）. MIC and MBC of enrofloxacin were 0.10-1.60 μg/mL and 3.20-12.80 μg/mL. PCR results of resistance genes showed that the detection rates of gene blaTEM， blaCARB， Sul II， Sul III， strB and inT1 were 23.81%，71.43%，33.33%，19.05%，9.52% and 23.81%， respectively. strA and tetA were not detected . A total of 11 drug-resistant genotypes were detected from 21 strains of V. parahaemolyticus from L. vannamei in Shanghai， the dominant genotypes including blaCARB（28.57%）， blaCARB - blaTEM（14.29%）， blaCARB-Sul II（14.29%） and Sul III-inT1（9.52%）. Except strA and tetA， other resistance genes were correlated with their antibiotic resistance phenotypes， but the correlation was not significant（P>0.05）. 【Conclusion】The strains of V. parahaemolyticus isolated from L. vannamei in Shanghai showed different sensitivity levels to 14 antibiotics， enrofloxacin with the most sensibility. So， enrofloxacin can be considered as an alternative drug for the prevention and control of V. parahaemolyticus in L. vannamei in Shanghai. Besides， to solve the problem of multiple drug resistance of V. parahaemolyticus， detecting drug resistance genes and integrons in V. parahaemolyticus frequently and studying the trends are recognized as the effective strategies in V. parahaemolyticus prevention and control in L. vannamei.

Key words： Litopenaeus vannamei; Vibrio parahaemolyticus;? antibiotics resistance; resistance genes; Shanghai

Foundation item：Youth Talent Growth Plan Project of Shanghai Municipal Agricultural System（Hunongqingzi〔2017〕3-9）

0 引言

【研究意義】副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）為革蘭氏陰性菌，廣泛分布于海洋、河海交匯處及魚蝦貝類等水生動物體內，是多種水生動物的條件致病菌（李毅財等，2012;茆丹，2014）。近年來的研究表明，攜帶有特異質粒的副溶血弧菌是引起對蝦急性肝胰腺壞死病（Acute hepatopancreatic necrosis disease，AHPND）暴發的主要原因（Lee et al.，2015）。AHPND可造成養殖對蝦大批量死亡，嚴重制約對蝦養殖業的可持續健康發展（文國樑等，2015）。目前，抗生素治療仍是防治對蝦副溶血弧菌病的主要手段，但長期使用抗生素極易造成菌株多重耐藥現象加重及環境污染（Rodríguez-Blanco et al.，2012;Lopatek et al.，2018），已引起從業者們的高度重視。此外，副溶血弧菌能通過食物鏈傳播給人類，而引起食源性中毒，危及人體健康（陳志蕓等，2015）。因此，加強副溶血弧菌的耐藥性檢測及其耐藥機制研究，對指導人工養殖對蝦副溶血弧菌病科學防控和維護人類健康均具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】至今，針對人工養殖對蝦及魚源副溶血弧菌的耐藥性問題國外已有較多研究報道（de Melo et al.，2011;Mohamad et al.，2019）;國內也有學者對江蘇（張曉君等，2009）、廣西（黃偉德等，2018）及廣東（劉歡等，2018）等地的蝦源副溶血弧菌分離株進行耐藥性研究，并證實不同來源分離株的耐藥程度存在一定差異，部分菌株已出現多重耐藥現象。細菌多重耐藥性的形成與菌株攜帶相應耐藥基因及耐藥基因可隨質?；蛘献拥瓤梢苿舆z傳元件在細菌間水平傳播的機制密切相關（Ceccarelli et al.，2006）。blaTEM和blaCARB是β-內酰胺類常見耐藥基因，分別位于質粒和染色體上（Colomer-Lluch et al.，2011;Chiou et al.，2015）;Sul II和Sul III基因編碼二氫葉酸合成酶，介導細菌對磺胺類藥物的耐藥性，在質粒和染色體上均有檢出（喬毅等，2018）;strA和strB是常見的氨基糖苷類耐藥基因，編碼氨基糖苷類磷酸轉移酶（Kitiyodom et al.，2010;劉旭，2016）;tetA基因常位于質?；蜣D座子上，介導四環素類抗生素的耐藥性（Ng et al.，2001）;I類整合子（inT1）在細菌中最常見，能整合、捕獲外源耐藥基因，且可在細菌間進行水平轉移（Hall and Collis，1995）。黃偉德等（2018）通過檢測廣西凡納濱對蝦源副溶血弧菌對常見抗生素的敏感性及其耐藥基因攜帶率，結果顯示，廣西沿海凡納濱對蝦源副溶血弧菌對氟苯尼考最敏感，對磺胺二甲嘧啶和青霉素G耐藥性最強，其優勢耐藥基因型是ant（3"）-I ?Sul1+tet（A）?TEM ?和ant（3"）-I ?Sul1?tet（A）?TEM ?。趙姝等（2019）通過分析海南、江蘇及山東等地分離自海水患病水產動物源副溶血弧菌喹諾酮類藥物耐藥基因的分布狀況，發現副溶血弧菌對喹諾酮類藥物的耐藥表型與基因型存在明顯差異，其中外排泵抑制劑對副溶血弧菌喹諾酮類藥物的耐藥性具有顯著影響?！颈狙芯壳腥朦c】目前，有關凡納濱對蝦源副溶血弧菌的研究主要集中在分離株耐藥性與耐藥基因相關性方面（黃偉德等，2018;趙姝等，2019;賀曉晨等，2020），但鮮見針對上海地區養殖凡納濱對蝦源副溶血弧菌耐藥性及其耐藥基因檢測的相關研究?！緮M解決的關鍵問題】通過K-B紙片擴散法檢測分離自上海地區凡納濱對蝦源副溶血弧菌對常見抗生素的敏感性，運用PCR檢測副溶血弧菌耐藥基因的攜帶情況，分析耐藥表型與耐藥基因間的相關性，并測定敏感抗生素對凡納濱對蝦源副溶血弧菌的最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC），以期為科學防控凡納濱對蝦副溶血弧菌病及揭示其耐藥機制提供理論依據。

