抗酸化復(fù)合菌系強(qiáng)化堆肥優(yōu)勢(shì)微生物演替規(guī)律分析*

宋彩紅 齊 輝 張亞麗 席北斗 夏訓(xùn)峰#

(1.聊城大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 聊城 252000；2.中國(guó)科學(xué)研究院地理科學(xué)與資源研究所，北京 100101；3.中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院，北京 100012)

中國(guó)餐廚垃圾產(chǎn)量從2010年的3 667萬t提升至2018年的4 552萬t，按此增速推算，2025年全國(guó)餐廚垃圾產(chǎn)量有望達(dá)到5 500萬t。數(shù)量如此龐大的餐廚垃圾如不妥善處理，勢(shì)必會(huì)造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[1]。堆肥是一種有效的資源化手段[2]，也是餐廚垃圾處理的有效方法之一[3]29。

由于餐廚垃圾有機(jī)質(zhì)含量高，極易酸化腐敗，在堆肥初期往往存在由于堆料酸化導(dǎo)致的堆體溫度延滯上升，甚至發(fā)酵崩潰等問題[4-5]。針對(duì)上述問題，常采用的解決策略是添加化學(xué)緩沖劑調(diào)節(jié)堆料pH[6-7]或接種微生物菌劑促進(jìn)小分子有機(jī)酸降解[3]29。前者成本較高，可能不適用于大型堆肥廠。后者常用的微生物菌劑有單一菌種[8]和復(fù)合菌劑[9]1124，相對(duì)于單一菌種而言，復(fù)合菌劑適應(yīng)性更強(qiáng)、效果也更穩(wěn)定。本課題組前期研究表明，接種抗酸化復(fù)合菌系(AAMC)可有效克服餐廚垃圾堆肥初期密集酸化問題[10]1，但接種該菌系對(duì)餐廚垃圾堆肥優(yōu)勢(shì)微生物演替規(guī)律影響機(jī)制不明確，直接限制該菌系的實(shí)際應(yīng)用。本研究突破聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)/變性梯度凝膠電泳等傳統(tǒng)微生物群落檢測(cè)技術(shù)的固有限制[11]，采用元蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，通過檢測(cè)不同堆肥樣品中提取的蛋白質(zhì)，探討AAMC對(duì)餐廚垃圾堆肥優(yōu)勢(shì)微生物群落的影響，以期為抗酸化接種劑的實(shí)際應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 堆肥物料

餐廚垃圾取自聊城大學(xué)某餐廳，堆肥前對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理，具體方法參見本課題組前期研究[9]1134。麩皮購(gòu)自聊城大學(xué)東校區(qū)附近農(nóng)戶，作為調(diào)理劑使用，用以調(diào)節(jié)堆料含水率和碳氮質(zhì)量比(C/N)。餐廚垃圾pH為5.42、含水率為75.3%、有機(jī)質(zhì)為78.7%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、C/N為22.1；麩皮含水率為11.5%、有機(jī)質(zhì)為88.9%、C/N為33.6。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將餐廚垃圾與麩皮按比例充分混合均勻，得到的堆肥混合物C/N為25.6、含水率為60.6%。設(shè)置3個(gè)堆肥組：(1)接種組，堆肥前于堆肥混合物中接入處于對(duì)數(shù)期的AAMC(菌體濃度為1×108cfu/mL，AAMC的篩選、馴化和構(gòu)建方法及其菌種組成見本課題組前期研究[10]2)，菌液接種量為1.25 mL/kg(以單位質(zhì)量堆料干基計(jì))；(2)加堿組，添加MgO和K2HPO4以緩解堆肥初期密集酸化導(dǎo)致的pH下降，MgO、K2HPO4添加量分別為0.05、0.1 mol/kg(以單位質(zhì)量堆料干基計(jì))；(3)設(shè)立自然堆肥組為空白對(duì)照。堆肥采用在線監(jiān)測(cè)反應(yīng)器[12]進(jìn)行，試驗(yàn)過程中通風(fēng)量保持在0.5 L/(min·kg)，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)堆體溫度和含水率，定期翻堆。

