尿液microRNA-21表達聯(lián)合三維超聲成像技術(shù)對膀胱尿路上皮癌的診斷價值

王琳，宣之東，張穎，劉永容，李超，姜利寧

膀胱腫瘤為我國近年來泌尿系統(tǒng)最常見的腫瘤之一，發(fā)病率呈逐年上升趨勢［1］。其中膀胱尿路上皮癌（bladder urothelial carcinoma，BUC）最為常見，復發(fā)率較高，且易于轉(zhuǎn)移［2］。準確的臨床診斷對手術(shù)方式的選擇、療效判斷以及預后評估有重要價值。微小RNA（microRNA，miR）是一類內(nèi)源性小分子非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后起調(diào)控基因表達的作用［3］。既往研究證實，miR-21 與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，參與膀胱癌細胞的增殖、侵襲等過程［4］。研究發(fā)現(xiàn)BUC 患者的尿液miR-21 表達上調(diào)，且穩(wěn)定性較高，可作為BUC 診斷及預后判斷的無創(chuàng)尿液標志物［5］。此外，三維超聲成像技術(shù)（three-dimensional ultrasonography，3D-US）具有全面的解剖可視化、高分辨率和實時評估的優(yōu)勢，可用于膀胱癌的篩查［6］。目前，尿液miR-21 表達聯(lián)合3D-US 對尿路上皮癌診斷價值的相關(guān)研究較少。本研究通過檢測BUC患者和泌尿系良性疾病患者尿液miR-21表達差異，探討B(tài)UC 患者尿液miR-21 表達與組織病理學特征的關(guān)系，并分析尿液 miR-21 聯(lián)合 3D-US 對 BUC 的診斷效能，以期為BUC 診斷提供一項操作便捷且相對無創(chuàng)的可靠技術(shù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016 年3 月—2020 年5 月于河北省滄州市中心醫(yī)院行尿道腫瘤電切術(shù)并經(jīng)病理確診為BUC 的初發(fā)膀胱癌患者，經(jīng)排除患有其他部位腫瘤者后，最終納入病例組78 例，其中男 55 例，女23 例，平均年齡（67.5±8.7）歲。BUC 病理分級按世界衛(wèi)生組織（WHO）2004 分級標準，臨床分期按國際抗癌聯(lián)盟2009年第7版TNM分期標準。78例患者中，非肌層浸潤性BUC（非浸潤組）57 例，肌層浸潤性BUC（浸潤組）21 例；低級別BUC（低級別組）52 例，高級別BUC（高級別組）26 例。同期，收集我院確診并經(jīng)病理證實的80例良性泌尿系疾病患者作為對照組，其中男52 例，女28 例，平均年齡（63.9±7.1）歲。2 組間性別（χ2=1.107）、年齡（t=0.918）差異無統(tǒng)計學意義。本研究通過醫(yī)院倫理委員會審核，研究對象均簽署知情同意書。

1.2 3 D-US檢查 采用Philips Epiq 7型多功能超聲顯像儀，使用CH4-1 腹部凸陣探頭頻率3.5 MHz，三維探頭頻率3.5～5.0 MHz，機械指數(shù)0.05，增益50 dB。待患者膀胱呈適當充盈狀態(tài)后，行常規(guī)二維超聲，檢查患者膀胱的三角區(qū)水平、左右側(cè)壁、膀胱前壁和后壁區(qū)域，選取最佳切面后轉(zhuǎn)換至3D-US模式，通過恥骨聯(lián)合上方腹壁多角度掃描膀胱腫瘤。囑患者減慢呼吸強度，盡量屏氣，采集動態(tài)圖像時間5 min，并自動保存于儀器硬盤。每例患者在15～20 min 內(nèi)完成3D-US 檢查，以上操作均由2名經(jīng)驗豐富的超聲科主治醫(yī)師進行。

1.3 實時熒光定量PCR（qPCR）檢測尿液miR-21 收集病例組及對照組患者晨尿25 mL，2 000 r/min 離心10 min，將尿液沉淀分離，500 mL 磷酸鹽緩沖鹽水洗滌2 次，mirVanaTm PARIS miRNA試劑盒（ABI公司，美國）提取RNA，以-80 ℃儲存待進一步使用。以上提取的RNA 根據(jù)Taqman miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（ABI 公司，美國）進行逆轉(zhuǎn)錄后得到cDNA。逆轉(zhuǎn)錄的條件為：30 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，99 ℃ 5 min，4 ℃5 min，反應結(jié)束后4 ℃保存。采用PRISM 7900 系統(tǒng)（ABI 公司，美國）進行qPCR。反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性10 s，72 ℃退火并延伸30 s，共45個循環(huán)。應用ΔΔCt方法進行標準化，以U6作為內(nèi)參照，計算miR-21相對表達水平。以對照組作為標化樣本，用于計算ΔΔCt。ΔΔCt=ΔC（t待測樣本）-ΔC（t標化樣本），相對量（relative quantity，RQ）=2-ΔΔCt。