1 材料與方法

1. 1 菌株來源

2017—2020年從上海地區低鹽度淡化對蝦養殖場凡納濱對蝦肝胰腺部位分離得到21株副溶血弧菌，由上海市水產研究所病害防治科鑒定并采用甘油冷凍保存法保存于-80 ℃冰箱中。菌株按分離時間順序分別編號為1～21，菌株來源信息詳見表1。菌株藥敏試驗采用大腸埃希菌（Escherichia coli）ATCC25922為質控菌株。

1. 2 主要試劑

胰蛋白胨大豆肉湯培養基（TSB）和胰蛋白胨大豆瓊脂培養基（TSA）購自北京陸橋技術股份有限公司;Muller-Hinton瓊脂培養基（MHA）購自英國Oxoid公司，瓊脂糖、4S Red Plus核酸染色劑及4種抗生素（恩諾沙星、氟苯尼考、硫酸新霉素和鹽酸多西環素）購自生工生物工程（上海）股份有限公司;PCR Premix Taq、DL2000 DNA Marker及TaKaRa MiniBEST細菌基因組DNA提取試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司;14種常見抗生素藥敏紙片均購自英國Oxoid公司，包括青霉素G（PG，10 μg/片）、氨芐西林（AMP，10 μg/片）、磺胺甲噁唑（SMX，100 μg/片）、多西環素（DO，30 μg/片）、土霉素（OT，30 μg/片）、新霉素（N，30 μg/片）、鏈霉素（S，10 μg/片）、慶大霉素（CN，10 μg/片）、氯霉素（C，30 μg/片）、氟苯尼考（FFC，30 μg/片）、恩諾沙星（ENR，5 μg/片）、諾氟沙星（NOR，10 μg/片）、環丙沙星（CIP，5 μg/片）、紅霉素（E，15 μg/片），所有藥敏紙片置于4 ℃冰箱保存備用。