取樣時(shí)間為堆肥0、3、8、13、19、35、47 d，采用四分法[13]取樣，確保樣品具有代表性。每個(gè)樣品分成兩份，一份立即用于pH檢測(cè)(重復(fù)3次)，另一份-20 ℃保存，用于元蛋白質(zhì)組學(xué)測(cè)定。

1.3 理化指標(biāo)分析

1.4 元蛋白質(zhì)組學(xué)分析

總蛋白質(zhì)提取、純化、分離和鑒定依照本課題組前期研究[10]3進(jìn)行。所有蛋白質(zhì)采用BLASTP人工注釋，包括來源微生物的名稱。代謝通路查詢采用KEGG網(wǎng)站(http：//www.kegg.jp)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Origin 2019b軟件進(jìn)行試驗(yàn)原始數(shù)據(jù)的整理、示圖制作，采用SPSS 20軟件對(duì)pH數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫 度

溫度對(duì)堆肥效率有明顯影響，在一定范圍內(nèi)，溫度每升高10 ℃，生物體的新陳代謝速率會(huì)提升1倍[14]。不同堆肥組溫度變化見圖1。本研究主要關(guān)注堆肥初期酸化抑制階段，僅顯示30 d內(nèi)的溫度變化(堆肥30 d后，所有堆肥組溫度均低于30 ℃)。接種組僅32 h即可達(dá)高溫(>50 ℃)，不存在堆體溫度升高的延滯期，這說明添加AAMC可克服堆料酸化對(duì)微生物活性的抑制作用。加堿組最高溫度(59 ℃)低于接種組(67 ℃)，但堆肥32 h也可進(jìn)入高溫階段，說明堆肥pH的改善也可避免堆體溫度升高的延滯。對(duì)照組整個(gè)堆肥過程均低于50 ℃。接種組和加堿組分別在第5、6天滿足美國(guó)環(huán)境保護(hù)署固廢無害化標(biāo)準(zhǔn)[15]，而對(duì)照組則未能滿足標(biāo)準(zhǔn)。

注：箭頭代表翻堆。圖1 不同堆肥組溫度變化Fig.1 Changes of temperature in different composting treatments

2.2 pH

一般來說，當(dāng)pH為6.7～9.0時(shí)，微生物對(duì)有機(jī)質(zhì)的降解活性最高[16]。不同堆肥組pH變化見圖2。接種組pH呈持續(xù)升高狀態(tài)，最終達(dá)到穩(wěn)定。因?yàn)樾》肿佑袡C(jī)酸的密集產(chǎn)生，堆肥初期會(huì)出現(xiàn)明顯的pH下降。接種AAMC可有效消除小分子有機(jī)酸對(duì)堆肥pH的降低作用，表明小分子有機(jī)酸一旦產(chǎn)生即可被AAMC快速降解。加堿組中由于堿性化合物的加入，初始pH明顯高于其他組。堆肥前8天，由于小分子有機(jī)酸的大量產(chǎn)生，加堿組pH有所降低，此后隨著小分子有機(jī)酸逐漸消耗殆盡，堆肥pH逐漸升高，并在第13天開始高于接種組。對(duì)照組出現(xiàn)了明顯的酸化過程，pH總體走向雖然呈升高趨勢(shì)，但整個(gè)堆肥過程中均呈酸性，酸性條件不利于堆肥微生物對(duì)有機(jī)物的降解，這可能是對(duì)照組堆肥效率低的原因。

注：不同字母表示差異顯著(p<0.05)。圖2 不同堆肥組pH變化Fig.2 Changes of pH in different composting treatments

