肉豆蔻飲片及其標準湯劑中揮發性成分差異分析

★ 楊曉東 何廣銘 彭嬌 曾薈 潘曉君 譚梓君 陶晨璐 黃小丹（廣東一方制藥有限公司，廣東省中藥配方顆粒企業重點實驗室 廣東 佛山 528244）

肉豆蔻為肉豆蔻科植物肉豆蔻Myristica fragransHoutt.的干燥種仁。具有溫中行氣、澀腸止瀉的功效；用于脾胃虛寒、久瀉不止、脘腹脹痛、食少嘔吐［1］。肉豆蔻含有豐富的揮發油、脂肪油、苯丙素、木質素等多種化學成分。揮發油是其主要的藥效部位，具有較強的抑菌、抗氧化作用［2-3］。

中藥揮發性成分在臨床療效中發揮著重要的作用。目前，含揮發性成分中藥配方顆粒生產中一般先提取其中揮發油成分，β-環糊精包合干燥后，加入噴干粉中混勻后干法制粒，但揮發油的加入量尚未明確規定，不同企業之間揮發油加入量差別較大，有文獻［4-5］報道中藥飲片與對應的標準湯劑揮發油在化學成分與相對百分含量差異很大，因此本文對肉豆蔻飲片與標準湯劑揮發油進行研究，測量飲片與標準湯劑中揮發性成分的含量，并用氣相色譜質譜聯用對其化學成分進行分析，比較兩者之間的差異，可為肉豆蔻配方顆粒生產工藝改進提供一定的參考價值。

1 儀器與材料

安捷倫8890/7000D型氣相-質譜聯用儀（安捷倫科技有限公司）；HP-5MS毛細管色譜柱（30 m× 0.25 mm×0.25 μm）；移液槍（德國普蘭德公司）；JJ600型電子天平（常德市雙杰測試儀器廠）；陶瓷保健壺（3L，深圳一枚王有限公司）；揮發油提取裝置。

本實驗共收集15批肉豆蔻飲片，經廣東一方制藥有限公司質量中心鑒定，均為肉豆蔻科植物肉豆蔻Myristica fragransHoutt.的干燥種仁，編號為S1～S15；肉豆蔻標準湯劑（實驗室自制）；乙醚（分析純，廣州化學試劑廠）。

2 方法與結果

2.1 揮發油提取及測定飲片揮發油提取：取肉豆蔻飲片粗粉約20 g，置于1 000 mL的圓底燒瓶中，加水500 mL與沸石數粒，按《中國藥典》2015年版揮發油測定法（通則2204）測定。

標準湯劑揮發油提取：按《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》(征求意見稿)規定，取100 g飲片，搗碎，加水煎煮兩次，第一次加8倍量水，浸泡30 min，武火煮沸后文火保持微沸20 min，趁熱過濾后迅速冷卻。第二次加6倍量水，武火煮沸后文火保持微沸15 min，趁熱過濾后濾液冷卻，合并兩次濾液，制得標準湯劑。將標準湯劑轉移置2 000 mL圓底燒瓶中，加沸石數粒，按《中國藥典》2015年版揮發油測定法（通則2204）測定。

2.2 工藝穩定性驗證取同一批肉豆蔻飲片樣品（S1），按2.1項下肉豆蔻標準湯劑制備方法平行制備3份標準湯劑試樣并測定其中揮發油含量，計算轉移率。3次試驗中標準湯劑揮發油平均含量為0.439 %，RSD為7.29 %；平均轉移率為6.27 %，RSD為7.29 %。以上指標結果表明該工藝具有較好的穩定性。

2.3 揮發油測定結果取15批飲片及標準湯劑樣品分別按照“2.1”項下方法提取并測定揮發油，計算飲片、標準湯劑揮發油含量與轉移率［揮發油轉移率（%）=標準湯劑揮發油含量（%，以飲片計）/飲片揮發油含量（%）×100］，結果見表1。

表1 工藝穩定性驗證

由表2可知，15批肉豆蔻飲片揮發油含量均大于6.0 %，符合《中國藥典》2015版肉豆蔻揮發油項下“本品揮發油不得少于6.0 %”規定。15批肉豆蔻標準湯劑揮發油含量在0.324 %～0.670 %范圍內，其轉移率為5.06 %～10.00 %。上述結果顯示，飲片中揮發油在煎煮過程中能部分轉移到標準湯劑中，可為肉豆蔻配方顆粒生產中其揮發油的加入量提供參考。

表2 肉豆蔻飲片、標準湯劑揮發油測定

2.4 飲片與標準湯劑揮發油GC-MS對比分析

2.4.1 供試品溶液制備精密量取揮發油50 μL，置10 mL量瓶中，加乙醚溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液即得。

2.4.2 氣相色譜條件色譜柱為HP-5MS毛細管色譜柱（柱長為30 m，內徑為0.25 mm，膜厚度為0.25 μm），程序升溫：初始溫度40 ℃，以每分鐘13 ℃的速率升溫至53 ℃，保持2 min，以每分鐘2 ℃的速率升溫至54 ℃，以每分鐘1 ℃的速率升溫至57 ℃，保持2 min，以每分鐘1 ℃的速率升溫至60 ℃，以每分鐘5℃的速率升溫至220 ℃；進樣量為1 μL；進樣口溫度為250 ℃；載氣為高純氦氣（99.999 %）；載氣流速為1.0 mL/min；不分流；溶劑延時3 min。