1. 3 菌株活化

無菌條件下，將-80 ℃保存的副溶血弧菌在室溫解凍后，接種至TSA培養基上，置于30 ℃恒溫培養箱培養24 h，挑取單個菌落接種至TSB液體培養基中，再置于30 ℃恒溫搖床（200 r/min）過夜培養，獲得的菌懸液用于藥敏試驗及細菌基因組DNA提取。

1. 4 藥敏試驗

采用K-B紙片擴散法檢測21株上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌對14種常見抗生素的藥敏性，參照美國臨床和實驗室標準協會（CLSL）抗生素敏感試驗標準進行判定，藥敏結果分別以S（敏感）、I（中介）和R（耐藥）進行記錄。

1. 5 最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）測定

根據藥敏試驗結果選取高度敏感的抗生素，采用試管二倍稀釋法，將抗生素分別加入含2.00 mL無菌TSB培養基的試管中，使其終質量濃度分別為0、0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.60、3.20、6.40、12.80、25.60、51.20、102.40和204.80 μg/mL，并設陰性對照組（空白無菌TSB培養基），然后接種菌懸液至終濃度為1.0×108 CFU/mL，置于30 ℃恒溫搖床（200 r/min）培養24 h，無菌生長的最高抗生素質量濃度即為MIC。從所有無細菌生長的各試管中分別取100 μL菌懸液，涂布于無菌TSA培養基上，置于30 ℃生化培養箱培養24 h，無菌生長的最低抗生素質量濃度即為MBC。

1. 6 耐藥基因檢測

1. 6. 1 基因組DNA提取 取適量活化菌懸液置于離心管內中，12000 r/min離心2 min，收集菌體，根據TaKaRa細菌基因組DNA提取試劑盒說明提取各菌株基因組DNA，利用酶標儀進行DNA濃度測定， -20 ℃保存備用。

1. 6. 2 引物設計與合成 參照Colomer-Lluch等（2011）、Chiou等（2015）的方法設計β-內酰胺類耐藥基因blaTEM和blaCARB的擴增引物，參照Pei等（2006）的方法設計磺胺類耐藥基因Sul II和Sul III的擴增引物，參照Kitiyodom等（2010）、劉旭（2016）的方法設計氨基糖苷類耐藥基因strA和strB的擴增引物，參照Ng等（2001）的方法設計四環素類耐藥基因tetA的擴增引物，參照左志晗等（2018）的方法設計整合子inT1基因的擴增引物，上述所有擴增引物（表2）均委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 6. 3 耐藥基因PCR擴增 PCR反應體系25.0 μL：PCR Premix 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，細菌基因組DNA模板2.0 μL，無菌雙蒸水補足至25.0 μL。設無菌雙蒸水為陰性對照模板。擴增程序：95 ℃預變性5 min;95 ℃ 30 s，退火30 s（具體退火溫度見表2），72 ℃ 60 s，進行35個循環;72 ℃ 延伸10 min。PCR擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳（130 V，30 min）檢測后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結果輸入GenBank中進行BLAST比對分析。

1. 7 數據分析

耐藥表型與耐藥基因間符合率（%）=攜帶耐藥基因且具有相應耐藥表型菌株數/相應耐藥表型菌株總數×100。菌株耐藥表型和耐藥基因的相關性采用SPSS 13.0進行費爾希精確檢驗。

2 結果與分析

2. 1 藥敏試驗結果

由表3可知，21株上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌對14種常見抗生素表現出不同程度的多重耐藥性，其中，六重耐藥1株（4.76%），五重耐藥3株（14.29%），四重耐藥5株（23.81%），三重耐藥8株（38.10%），二重耐藥4株（19.05%）。21株副溶血弧菌的耐藥菌譜分別是：AMP/PG/SMX占被檢測菌株總數的14.29%（3/21），PG/SMX占被檢測菌株總數的9.52%（2/21），其余依次為AMP/PG/SMX/CIP/S、AMP/PG/SMX/OT/CIP、PG/SMX/S、AMP/PG/CN、PG/E、AMP/PG/S/CN/SMX、AMP/PG/NOR、PG/SMX/CN、PG/AMP、AMP/PG/CN/SMX/E、AMP/PG/S/SMX、PG/SMX/E、PG/SMX/N、PG/SMX/E/S、AMP/PG/S/E和PG/SMX/OT，均占被檢測菌株總數的4.76%（1/21）。