2.3 細(xì)菌演替規(guī)律分析

細(xì)菌群落組成見圖3。83.9%～94.1%的細(xì)菌群落集中在γ-變形菌綱、芽孢桿菌綱、放線菌綱、α-變形菌綱、β-變形菌綱、δ-變形菌綱和梭菌綱。γ-變形菌綱相對(duì)豐度最高(19.6%～57.8%)。接種和加堿組中γ-變形菌綱相對(duì)豐度均呈降低趨勢(shì)；對(duì)照組中γ-變形菌綱相對(duì)豐度在高溫期降低，但腐熟期升高。γ-變形菌綱富含病原菌，對(duì)照組高溫期溫度較低(<50 ℃)，只能暫時(shí)抑制γ-變形菌綱致病菌的生長(zhǎng)，不能殺死它們，在溫度下降后的腐熟期，致病菌的活性又恢復(fù)。堆肥過程中，芽孢桿菌在數(shù)量和功能上都占據(jù)較大優(yōu)勢(shì)。接種組芽孢桿菌綱相對(duì)豐度最低(8.75%～11.70%)，加堿、對(duì)照組則分別為20.12%～28.46%、11.34%～28.57%，表明接種AAMC可改變優(yōu)勢(shì)微生物的相對(duì)豐度。與對(duì)照組相比，芽孢桿菌綱在加堿組表現(xiàn)出完全不同的變化趨勢(shì)，說明添加MgO和K2HPO4可明顯改變細(xì)菌群落的演替規(guī)律。在堆肥過程中，接種組放線菌綱相對(duì)豐度較大(7.28%～27.00%)，加堿、對(duì)照組則分別為3.66%～6.12%、2.70%～10.71%，這說明接種AAMC能顯著提高放線菌綱比例。放線菌綱微生物在堆肥過程起重要作用，其具有較強(qiáng)的木質(zhì)纖維素降解能力，可作為堆肥腐熟度評(píng)價(jià)的有用指標(biāo)[17]952。

注：1—其他；2—衣原體(Chlamydiae)；3—擬桿菌綱(Bacteroidia)；4—熱袍菌綱(Thermotogae)；5—產(chǎn)水菌綱(Aquificae)；6—螺旋體(Spirochaetes)；7—原綠藻目(Prochlorales)；8—黃桿菌綱(Flavobacteriia)；9—噬纖維菌綱(Cytophagia)；10—綠菌綱(Chlorobia)；11—柔膜菌綱(Mollicutes)；12—顫藻亞綱(Oscillatoriophycideae)；13—δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)；14—梭菌綱(Clostridia)；15—β-變形菌綱(Betaproteobacteria)；16—芽孢桿菌綱(Bacilli)；17—α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)；18—γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)；19—放線菌綱(Actinobacteridae)。圖3 細(xì)菌群落組成Fig.3 Bacterial community compositions

2.3.1 芽孢桿菌綱

本課題組前期研究表明，元蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)揭示18個(gè)屬的細(xì)菌能分泌乙酸和丙酸降解關(guān)鍵酶[10]8，其中芽孢桿菌綱中包含葡萄球菌屬(Staphylococcus)、地芽孢桿菌屬(Geobacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)和芽孢桿菌屬(Bacillus)。此4個(gè)屬相對(duì)豐度為5.50%～19.23%，在接種組中最低(5.50%～7.73%)，加堿、對(duì)照組中則分別為13.99%～19.23%、9.19%～16.07%，說明此4個(gè)屬可能對(duì)緩解堆料酸化貢獻(xiàn)較小。在升溫期，不同堆肥組芽孢桿菌屬均在芽孢桿菌綱占據(jù)主導(dǎo)地位，接種、加堿、對(duì)照組中占芽孢桿菌綱蛋白質(zhì)的比例分別為37.74%、31.71%、40.74%。除具有乙酸和丙酸降解功能外，芽孢桿菌屬還與纖維素的降解密切相關(guān)[18]，本課題組前期研究也證實(shí)了這一點(diǎn)[10]8。纖維素的降解貫穿于整個(gè)堆肥過程，在堆肥中后期降解效率最高。接種、加堿、對(duì)照組芽孢桿菌屬相對(duì)豐度分別為3.08%～4.42%、7.93%～11.73%、5.95%～8.93%，接種組最低，說明接種AAMC未增加優(yōu)勢(shì)細(xì)菌芽孢桿菌屬的數(shù)量。然而，與對(duì)照組相比，加堿組芽孢桿菌屬相對(duì)豐度明顯較高，尤其在升溫期和高溫期，可能是因?yàn)榧訅A組較高的pH有利于芽孢桿菌屬生長(zhǎng)。SALIM等[19]研究表明，對(duì)堆料進(jìn)行堿處理可促進(jìn)芽孢桿菌TMF-1蛋白酶、α-淀粉酶和纖維素酶的生成。芽孢桿菌綱包含乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)和明串珠菌屬(Leuconostoc)3個(gè)產(chǎn)乳酸菌屬，在升溫期，接種組中此3個(gè)屬占芽孢桿菌綱蛋白質(zhì)的比例(18.87%)明顯高于加堿組(4.88%)和對(duì)照組(14.81%)。本課題組前期研究表明，乳酸可能不是堆肥初期酸化問題的主要原因[10]6，也就說明，在堆肥過程中檢測(cè)到的產(chǎn)乳酸菌株并非都能產(chǎn)生乳酸。

