溫度開環和閉環反饋在高壓脈沖電場消融中的對照研究

張科，王杰

1.南京醫科大學醫學影像學院，江蘇南京210029；2.江蘇省人民醫院介入放射科，江蘇南京210029

前言

高壓脈沖電場消融是近年來由電氣與臨床生物物理學家提出并完成臨床醫學轉化的新技術［1］，其消融原理是利用高壓脈沖電場擊穿細胞膜引起不可逆穿孔造成細胞凋亡［2］。由于間斷式電流和超短脈寬的緣故，理想狀態下熱積累小于組織散熱效率，不會造成消融區重要結構的熱損傷［3‐4］。高壓脈沖電場消融作為一種非熱性消融方式被用于胰腺癌、肝門部膽管癌、前列腺癌等熱消融禁區，療效顯著［5‐7］。

已經投入臨床用的高壓脈沖電場電穿孔治療系統 如Nanoknife?（Angiodynamics 公司,美國）和Cliniporation?（IGEA 公司, 意大利）皆采用溫度開環協議，即不監測消融區溫度，一旦設定好脈沖條件，將按照廠家預設參數完成所有脈沖的發放［8］。然而在實際手術過程中，病變區可能存在大血管或骨骼干擾，術者不能保證布針完全平行，亦或術中患者肌肉收縮或呼吸移動引起電極移位，造成場強不均和電流異常引發熱效應產生，電極周圍組織炭化導致電極和組織間隙增大引起電弧效應，導致設備保護停機，不但影響治療也失去了其非熱消融的優勢［9］。最近有國外學者初步提出了溫度閉環反饋來解決以上問題［10‐11］,目前尚無系統性的對照研究。為此，本研究設計了溫度閉環反饋算法對多種負載進行了高壓電場消融實驗，并與傳統溫度開環技術進行比較研究，探討兩者區別，具體如下。

1 材料與方法

1.1 消融負載

細胞溶液：37℃、5%CO2環境下體外培養人肺癌細胞株A549，適時傳代，待測試時用培養基重懸，消融后繼續培養24 h。3D 細胞模型：將鼠尾膠原蛋白I型和A549 細胞按照試劑說明混合制成3D 細胞凝膠模型，培養環境同細胞懸液，消融后繼續培養24 h。組織：取新鮮離體豬肝組織洗凈，取材適中均勻，消融后即刻10%甲醛固定。

1.2 硬件連接

整個硬件電路由脈沖檢測、脈沖發生、脈沖控制、溫度檢測和數據輸出部分組成（圖1）。脈沖檢測電路由示波器檢測和記錄連接負載后的高壓脈沖發生器電極兩端產生的電壓、電流、脈寬、脈沖頻率、波形和個數等數據，保證脈沖有效施加于負載。脈沖發生電路由一臺電容儲能加IGBT 開關式結構的高壓方波脈沖發生器（高壓1 200～1 500 V、低壓600～900 V，最大電流輸出65 A）和兩根22G 電極針（頭端導電長度3 mm，其余絕緣涂層覆蓋）組成。脈沖控制電路由Arduino 微控制器通過定時5 V 高電平信號觸發脈沖釋放。溫度檢測電路由外圍熱敏溫度傳感器探頭和模塊組成。溫度數據輸出部分由計算機和串口通訊軟件Serialplot監測。

圖1 硬件電路連接示意圖Fig.1 Hardware circuit connection diagram

1.3 溫度閉環反饋算法的實現

編寫溫度閉環反饋算法程序，寫入微控制器協同微控制器控制脈沖發放和停止。設置反饋閾值37 ℃，溫度傳感器實時檢測溫度模擬值，微控制器A/D轉換成數字信號，再經Steinhart‐Hart方程轉換溫度數值并循環和閾值比較。大于閾值時暫停脈沖釋放，并繼續閉環比較，待低于閾值后重新釋放（圖2）。傳統溫度開環算法無溫度采集模塊和反饋算法。

圖2 溫度閉環反饋算法流程圖Fig.2 Flowchart of temperature closed-loop feedback algorithm

1.4 電場消融

按上述步驟將各功能電路連接部署和調試完成后，分別對溫度開環組和閉環組的3種負載各施以場強1.5 kV/cm（電極間距5 mm，電壓750 V）、頻率1 Hz、脈寬100 μs、脈沖數為20 的脈沖。每組重復測試10次。