21株上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌對14種常見抗生素的耐藥程度也存在一定差異（圖1），對青霉素G、磺胺甲噁唑、氨芐西林的耐藥率分別95.24%、71.43%和61.91%。21株副溶血弧菌對恩諾沙星、氟苯尼考、氯霉素和多西環素均呈敏感或中介，其中對恩諾沙星的敏感率最高（90.48%），其次為氟苯尼考（85.71%）和氯霉素（85.71%）;對新霉素、土霉素、慶大霉素、鏈霉素、環丙沙星和諾氟沙星的敏感率介于45.00%～70.00%。大部分上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌對紅霉素的敏感性為中介，其中介率為61.91%。

2. 2 MIC和MBC測定結果

根據藥敏試驗結果，選取高度敏感且水產養殖中允許使用的4種抗生素（恩諾沙星、氟苯尼考、多西環素和新霉素）進行MIC和MBC測定，結果表明，恩諾沙星對21株上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌的MIC為0.10～1.60 μg/mL，MBC為3.20～12.80 μg/mL;氟苯尼考對上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌的MIC為0.80～25.60 μg/mL，MBC為6.40～51.20 μg/mL;多西環素對上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌的MIC為0.20～12.80 μg/mL，MBC為3.20～25.60 μg/mL;新霉素對上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌的MIC為0.80～51.20 μg/mL，MBC為6.40～51.20 μg/mL。這4種抗生素對上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌的抑菌效果和殺菌效果排序為恩諾沙星>多西環素>氟苯尼考>新霉素。

2. 3 耐藥基因檢測結果

7種常見耐藥基因及I類整合子inT1基因的PCR擴增電泳結果見圖2。其中，β-內酰胺類耐藥基因blaTEM、blaCARB檢出率分別為23.81%（5/21）和71.43%（15/21）;磺胺類耐藥基因Sul II、Sul III檢出率分別為33.33%（7/21）和19.05%（4/21）;氨基糖苷類耐藥基因strB檢出率為9.52%（2/21），但未檢出strA基因;四環素類耐藥基因tetA也未檢出;整合子inT1基因檢出率為23.81%（5/21），且inT1陽性菌株均表現為多重耐藥表型，部分副溶血弧菌可同時對青霉素G、氨芐西林、環丙沙星、磺胺甲噁唑及鏈霉素等5種抗生素表現出耐藥表型。從21株上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌中共檢出11種耐藥基因型，分別為：blaCARB（28.57%）、blaCARB-blaTEM（14.29%）、blaCARB-Sul II（14.29%）、Sul III-inT1（9.52%）、bla-CARB-strB-Sul II-inT1（4.76%）、strB-Sul II-Sul III-inT1（4.76%）、blaCARB-inT1（4.76%）、blaTEM-Sul II（4.76%）、blaCARB-Sul III（4.76%）、blaTEM（4.76%）和Sul II（4.76%）。

2. 4 耐藥表型與耐藥基因型的相關性

由表4可知，在21株上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌中，青霉素G耐藥表型與blaCARB基因間的符合率為75.00%，與blaTEM基因間的符合率為20.00%;氨芐西林耐藥表型與blaCARB基因間的符合率為69.23%，與blaTEM基因間的符合率為23.08%;土霉素耐藥表型與tetA基因間的符合率為0，由于未檢測出對多西環素的耐藥菌株，故無法計算多西環素耐藥表型與tetA基因間的符合率;磺胺甲噁唑耐藥表型與Sul II基因間符合率為40.00%，磺胺甲噁唑耐藥表型與Sul III基因間符合率為20.00%;新霉素、鏈霉素、慶大霉素耐藥表型與strA基因、strB基因間符合率均為0;由于未檢測出strA基因和tetA基因，故無法計算新霉素、鏈霉素和慶大霉素耐藥表型與strA基因間的相關性，以及土霉素和多西環素耐藥表型與tetA基因間的相關性。除strA基因和tetA基因外，其余耐藥基因與其對應抗生素耐藥表型間均存在相關性，但其相關性不顯著（P>0.05）。