與基因數(shù)據(jù)不同，元蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)不能直接計(jì)算多樣性指數(shù)，因此本研究以屬數(shù)或目數(shù)來衡量不同綱微生物多樣性。接種、加堿組中芽孢桿菌綱微生物多樣性(8～12、11～16屬)均高于對(duì)照組(4～10屬)。

如何保證油煙機(jī)平穩(wěn)安靜地運(yùn)行，其實(shí)電機(jī)很重要。得益于直流變頻電機(jī)先天的產(chǎn)品結(jié)構(gòu)優(yōu)勢(shì)和相關(guān)技術(shù)優(yōu)勢(shì)，搭載上直流變頻電機(jī)的吸油煙機(jī)相較于非直流變頻的吸油煙機(jī)，在品質(zhì)和性能等諸多方面都有顯著的優(yōu)勢(shì)。在整個(gè)家電行業(yè)中，直流變頻技術(shù)正不斷滲透在各類家電產(chǎn)品中，中國(guó)的直流變頻技術(shù)雖然起步晚，但是近年來發(fā)展迅速。

2.3.2 放線菌綱

在放線菌綱中，棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、分支桿菌屬(Mycobacterium)和紅球菌屬(Rhodococcus)能分泌乙酸和丙酸降解關(guān)鍵酶。此3個(gè)屬在所有堆肥組放線菌綱中均占主導(dǎo)地位，占放線菌綱蛋白質(zhì)的50%～60%。在升溫、高溫、腐熟期，此3個(gè)屬在接種組中相對(duì)豐度(4.19%、16.15%、19.25%)均明顯高于加堿組(1.83%、1.46%、2.88%)和對(duì)照組(1.62%、3.57%、1.03%)。接種組升溫、腐熟期和加堿組高溫、腐熟期均檢測(cè)到熱酸菌屬(Acidothermus)，而對(duì)照組未檢測(cè)到。解纖維熱酸菌(Acidothermuscellulolyticu)是本研究檢測(cè)到的唯一熱酸菌屬種。研究表明，其能分泌熱穩(wěn)定的纖維素酶，如內(nèi)切葡聚糖酶[20]。然而，在本研究中并未發(fā)現(xiàn)此功能。前期元蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)表明，高溫雙岐菌屬(Thermobifida)可分泌纖維素降解關(guān)鍵酶，在接種組升溫、腐熟期和加堿組高溫、腐熟期均檢測(cè)到，而在對(duì)照組未檢測(cè)到。

