基于體素的磁共振形態(tài)學(xué)腰椎間盤突出癥慢性下肢痛模型大鼠的實(shí)驗(yàn)研究

趙繼榮，薛旭，袁毓喆，陳祁青，陳文，張海清，趙寧，馬同，張?zhí)忑垼瑮顫?/p>

1.甘肅省中醫(yī)院脊柱骨科，甘肅蘭州730050；2.中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京210000；3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，甘肅蘭州730030

前言

腰椎間盤突出癥（Lumbar Disc Herniation,LDH）是因在外力作用下或椎間盤自身退變后纖維環(huán)破裂，髓核突出，刺激或壓迫脊髓、脊神經(jīng)根和馬尾神經(jīng)而引起腰部疼痛伴雙下肢疼痛、麻木的一系列證候群［1］。LDH是脊柱外科的常見病和多發(fā)病，也是引起腰腿痛的最主要原因，隨著人們生活方式和社會節(jié)奏的改變，LDH 的發(fā)病率不斷上升且呈年輕化態(tài)勢。Jordon 等［2］報(bào)道LDH 在普通人群中的發(fā)病率為1%～3%，以20～50 歲的人群患病率最高。Matsumoto等［3］發(fā)現(xiàn)人體椎間盤自20 歲開始出現(xiàn)蛋白多糖含量下降、髓核水分丟失、彈性纖維密度降低，并出現(xiàn)裂隙和不規(guī)則空洞等退變。LDH 后期出現(xiàn)的慢性疼痛、脊柱畸形、馬尾綜合征等嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量與工作能力，給家庭和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)［4］。

慢性腰腿痛是LDH 患者就醫(yī)的最主要原因之一，緩解疼痛是患者最主要的訴求。目前LDH 的治療方法主要有保守治療和手術(shù)治療這兩大療法。保守治療因無法從根本上解除致病因素而易致癥狀反復(fù)，遷延難愈。手術(shù)治療因?qū)怪Y(jié)構(gòu)破壞和巨大的心理創(chuàng)傷而不易被患者接受。無論是保守治療還是手術(shù)治療，遠(yuǎn)期療效都不盡人意。究其原因，可能與LDH 疼痛機(jī)制尚未完全闡明有很大關(guān)系。目前人們普遍接受的LDH 疼痛機(jī)制主要有：機(jī)械壓迫機(jī)制、炎癥化學(xué)刺激機(jī)制、自身免疫反應(yīng)機(jī)制。然而這3大機(jī)制不能完全解釋LDH 的所有臨床表現(xiàn)，現(xiàn)有的針對這3種機(jī)制的治療方法也缺乏有效的響應(yīng)。因此，研究LDH 致痛機(jī)制，尋找治療LDH 的新途徑和新靶點(diǎn)，切實(shí)提高臨床療效，具有深遠(yuǎn)的臨床意義和社會價值。

近年來，隨著腦形態(tài)學(xué)檢測和腦功能成像技術(shù)的進(jìn)步，大腦在疼痛中的作用日益受到重視。有研究發(fā)現(xiàn)慢性痛患者的大腦存在多個腦區(qū)的異常激活和功能連接的改變，甚至結(jié)構(gòu)的改變［5‐9］。基于體素的磁共振形態(tài)測量學(xué)（Voxel‐based Magnetic Resonance Morphometry, VBM）是使用最廣泛的方法，VBM是以體素為基礎(chǔ)的局部容積測量方法，是目前磁共振在腦形態(tài)學(xué)測量上的最主要應(yīng)用手段之一，經(jīng)過計(jì)算機(jī)后處理及對影像資料特殊分析以后，對于發(fā)現(xiàn)普通磁共振難以發(fā)現(xiàn)的慢性疼痛的腦形態(tài)及結(jié)構(gòu)的變化具有重要價值［10］。VBM已廣泛應(yīng)用于阿爾茨海默病、特發(fā)性全身性癲癇、注意力缺陷多動癥、精神分裂癥、帕金森病等領(lǐng)域的研究，同時VBM對于三叉神經(jīng)痛、偏頭痛、帶狀孢疹后神經(jīng)痛、膝骨性關(guān)節(jié)炎、慢性腰背痛等慢性疼痛的研究也屢見不鮮；但關(guān)于LDH 慢性下肢痛的VBM 研究尚不多見。本研究基于VBM 分析了LDH 慢性下肢痛模型大鼠腦結(jié)構(gòu)及形態(tài)改變的相關(guān)性及特點(diǎn)，揭示了LDH 慢性下肢痛的腦機(jī)制。