1.5 消融指標檢測和評估方法

采用電導率儀測量兩組消融后的即時溶液電導率，CytoFLEX 流式細胞儀定量檢測溶液內細胞狀態。LEICA DMi8 全景掃描熒光顯微鏡拍攝3D 細胞模型熒光染色圖片。H‐E染色觀察組織病理學改變，觀察范圍包括消融中心區、電極周圍區和過渡區。

1.6 數據處理和統計學分析

將示波器和溫度傳感器采集的原始CSV 格式數據導入至Excel 中作圖，繪制電壓、電流參數和溫度曲線。3D 細胞模型熒光染色圖片導入Photoshop CS2 軟件勾畫消融區并根據原始比例尺進行像素計算和截面積換算。細胞計數、溫度數值、電導率值、消融截面積等定量數據比較采用t檢驗，P＜0.05 為結果有統計學差異。組織病理學結果定性比較。

2 結果

2.1 硬件和算法運行結果

在細胞溶液負載條件下（電導率1.2 S/m，等效電阻約70 Ω），脈沖發生裝置輸出高壓方波波形，高頻300 Hz連續釋放時有輕微壓降趨勢，但壓降小于500 V（圖3a）。經微控制器控制釋放頻率后，高壓脈沖發生器以1 Hz 的頻率觸發單個脈沖，電壓電流波形恒定，上升沿較陡（圖3b）。溫度傳感器數據采集傳輸至計算機觀察分析溫度曲線波形，溫度開環組消融電極溫度曲線均呈鋸齒狀、階梯狀上升（圖4a）。溫度閉環組未達閾值溫度前波形也呈鋸齒狀上升，在達到閾值反饋后，脈沖發放間隔自適應延長，消融溫度穩定在閾值附近上下波動（圖4b）。以上結果表明各硬件電路運行穩定，觸發程序和溫度反饋算法運行良好，無明顯電磁干擾。

圖4 消融溫度曲線Fig.4 Ablation temperature curves

2.2 消融指標結果

在保證硬件和算法穩定運行的前提下，連接3種實驗負載進行消融實驗后，分別獲得開環組和閉環組消融結果的定量和定性指標，具體如下。

2.2.1 定量指標開環組消融結束時即刻電極溫度為（53.2±5.5）℃，細胞懸液電導率為（1.43±0.03）S/m，細胞死亡率為（86.8±5.5）%，3D 細胞模型消融截面積為（0.46±0.15）cm2；均高于閉環組對應的電極溫度（38.5±1.6）℃，細胞懸液電導率（1.21±0.02）S/m，細胞死亡率（73.6±10.2）%和3D 細胞模型消融截面積（0.37±0.08）cm2。差異均有統計學意義（P＜0.05）（圖5）。經流式細胞分析結果早期凋亡和晚期凋亡亞組，開環組晚期凋亡細胞多于閉環組（圖6，右上象限），閉環組細胞早期凋亡數目多于開環組（圖6，右下象限）。3D 腫瘤細胞模型消融后的熒光染色可見兩電極間電場作用后的紅色死細胞區和綠色活細胞區；但閉環組消融區域染色更均勻，消融邊界更清晰（圖7）。

圖5 消融后定量指標對比Fig.5 Comparison of quantitative indexes after ablation

圖6 溶液負載消融細胞狀態分布對比Fig.6 Comparison of solution-loaded ablation cell state distributions

圖7 3D細胞模型負載消融面積對比Fig.7 Comparison of the ablation area of 3D cell model

2.2.2 定性指標非消融區正常豬肝組織（陰性對照）H‐E染色肝小葉完整，細胞核清晰，細胞質飽滿、排列緊密（圖8a）。開環組和閉環組消融后即刻病理結果顯示，兩組消融中心區僅表現為肝血竇增寬（圖8b）。開環組電極周圍區可見細胞核溶解、減少，胞質丟失、脫染以及大片熱損傷導致的嗜酸性凝固性壞死區（圖8c）。閉環組電極周圍無凝固性壞死區。兩組消融中心和電極之間的過渡區主要表現為肝小葉纖維間隔斷裂、小葉結構不清、細胞質脫水丟失、核質比增加，偶可見核固縮和核聚集（圖8d）。

圖8 離體豬肝負載消融后H-E染色對比Fig.8 Comparison of H-E staining of swine liver ex vivo after ablation