接種、加堿組中放線菌綱微生物多樣性(10～16、5～13屬)均高于對(duì)照組(3～6屬)。

2.3.3 γ-變形菌綱

腸桿菌目(Enterobacteriales)和假單胞菌目(Pseudomonadales)是γ-變形菌綱的主要目。經(jīng)歷47 d的堆肥后，腸桿菌目占γ-變形菌綱蛋白質(zhì)的比例在接種組(從53.78%到26.97%)和加堿組(從67.24%到32.62%)中明顯降低，對(duì)照組卻從堆肥起始的27.10%上升到42.11%。假單胞菌目占γ-變形菌綱蛋白質(zhì)的比例在不同堆肥組也表現(xiàn)出完全不同的變化趨勢(shì)，整個(gè)堆肥期間，在加堿組(13.79%～30.50%)和接種組(25.90%～31.46%)中均增加，然而對(duì)照組從堆肥起始的42.06%下降到15.79%。在γ-變形菌綱中，假單胞菌屬(Pseudomonas)、埃希氏桿菌屬(Escherichia)、布赫納氏菌屬(Buchnera)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)和軍團(tuán)菌屬(Legionella)都能分泌乙酸和丙酸降解關(guān)鍵酶。在升溫期，接種組全部檢測(cè)到這5個(gè)屬，加堿組檢測(cè)到3個(gè)屬，對(duì)照組檢測(cè)到4個(gè)屬；相對(duì)豐度在接種組中(28.70%)明顯高于加堿組(12.19%)和對(duì)照組(18.92%)。在高溫期，接種組檢出3個(gè)屬，加堿組檢出全部5個(gè)屬，對(duì)照組僅檢出1屬；相對(duì)豐度在接種組中(16.92%)明顯高于加堿組(10.50%)和對(duì)照組(1.79%)。在腐熟期，接種組檢測(cè)到全部5個(gè)屬，加堿組檢測(cè)到3個(gè)屬，對(duì)照組檢測(cè)到4個(gè)屬；相對(duì)豐度在接種組中(9.00%)和加堿組中(9.23%)相似，在對(duì)照組中最高(14.43%)。可見，在升溫、高溫期，接種AAMC可顯著提高乙酸和丙酸降解菌相對(duì)豐度；在腐熟期，對(duì)照組乙酸和丙酸降解菌相對(duì)豐度較高，這表明在腐熟期堆肥物料酸化可能仍然是對(duì)照組的主要問題。

2.3.4 α-變形菌綱

根瘤菌目(Rhizobiales)是α-變形菌綱的優(yōu)勢(shì)類群，占α-變形菌綱蛋白質(zhì)的40.00%～73.33%。不同堆肥組根瘤菌目相對(duì)豐度具有相似的變化趨勢(shì)，在高溫期明顯降低，表明高溫對(duì)根瘤菌目細(xì)菌群落具有篩選作用。與加堿組的持續(xù)下降相比，接種和對(duì)照組根瘤菌目相對(duì)豐度在腐熟期有所恢復(fù)。在α-變形菌綱中，慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)和立克次氏體(Rickettsia)能分泌乙酸和丙酸降解關(guān)鍵酶。在不同堆肥組，此3個(gè)屬相對(duì)豐度均處于較低水平(0～3.50%)，這表明α-變形菌綱中乙酸和丙酸降解菌可能不是克服堆料酸化抑制問題的關(guān)鍵菌株。

在升溫期，接種組α-變形菌綱細(xì)菌種類明顯比加堿和對(duì)照組豐富，然而加堿和對(duì)照組之間沒有明顯差異；在高溫期，微生物多樣性排序?yàn)榧訅A組>接種組>對(duì)照組；在腐熟期，接種和加堿組微生物多樣性明顯高于對(duì)照組。

2.4 真菌演替規(guī)律分析

真菌群落組成見圖4。79.03%～89.09%的真菌群落集中在酵母綱、散囊菌綱、裂殖酵母綱和糞殼菌綱。其中，酵母綱相對(duì)豐度最高(34.48%～64.17%)，表明酵母綱是堆肥處理過程中主要的真菌群落，這與GU等[21]的研究結(jié)論一致。在加堿和對(duì)照組中，酵母綱相對(duì)豐度在高溫期先降低，在腐熟期再升高，表明高溫對(duì)酵母綱真菌具有篩選作用。接種組變化趨勢(shì)則完全不同，酵母綱在高溫期表現(xiàn)出最高的相對(duì)豐度，這表明接種AAMC可克服高溫對(duì)酵母綱的篩選效應(yīng)。