1 方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

選用SD雄性大鼠24只，6～8周齡，體質(zhì)量（250±20）g，由南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物合格證：SCXK（蘇）2011‐0003。實(shí)驗(yàn)倫理編號：1ACUC‐1905020。按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組（Normal組）、假手術(shù)組（Sham‐LDH 組）、模型組（LDH 組），每組8只。

1.2 主要儀器和試劑

電子VonFrey 測痛儀（美國IITC Life Science 公司）、熱板痛覺測試儀（美國IITC Life Science 公司）、7.0 T 動物專用核磁（德國Bruker 公司）、大鼠麻醉機(jī)（北京友誠生物科技有限公司）、電子天平等；異氟烷。

1.3 LDH組及Sham‐LDH組模型建立

參照Shamji等［11］采用自體髓核移植法建立LDH慢性下肢痛模型大鼠。以5%水合氯醛（40 mg?kg‐1）腹腔內(nèi)注射麻醉。麻醉生效后，剃毛器剔除大鼠尾椎至腰椎毛發(fā)，范圍約5 cm×4 cm，取俯臥位固定于解剖臺上，碘伏棉球以L4～L6 為中心皮膚消毒3 遍，取后正中縱行切口約2.5 cm，止血鉗輕提棘突旁肌肉，切開皮膚，自棘突右側(cè)用組織剪逐層分離皮膚、筋膜層、肌肉層，眼科鑷清理椎旁肌肉組織，充分暴露L5 右側(cè)椎板及乳狀突，彎頭止血鉗侵蝕法咬除L5右側(cè)椎板、橫突及乳狀突，暴露硬膜外腔及L5 神經(jīng)根，眼科鑷輕觸L5 神經(jīng)根誘發(fā)出右下肢神經(jīng)痛體征后，濕鹽水紗布塊填蓋切口。快速在距離大鼠肛門1 cm處斷尾，使用3‐0 尼龍縫線單層閉合尾部切口，依次切開髓核環(huán)，取出3 個尾椎髓核放置于刮匙中備用。再將取出的尾椎髓核壓迫于L5 神經(jīng)根側(cè)方，逐層縫合。Sham‐LDH 組僅暴露至硬膜外腔及L5 神經(jīng)根處，不斷尾，不放入髓核，逐層縫合切口。

1.4 疼痛行為學(xué)測定

1.4.1 機(jī)械痛閾值檢測檢測方法參照Cunha 等［12］采用的方法進(jìn)行。分別于建模前和建模后第2、7、14、21、28 天共6 個時間點(diǎn)檢測。將大鼠置于電子VonFrey測痛儀的半透明有機(jī)玻璃箱中，底為0.5 cm×0.5 cm 孔徑鐵絲網(wǎng)，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)15 min，然后用剛性測試頭刺激大鼠右足底中部，大鼠出現(xiàn)縮足、舔足行為即為陽性反應(yīng)，記錄陽性反應(yīng)讀數(shù)為機(jī)械縮足反射閾值（Mechanical Withdrawal Threshold,MWT），每只大鼠同一時間點(diǎn)測量5 次，每次測量間隔5 min，去掉1個最高值和1個最低值，取其平均值。