3 討論

近年來，我國學者針對不同地區蝦源副溶血弧菌耐藥性問題已開展了系列相關研究。魏文娟等（2020）對2017—2018年分離自江蘇和福建等地的蝦源副溶血弧菌進行耐藥性檢測，結果發現這些分離株對磺胺甲噁唑的耐藥率為66.70%。本研究結果表明，21株上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌對磺胺甲噁唑的耐藥率高達71.43%，究其原因是磺胺甲噁唑因具有廣譜抗菌作用、價格低廉等特點，被長期應用于水產養殖動物細菌性疾病防治，隨著時間積累在水體環境中的殘留問題日漸凸顯。汪濤等（2017）研究認為，養殖水環境中殘留的磺胺類藥物能誘導副溶血弧菌對其產生耐藥性。本研究中，上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌對青霉素G和氨芐西林均表現出較高耐藥性，與張曉君等（2009）對江蘇省凡納濱對蝦源副溶血弧菌耐藥性的研究結果相似，可能與菌株攜帶能水解β-內酰胺類抗生素的耐藥基因有關（Chiou et al.，2015）。此外，上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌對紅霉素、土霉素和新霉素等表現出不同程度的耐藥性，且多重耐藥比例為80.85%，明顯高于劉旭（2016）檢測2014—2015年分離自上海郊區弧菌分離株的多重耐藥比例（66.67%），表明副溶血弧菌多重耐藥問題已經較嚴重，且呈逐年持續增長的趨勢。上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌對恩諾沙星的敏感率為90.48%，對應的MIC、MBC分別為0.10～1.60和3.20～12.80 μg/mL，即恩諾沙星的抑菌和殺菌效果明顯優于其他抗生素，因此可考慮將其作為上海凡納濱對蝦副溶血弧菌病防控的備選藥物，但需謹慎選擇使用濃度，避免大劑量濫用，已減少抗生素殘留誘發水體細菌產生多重耐藥的風險。

在細菌耐藥表型與耐藥基因型相關性的研究中，喬毅等（2018）研究認為Sul基因通過編碼產生二氫葉酸合成酶，促使細菌失去對磺胺類藥物的敏感性，而介導細菌對磺胺類藥物耐藥。本研究結果表明，磺胺甲噁唑耐藥表型與Sul II和Sul III基因間的符合率分別為40.00%和20.00%，但在攜帶Sul基因（Sul II和Sul III）的10株副溶血弧菌中僅有2株對磺胺甲噁唑中介，說明Sul基因與副溶血弧菌對磺胺類耐藥表型間并非完全對應，可能與不同來源副溶血弧菌體內耐藥基因的拷貝量及耐藥基因有效表達程度存在差異有關。在本研究中，上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌的blaTEM基因檢出率為23.81%，高于廣西凡納濱對蝦源副溶血弧菌的檢出率（13.30%）（黃偉德等，2018），但低于寧波地區副溶血弧菌的檢出率（91.47%）（吳蓓蓓等，2011）;blaCARB基因檢出率高達71.43%，青霉素G、氨芐西林耐藥表型與bla-CARB基因間的符合率分別為75.00%和69.23%，青霉素G、氨芐西林耐藥表型與blaTEM基因間的符合率分別為20.00%和23.08%，說明上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌blaCARB基因產生β-內酰胺酶（CARB），可能是介導副溶血弧菌對青霉素G和氨芐西林耐藥的主要原因，也提示blaCARB基因在采樣區的養殖蝦塘內已廣泛流行，而養殖環境中的細菌是加速耐藥基因傳播的主要媒介。tetA基因是四環素類耐藥基因，其編碼產生的膜蛋白tetA可特異性將細菌胞內的四環素類藥物泵到胞外，以降低胞內藥物濃度，介導細菌對四環素類的耐藥性（Miranda et al.，2003）。在21株上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌中均未檢測到tetA基因，但仍有9.25%的試驗菌株對四環素類抗生素耐藥，與黃偉德等（2018）對廣西蝦源副溶血弧菌的研究結果相似。四環素類藥物耐藥機理除了tetA基因介導的外排泵耐藥機制外，還存在tetM和tetX等基因介導的四環素類鈍化及核糖體保護等其他作用機制（梁靜真等，2018;黃雪龍等，2019）。因此，上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌對四環素類的耐藥表型是否由其他耐藥基因介導產生尚有待進一步探究。strA和strB基因編碼產生鏈霉素鈍化酶，介導細菌對鏈霉素的耐藥性（楊元斌等，2011）。strB基因在上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌中的檢出率為9.52%，對鏈霉素、新霉素、慶大霉素的耐藥率分別為28.57%、23.81%和19.05%，耐藥基因與耐藥表型間的符合率為0。楊明偉等（2018）研究發現，在魚源鏈球菌中鏈霉素耐藥表型與ant（3'）-I基因間的符合率高達75.00%，氨基糖苷類的耐藥基因還包括aac（3'）-Ib、aph（3'）-Ia及aac（6'）-Ib等。本研究僅檢測strA基因和strB基因有一定局限性，今后應增加耐藥基因不同類型的檢測，而更有利于揭示菌株耐藥基因與耐藥表型間的相關性。inT1基因在上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌中的檢出率為23.81%，與李林桂（2013）、姚小娟（2014）的研究結果存在明顯差異，且攜帶inT1基因的菌株均出現多重耐藥表型，可能與整合子具有整合、捕獲外源耐藥基因的特性相關（Hall and Collis，1995）。因此，針對對蝦源副溶血弧菌日趨嚴重的多重耐藥問題，應同時加強副溶血弧菌耐藥基因及整合子攜帶情況的監測，掌握其流行趨勢，以提高對蝦副溶血弧菌病的防控策略。