注：1—其他；2—擔(dān)子菌綱(Basidiomycota)；3—柄銹菌綱(Pucciniomycetes)；4—毛霉菌目(Mucorales)；5—球囊菌綱(Glomeromycetes)；6—錘舌菌綱(Leotiomycetes)；7—銀耳綱(Tremellomycetes)；8—盤菌綱(Pezizomycetes)；9—新美鞭菌綱(Neocallimastigomycetes)；10—小孢子蟲目(Microsporidia)；11—肺孢子菌綱(Pneumocystidomycetes)；12—傘菌綱(Agaricomycetes)；13—座囊菌綱(Dothideomycetes)；14—黑粉菌綱(Ustilaginomycetes)；15—糞殼菌綱(Sordariomycetes)；16—裂殖酵母綱(Schizosaccharomycetes)；17—散囊菌綱(Eurotiomycetes)；18—酵母綱(Saccharomycetes)。圖4 真菌種群組成Fig.4 Fungal community compositions

酵母屬(Saccharomyces)是優(yōu)勢(shì)真菌屬，占酵母綱蛋白質(zhì)的29.03%～58.82%。LIU等[17]952表明，在酵母綱中，51%的蛋白質(zhì)來自于酵母屬。在升溫、高溫期，接種組中酵母屬相對(duì)豐度(10.01%、15.28%)均低于加堿組(29.21%、20.93%)和對(duì)照組(18.89%、25.00%)。酵母屬能分泌乙酸和丙酸降解關(guān)鍵酶，此結(jié)果表明，酵母屬對(duì)克服接種組早期酸化問題的貢獻(xiàn)較小。在腐熟期，加堿、對(duì)照、接種組中酵母屬相對(duì)豐度分別為29.99%、23.64%、16.67%。

假絲酵母屬(Candida)也可分泌乙酸和丙酸降解關(guān)鍵酶。不同堆肥處理假絲酵母屬相對(duì)豐度均呈先降低后升高的趨勢(shì)。在升溫期，接種組中假絲酵母屬相對(duì)豐度(5.56%)與對(duì)照組(5.56%)無明顯差異，加堿組中較低(4.49%)，這些結(jié)果也表明，假絲酵母屬對(duì)緩解接種和加堿組堆肥早期酸化現(xiàn)象的貢獻(xiàn)較小。CHOI等[22]發(fā)現(xiàn)，在50 ℃恒溫條件下，克魯維酵母菌屬(Kluyveromyces)可降低堆料酸性，增加嗜熱菌的數(shù)量。本研究發(fā)現(xiàn)，在高溫期，克魯維酵母菌屬相對(duì)豐度在接種組中(11.46%)明顯高于加堿組(1.16%)和對(duì)照組(0)，這可能是接種組高溫期具有較高溫度的原因。

3 結(jié) 論

(1) 接種AAMC和添加化學(xué)緩沖劑均可規(guī)避由于堆料酸化導(dǎo)致的堆體溫度升高延滯問題，接種、加堿組分別在第5、6天即可滿足固廢無害化標(biāo)準(zhǔn)。

(2) 元蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)顯示，83.9%～94.1%的細(xì)菌群落集中在γ-變形菌綱、芽孢桿菌綱、放線菌綱、α-變形菌綱、β-變形菌綱、δ-變形菌綱和梭菌綱。79.03～89.09%的真菌群落集中在酵母綱、散囊菌綱、裂殖酵母綱和糞殼菌綱。

(3) 接種組放線菌綱相對(duì)豐度較大(7.28%～27.00%)，加堿、對(duì)照組則分別為3.66%～6.12%、2.70%～10.71%。接種AAMC可顯著提高乙酸和丙酸降解菌相對(duì)豐度和微生物多樣性。