1.4.2 熱痛閾值檢測檢測方法參照Hargreaves 等［13］采用的方法進(jìn)行。分別于建模前和建模后第2、7、14、21、28 天共6 個時間點(diǎn)檢測。設(shè)置熱板痛覺測試儀的恒定溫度為49 ℃，將大鼠放置于熱板痛覺測試儀的半透明有機(jī)玻璃箱中，開啟記時按鈕，大鼠出現(xiàn)抬足、逃避、舔足視為陽性反應(yīng)，記錄開始至出現(xiàn)陽性反應(yīng)的時間為熱縮足反射潛伏期（Thermal Withdrawal Latency,TWL），截至?xí)r間為30 s，避免大鼠熱損傷。每只大鼠同一時間點(diǎn)測量5次，每次測量間隔5 min，去掉1 個最高值和1 個最低值，取其平均值。

1.5 VBM圖像采集

大鼠采用吸入性異氟烷混合氣體麻醉的方式，待麻醉生效后通過調(diào)節(jié)大鼠頭部固定器的活動齒桿和耳桿將大鼠放置并固定于磁共振立體定位平臺上，之后以0.1 mg/kg?h‐1維持麻醉，保持動物處于鎮(zhèn)靜狀態(tài)。應(yīng)用生理測量儀監(jiān)測其生命體征，呼吸頻率保持在40～50 次/min，維持在生理狀態(tài)下。應(yīng)用Bruker公司7.0 T動物MRI掃描儀進(jìn)行檢查，選用20 cm的梯度線圈。掃描參數(shù)如下：體素大小（0.5×0.5×0.5）mm3，TE=15 ms，TR=2 s，層厚=1 mm，層數(shù)=50，陣大小64×64，F(xiàn)OV=（3×3）cm2，使用GE EPI 序列。T2加權(quán)結(jié)構(gòu)像采集使用MDEFT序列。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究所得數(shù)據(jù)均采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述和推斷，其中服從正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，完全隨機(jī)設(shè)計(jì)組間比較采用單因素方差分析，重復(fù)測量設(shè)計(jì)組間比較采用重復(fù)測量方差分析，存在交互作用時采用簡單效應(yīng)分析，并采用GraphPad Prism7 軟件進(jìn)行作圖，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。影像學(xué)數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量方差分析，存在交互作用時采用事后檢驗(yàn)分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠基線資料比較

3 組大鼠間體質(zhì)量和鼠齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示具有可比性。詳見表1。

表1 3組大鼠基線資料比較（± s）Tab.1 Comparison of baseline data among 3 groups of rats(Mean±SD)

表1 3組大鼠基線資料比較（± s）Tab.1 Comparison of baseline data among 3 groups of rats(Mean±SD)

分組n 體質(zhì)量/g 鼠齡/周Normal組Sham‐LDH組LDH組F值P值8 88‐‐249.03±16.33 250.50±11.59 240.81±17.69 0.917 0.415 7.25±0.71 6.88±0.99 6.88±0.84 0.516 0.604

2.2 3組大鼠不同時間點(diǎn)MWT比較

經(jīng)重復(fù)測量方差分析，結(jié)果通過Mauchly球形度檢驗(yàn)（P=0.152）。采用球形度檢驗(yàn)結(jié)果，因分組與時間點(diǎn)存在交互作用（F組別×?xí)r點(diǎn)=43.488,P＜0.001），所以再采用簡單效應(yīng)進(jìn)行分析。詳細(xì)結(jié)果見表2。其中，F(xiàn)組別/F時點(diǎn)代表組別和時間點(diǎn)兩個因變量經(jīng)過重復(fù)測量方差分析的峰值，即F值；P組別/P時點(diǎn)代表組別和時間點(diǎn)兩個因變量經(jīng)過重復(fù)測量方差分析的Sig.值，即P值。

表2 3組大鼠不同時點(diǎn)MWT比較（± s）Tab.2 Comparison of mechanical withdrawal threshold in 3 groups of rats at different time points(Mean±SD)