2.4.3 質譜條件離子源溫度為230 ℃；四極桿溫度為150 ℃；進樣口溫度為250 ℃；質荷比范圍35～550 m/z，掃描方式為全掃描。

2.4.4 測定方法及結果分別取15批肉豆蔻飲片與標準湯劑揮發油，按“2.2.1”項下供試品溶液制備方法制備樣品，按“2.2.2”項下氣相色譜條件與“2.2.3”項下質譜條件進行測定，按峰面積歸一化法計算各組分的相對百分含量。并通過NIST譜庫對化學成分進行檢索鑒定，肉豆蔻飲片及肉豆蔻標準湯劑均鑒定出32個化合物。結果見圖1-2和表3。

圖1 肉豆蔻飲片與標準湯劑揮發油總離子流圖

表3 肉豆蔻飲片與標準湯劑揮發油化學成分鑒定結果

由表3可知，從肉豆蔻飲片揮發油中共鑒定出32個揮發性成分,其主要成分為肉豆蔻醚（16.22 %）、 α-蒎烯（13.09 %）、偽檸檬烯（6.5 %）、（-）-4-萜品醇（5.61 %）、γ-松油烯（4.81 %）、黃樟素（4.69 %）、甲基丁香酚（3.77 %）、松油烯（3.58 %）、欖香素（3.45 %）。上述9種化合物的含量占飲片揮發油總量的61.72 %。肉豆蔻標準湯劑揮發油中同樣鑒定出32個揮發性成分，其主要成分為肉豆蔻醚（22.8 %）、α-蒎烯（7.35 %）、偽檸檬烯（4.2 %）、（-）-4-萜品醇（4.86 %）、γ-松油烯（3.87 %）、黃樟素（3.91 %）、甲基丁香酚（5.26 %）、松油烯（2.91 %）、欖香素（6.30 %）。上述9種化合物的含量占標準湯劑揮發油總量的61.46 %。

圖2 肉豆蔻飲片及標準湯劑揮發油化學成分組成

3 分析與討論

3.1 揮發油測定結果分析《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》（征求意見稿）提出中藥配方顆粒研究應以標準湯劑為對照，藥效物質應與標準湯劑保持基本一致且標準湯劑中有效成分含量的轉移率可接受的范圍為均值加減3倍SD。通過對15批肉豆蔻飲片及其標準湯劑揮發油含量進行測定發現，15批肉豆蔻飲片揮發油含量范圍為6.3 %～9.7 %，15批肉豆蔻飲片標準湯劑揮發油含量范圍為0.324 %～0.688 %，揮發油含量轉移率范圍為5.06 %～10.00 %，平均轉移率為7.23 %，SD為1.5 %，X±2SD為4.38 %～10.04 %。15批肉豆蔻揮發油含量轉移率均在X±2SD范圍內。本研究確定了肉豆蔻標準湯劑揮發油含量及轉移率范圍，可為肉豆蔻配方顆粒的質量控制提供參考。

3.2 實驗研究中分別對分流比、升溫速率進行優化當采用分流比（10∶1）、（20∶1）時，飲片揮發油離子流圖部分峰面積過小，響應較低。當提高升溫速率時，部分色譜峰重疊，分離效果較差。最終采用“2.4.2”項下氣相色譜條件進行樣品測定，所得總離子流圖分離效果好且色譜峰響應適中。

3.3 氣相質譜結果分析肉豆蔻飲片與標準湯劑揮發油中共鑒定出32個共有成分，肉豆蔻飲片與標準湯劑揮發油中含量最高的均為肉豆蔻醚，其含量分別為16.22 %，22.8 %。肉豆蔻醚具有一定的毒性，服用過量對胃腸道有抑制作用，甚至可致中毒，產生昏迷及驚厥［6］。因此，應研究控制肉豆蔻飲片與標準湯劑揮發油中肉豆蔻醚的含量提高肉豆蔻配方顆粒臨床應用的安全性。肉豆蔻的主治功能為溫中行氣、澀腸止瀉［1］。揮發油中的α-蒎烯、甲基丁香酚是澀腸止瀉的主要活性成分。α-蒎烯具有較強的祛痰、抑菌、消炎與止咳作用［7］，其在飲片揮發油中的相對含量為13.09 %，在標準湯劑揮發油中的相對含量為7.35 %。飲片揮發油中α-蒎烯的相對含量略高于標準湯劑揮發油中的相對含量，可能原因為肉豆蔻在煎煮過程中，部分成分揮發所致。甲基丁香酚在抑菌、止瀉、清除氧自由基方面有重要作用［8-9］，飲片中甲基丁香酚的相對含量為3.77 %，標準湯劑揮發油中的相對含量為5.26 %，相對含量差異不明顯。

本文對肉豆蔻飲片與標準湯劑中揮發油進行定量與定性研究，發現兩者的組成成分與相對含量基本相同，該研究結果為肉豆蔻配方顆粒制備過程中有效保留揮發性成分提供參考。