3 討論

本文對傳統溫度開環式高壓脈沖電場消融和溫度閉環反饋式消融進行了比較研究。目前國內外大部分對于高壓脈沖電場消融中熱效應的研究僅停留在消融區溫度的監測［12］，沒有采用溫度閉環反饋算法控制進行相關研究。直到2020年，Petrella 等［10］提出溫度閉環反饋的概念并對3D腫瘤細胞模型進行初步研究，指出傳統溫度開環算法和閉環反饋算法消融存在差異。該研究在此基礎上，采用細胞溶液、3D腫瘤細胞模型和離體豬肝組織3種負載進行了實驗，是因為二維細胞懸液和3D細胞模型消融后可繼續培養再檢測，可排除細胞凋亡滯后性和可逆性的穿孔造成的結果誤差，且便于得出定量數據進行統計學分析比較。但細胞學研究始終不能替代實體組織的細胞排列和連接，因此增加組織負載實驗，以便更真實準確地模擬和還原臨床真實消融環境。

硬件和算法的可靠運行是保證消融結果準確性的前提。該實驗設備硬件部分采用了和商業化臨床高壓脈沖消融系統電路原理相同的小型電容儲能和IGBT開關控制式結構方波高壓脈沖發生器作為脈沖發生電路［13］，這也是國內高壓脈沖電場消融基礎研究常用的脈沖發生結構［14］。基于Arduino 微控制器和平臺作為脈沖控制電路和數據輸出電路，便于編程、算法調試和原始數據輸出。采用引線帶有雙層絕緣涂層的環氧塑封熱敏電阻傳感器作為溫度監測和反饋電路，而沒有采用更精確的光纖測溫系統［15］，一是便于和控制單元接入，二是可大大減少設備體積成本。實驗結果顯示，脈沖發生電路工作可靠（圖3）；溫度探頭能夠耐高壓和抗電磁干擾，溫度輸出延遲性低，呈現和脈沖頻率一致的溫度波動，閉環反饋溫度曲線達到閾值后在閾值上下波動（圖4）。

消融結束時，開環組電極在3種負載內溫度平均值顯著高于閉環組。開環組溶液負載電導率、細胞死亡率均大于閉環組（圖5）。開環組3D 腫瘤模型負載消融區面積大于閉環組，這一點和Petrella 等［10］和Fesmire等［16］的研究一致。開環組離體組織負載電極周圍區出現凝固性壞死區，而閉環組沒有出現（圖8）。這證明開環組消融中出現了熱效應，熱效應和電導率的提升進一步增強了電場消融的效果。對流式細胞結果和3D 細胞模型染色結果進一步剖析可以發現，開環組溶液細胞死亡以晚期凋亡為主，閉環組同時存在早期凋亡和晚期凋亡（圖6）；開環組雖然消融面積大于閉環組，但是消融區不如閉環組均勻（圖7a）。可以推斷，傳統溫度開環高壓電場消融并非完全非熱性消融，而是少量熱效應和高壓電效應于一體的消融，熱量介導又進一步增強高壓脈沖的殺傷效應。而溫度閉環消融則是溫度可控的純粹電場消融，排除了熱效應致死，因此消融區熒光染色更加均勻（圖7b）。

由于高壓電場消融后組織凋亡具有滯后性，往往開始于術后24 h 以后［17‐18］。因此離體標本消融處理固定后無法評估有效消融區范圍。該實驗有效場強中心的非熱消融區（圖8b、圖8d）僅表現為肝血竇增寬、局部細胞質脫水致核質比增加、少量核固縮和核聚集偶可見，這種電場消融術后即刻病理結果和Chen 等［19］、Kim 等［20］研究結果一致。該研究之所以只用離體組織實驗，主要側重于比較溫度開環和閉環組消融的即刻效應區別，即有無熱凝固性壞死的病理區別。因此，本著醫學動物倫理學“3R”原則該研究沒有進行不必要的在體動物實驗進行動態觀察。當然，由于離體組織不具備血液流動，因此散熱情況和活體組織不同，離體和在體組織消融起始溫度不同，可能對消融效果存在影響。如需進一步專門深入研究溫度閉環反饋消融的病理改變，則需要進一步動物實驗動態病理評估。

綜上，傳統溫度開環高壓脈沖電場消融和溫度閉環反饋消融存在差別。在該實驗條件下，溫度開環消融效果均略強于溫度閉環，這可能與熱效應介導的電場效應增強有關。溫度閉環反饋能避免熱損傷效應，實現真正意義上的非熱性消融。