表2 3組大鼠不同時點(diǎn)MWT比較（± s）Tab.2 Comparison of mechanical withdrawal threshold in 3 groups of rats at different time points(Mean±SD)

a表示與LDH組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05

時間點(diǎn)建模前建模后第2天建模后第7天建模后第14天建模后第21天建模后第28天Normal組38.72±4.83 38.24±2.84a 38.04±2.68a 38.44±1.62a 38.03±2.81a 38.37±2.05a Sham‐LDH組37.96±3.85 34.89±2.04a 35.75±2.17a 36.32±2.55a 37.85±2.63a 38.09±2.12a F組別/F時點(diǎn)P組別/P時點(diǎn)LDH組39.63±2.63 30.31±4.53 18.63±1.89 11.88±1.88 11.45±1.22 11.58±3.67 1 044.772/43.092＜0.001/＜0.001

3組大鼠建模前MWT比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；Sham‐LDH組大鼠MWT建模后第2、7、14、21、28天分別與Normal組大鼠比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；LDH組大鼠MWT從建模后第2天至第14天顯著降低，建模后第14天至28天，MWT穩(wěn)定；LDH組大鼠MWT建模后第2、7、14、21、28 天分別與Normal 組大鼠和Sham‐LDH 組大鼠比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 3組大鼠不同時間點(diǎn)TWL比較

經(jīng)重復(fù)測量方差分析，結(jié)果通過Mauchly球形度檢驗(yàn)（P=0.263）。采用球形度檢驗(yàn)結(jié)果，因分組與時間點(diǎn)存在交互作用（F組別×?xí)r點(diǎn)=18.966,P＜0.001），所以再采用簡單效應(yīng)進(jìn)行分析。詳細(xì)結(jié)果見表3。可見TWL分析結(jié)果與MWT分析結(jié)果相似。

表3 3組大鼠不同時點(diǎn)TWL比較（± s）Tab.3 Comparison of thermal withdrawal latency in 3 groups of rats at天ifferent time points(Mean±SD)

表3 3組大鼠不同時點(diǎn)TWL比較（± s）Tab.3 Comparison of thermal withdrawal latency in 3 groups of rats at天ifferent time points(Mean±SD)

a表示與LDH組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05

時間點(diǎn)建模前建模后第2天建模后第7天建模后第14天建模后第21天建模后第28天Normal組18.78±2.52 17.89±1.49a 18.09±1.28a 18.64±1.96a 18.34±1.27a 18.06±2.13a Sham‐LDH組18.93±2.32 16.04±2.49a 16.58±1.71a 17.58±0.86a 17.81±2.52a 17.86±1.20a LDH組18.58±1.96 12.02±1.58 8.62±1.41 5.91±1.24 6.11±1.43 6.03±1.03 F組別/F時點(diǎn)P組別/P時點(diǎn)595.871/24.632＜0.001/＜0.001

2.4 3組大鼠不同時間點(diǎn)VBM比較

3 組大鼠不同時間點(diǎn)腦結(jié)構(gòu)區(qū)域比較存在交互作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。本研究結(jié)果顯示灰質(zhì)體積減少的腦區(qū)有左下丘腦、左海馬下托、右次級運(yùn)動皮層、右紋狀體、右隔區(qū)、右海馬、雙側(cè)小腦分子層、胼胝體及雙側(cè)皮質(zhì)下灰質(zhì)。詳細(xì)結(jié)果見表4和圖1。

圖1 3組大鼠不同時間點(diǎn)灰質(zhì)體積減少的腦區(qū)域圖Fig.1 Brain regions of gray matter volume decreasing at different time points in 3 groups of rats

表4 3組大鼠不同時間點(diǎn)灰質(zhì)體積減少的腦區(qū)報(bào)告Tab.4 Report on brain regions of gray matter volume decreasing at different time points in 3 groups of rats