本研究還發現，上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌對抗生素的耐藥表型與耐藥基因間的相關性并不顯著，究其原因可能是：①不同來源菌株的基因拷貝量存在明顯差異，以致部分低拷貝量的耐藥基因不能被檢出（石優章等，2007）。②細菌外膜蛋白參與啟動菌體的主動藥物外排系統，減少胞內藥物濃度而導致細菌耐藥（Matsuo et al.，2007）。③不同菌株耐藥基因轉錄與翻譯受其啟動子類別、強弱及距啟動子距離等多種因素的影響。如blaTEM基因位于質粒上，其上游啟動子有P3、P4及Pa/Pb等不同類別，尤其是P4啟動子能有效促進blaTEM基因轉錄與表達（Lartigue et al.，2002）。④菌株耐藥表型還由其他耐藥基因介導產生，當菌株所處環境不利于其生長時，可通過整合外源耐藥基因，調節下游基因的轉錄和表達以適應環境變化（袁璐等，2014）。⑤抗生素能誘導細菌耐藥形成，如嗜水氣單胞菌在多次低抑菌濃度的鹽酸沙拉沙星刺激下，可誘導產生對鹽酸沙拉沙星高耐藥性的菌株（黃新財等，2013）。綜上所述，菌株對抗生素的耐藥表型受諸多因素影響，且大部分耐藥基因可在菌株間水平傳播，勢必增加凡納濱對蝦副溶血弧菌病的防控難度和風險。因此，加強副溶血弧菌耐藥性及其耐藥基因的監測，可為科學防控凡納濱對蝦副溶血弧菌病及揭示其耐藥機制提供理論依據。

4 結論

上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌對14種抗生素表現出不同程度的敏感性，對恩諾沙星的敏感性最高，故可考慮將恩諾沙星作為上海凡納濱對蝦副溶血弧菌病防控的備選藥物。此外，針對對蝦源副溶血弧菌日趨嚴重的多重耐藥問題，應同時加強副溶血弧菌耐藥基因及整合子攜帶情況的監測，掌握其流行趨勢，以提高對蝦副溶血弧菌病的防控策略。

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（責任編輯 蘭宗寶）