3 討論

3.1 動物模型的意義與疼痛機(jī)制評價

LDH 疼痛機(jī)制的研究與動物模型的成功建立密不可分。Mixter 等［14］于1934年提出椎間盤纖維環(huán)破、髓核組織突入椎管刺激和壓迫神經(jīng)根引起的慢性下肢痛是LDH 引起疼痛的神經(jīng)解剖學(xué)基礎(chǔ)，形成了LDH 致痛機(jī)制學(xué)說之一的機(jī)械壓迫機(jī)制。對小鼠、大鼠、兔、狗、綿羊、豬等多種動物實(shí)現(xiàn)機(jī)械壓迫機(jī)制理論指導(dǎo)的LDH 模型建立均獲得成功復(fù)制［15］。然而臨床實(shí)例證明機(jī)械壓迫機(jī)制并不是LDH 慢性疼痛產(chǎn)生的唯一機(jī)制。相當(dāng)一部分病例影像學(xué)提示有明顯的LDH 但并未產(chǎn)生下肢神經(jīng)根癥狀，也有一部分病例影像學(xué)未見椎間盤突出神經(jīng)根造成壓迫的征象卻產(chǎn)生嚴(yán)重的下肢根性痛。正常髓核組織位于纖維環(huán)和終板之間，閉合系統(tǒng)內(nèi)呈液體膠凍狀形態(tài)，無血液供應(yīng)，其主要營養(yǎng)物質(zhì)來源依賴于終板的彌散功能，因此基于椎間盤特殊的解剖結(jié)構(gòu)，認(rèn)為突出椎間盤具有自身免疫作用，當(dāng)髓核與盤外組織接觸時引起連鎖的體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)［16‐17］。此外Shamash 等［18］報(bào)道椎間盤組織可自身分泌炎性細(xì)胞因子如TNF‐α、IL‐1α/β、IL‐6 和IL‐17 等，這些炎性細(xì)胞因子促進(jìn)椎間盤內(nèi)有效生化成分降解，趨化因子產(chǎn)生和細(xì)胞形態(tài)改變［19］。國內(nèi)外學(xué)者采用物理方式誘導(dǎo)、化學(xué)方式誘導(dǎo)、基因修飾技術(shù)等多種手段實(shí)現(xiàn)以炎癥化學(xué)刺激和自身免疫反應(yīng)為理論基礎(chǔ)的建模方法［20‐21］。為更好地模擬臨床中椎間盤源性誘發(fā)慢性下肢痛的產(chǎn)生及疼痛的維持，更貼近臨床中LDH 的病理形式，本實(shí)驗(yàn)采用機(jī)械壓迫與炎性刺激共存的致痛機(jī)制，通過大鼠自體髓核移植法，將大鼠自體尾椎髓核直接移植壓迫于L5 神經(jīng)根，有效的動物模型成為研究LDH 慢性疼痛發(fā)生機(jī)制及腦功能改變的基礎(chǔ)與保證。

3.2 動物模型的驗(yàn)證與評估

對神經(jīng)根直接壓迫和尾椎髓核組織所分泌的炎性細(xì)胞因子對大鼠背根神經(jīng)節(jié)造成炎性浸潤的雙重致痛效果。使得LDH 組大鼠在術(shù)后產(chǎn)生一個長時程的MWT 和TWL 的降低，即出現(xiàn)了痛覺過敏，造模成功。有研究發(fā)現(xiàn)背根神經(jīng)節(jié)造成的機(jī)械壓迫對動物模型的機(jī)械痛覺與熱痛覺均會產(chǎn)生影響，痛覺過敏的產(chǎn)生時間的遲早和維持時程的長短與動物類型的選擇、手術(shù)方式和術(shù)后干預(yù)手段聯(lián)系密切［22‐23］；也有文獻(xiàn)報(bào)道，機(jī)械痛覺過敏和熱痛覺過敏有時并非同時存在［24］。本研究中的結(jié)果與多數(shù)研究者證實(shí)的機(jī)械痛閾值和熱痛閾值均下降并疼痛持續(xù)產(chǎn)生相一致。Kawakami 等［25］發(fā)現(xiàn)采用自體髓核移植方法但對硬膜外腔及神經(jīng)根不造成壓迫的情況下同樣會誘發(fā)機(jī)械痛閾值和熱痛閾值降低。痛覺過敏作為神經(jīng)損傷后的特征，弱刺激通過有髓鞘的粗神經(jīng)纖維上低閾值感受器誘發(fā)強(qiáng)烈疼痛，通過測量疼痛的閾值來間接量化疼痛的程度。綜上，本實(shí)驗(yàn)通過自體髓核移植法建立的LDH 慢性下肢痛大鼠模型在建模后產(chǎn)生了長時程的痛覺過敏現(xiàn)象，這與臨床上LDH 慢性下肢痛患者的表現(xiàn)和疼痛發(fā)生的病理形式相符合，并且疼痛行為學(xué)檢測進(jìn)一步驗(yàn)證模型的可行性，另外大鼠能耐受手術(shù)創(chuàng)傷，模型具有很好的可復(fù)制性。

3.3 VBM結(jié)果分析

利用VBM 腦形態(tài)學(xué)分析顯示，3 組大鼠不同時間點(diǎn)腦結(jié)構(gòu)區(qū)域比較存在交互作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。腦圖結(jié)果顯示灰質(zhì)體積（Gray Matter Volume, GMV）減少的腦區(qū)有左下丘腦、左海馬下托、右次級運(yùn)動皮層、右紋狀體、右隔區(qū)、右海馬、雙側(cè)小腦分子層、胼胝體及雙側(cè)皮質(zhì)下灰質(zhì)。紋狀體是大腦基底神經(jīng)節(jié)之一，是錐體外系的組成部分，主要的機(jī)能是調(diào)節(jié)肌肉張力、協(xié)調(diào)各種精細(xì)復(fù)雜的運(yùn)動。大量的證據(jù)表明，基底神經(jīng)節(jié)獨(dú)特參與丘腦‐皮質(zhì)‐基底神經(jīng)節(jié)回路以整合慢性疼痛對于運(yùn)動、情緒、自主神經(jīng)和認(rèn)知反應(yīng)等方面的痛覺信息［26］。次級運(yùn)動皮層的損傷或者失活會導(dǎo)致運(yùn)動或運(yùn)動學(xué)習(xí)過程產(chǎn)生障礙，但并不會影響機(jī)體的基本運(yùn)動機(jī)能［27］。但Bishop 等［28］認(rèn)為慢性骨骼肌疼痛是一種影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的疾病，該團(tuán)隊(duì)使用VBM 及牛津大學(xué)腦功能磁共振結(jié)構(gòu)神經(jīng)成像技術(shù)（FMRIB's Software Library, FSL）確定慢性骨骼肌疼痛患者外側(cè)前額葉皮層以及次級運(yùn)動皮層GMV 減少。海馬是介導(dǎo)疼痛應(yīng)激反應(yīng)的重要腦區(qū)，慢性疼痛可使海馬出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目減少、細(xì)胞萎縮、體積減小等多種神經(jīng)元可塑性受損的表現(xiàn)，同時伴隨抑郁、焦慮等情緒［29］。Jia 等［30］基于VBM 研究雄性大鼠偏頭痛引起的結(jié)構(gòu)性腦部改變，發(fā)現(xiàn)在海馬、胼胝體、基底節(jié)及感覺皮層等區(qū)域的GMV 減少。大量研究證實(shí)慢性疼痛可導(dǎo)致大腦區(qū)域形態(tài)或結(jié)構(gòu)改變，這對疼痛的感知和加工至關(guān)重要。疼痛不僅被理解為功能狀態(tài)的改變，而且還被理解為中樞神經(jīng)系統(tǒng)可塑性的結(jié)果。因此，LDH 慢性下肢痛作為慢性疼痛的一種，會導(dǎo)致LDH 模型大鼠腦部特定區(qū)域灰質(zhì)的改變，本研究可望能初步闡明LDH 慢性痛腦部形態(tài)學(xué)改變，揭示LDH慢性痛的腦機(jī)制，發(fā)現(xiàn)治療新靶點(diǎn)。