1.4 尿細胞學檢查 載玻片固定于專用離心管中，將尿液樣本放入離心管中，1 700 r/min 離心5 min，取出載玻片作巴氏染色。取細胞學涂片后，無水乙醇脫水10 min，二甲苯清除1 min，密封后送病理學鏡檢。尿細胞學診斷結(jié)果分為4 類：（1）陰性（NEG），上皮細胞病變在正常范圍，無非典型細胞和惡性細胞。（2）非典型性尿路上皮細胞（AUC），上皮細胞異型性明顯，但無明確的惡性特征。（3）可疑癌（SUCA），上皮細胞呈惡性變化，但數(shù)量和質(zhì)量不足以診斷癌癥。（4）癌（CA），具有惡性特征的上皮細胞。尿細胞學診斷結(jié)果中NEG 和AUC為陰性，SUCA和CA為陽性。

1.5 膀胱鏡檢查 患者取截石位，局部麻醉后置入膀胱鏡（Wolf 30，德國）。對整個膀胱黏膜和輸尿管的開口進行詳細檢查。如發(fā)現(xiàn)病灶取活檢送病理。以上操作由高年資主治醫(yī)師進行。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，2 組間比較采用獨立樣本t檢驗。計數(shù)資料以例表示。采用受試者工作特征（ROC）曲線分析尿液miR-21 和3D-US 對BUC 的診斷價值，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 BUC 患者尿液miR-21表達與臨床病理特征的關(guān)系 qPCR 結(jié)果顯示，病例組患者尿液miR-21 的相對表達量顯著高于對照組（2.49±0.82vs.1.00±0.00，t=11.183，P＜0.05）。浸潤組尿液miR-21 表達明顯高于非浸潤組，高級別組高于低級別組（P＜0.05）；不同年齡、性別患者之間尿液miR-21表達水平差異均無統(tǒng)計學意義，見表1。

Tab.1 The relationship between urine miR-21 expression and clinicopathological features in patients with BUC表1 BUC患者不同臨床特征分類與尿液miR-21表達的關(guān)系

2.2 尿液miR-21 聯(lián)合3D-US 診斷BUC 尿液miR-21、3D-US、尿液miR-21聯(lián)合3D-US、膀胱鏡和尿細胞學的診斷實驗結(jié)果見表2、圖1。尿液miR-21聯(lián)合3D-US檢查敏感度和特異度均較高，Youden指數(shù)為0.911，接近于膀胱鏡檢查的Youden 指數(shù)0.912。典型BUC患者3D-US圖像見圖2。

Tab.2 The diagnostic efficacy of different examination methods for urothelial carcinoma表2 不同檢查方法評估尿路上皮癌的診斷效能

Fig.1 ROC curve of diagnostic value of different examination methods for BUC圖1 不同檢查方法對BUC診斷價值的ROC曲線

Fig.2 3D-US image of a patient with urothelial carcinoma of the bladder圖2 BUC患者的3D-US圖像

3 討論

BUC 是泌尿系最常見的惡性腫瘤之一，準確的臨床診斷對BUC 手術(shù)方式的選擇、預后和臨床隨訪具有重要價值。目前，膀胱鏡、尿細胞學及超聲檢查是BUC 最常用臨床診斷方法。膀胱鏡檢查可以提高BUC的診斷率，但其仍然是一項有創(chuàng)、復雜，且費用較高的技術(shù)。此外，患者對膀胱鏡檢查的接受度和持續(xù)性較低，通常會影響患者及時診斷和持續(xù)監(jiān)測。尿細胞學檢查雖為無創(chuàng)，但對BUC 診斷的敏感度較低［7］。本研究中尿細胞學檢查敏感度僅為62.82%。傳統(tǒng)二維超聲檢查無創(chuàng)且便捷，易于被患者接受，然而其對體積較小或分布于膀胱頂部和前壁區(qū)域的腫瘤存在監(jiān)測難度較大等局限性，使其缺乏全面的解剖可視化。與二維超聲相比，3D-US 的主要優(yōu)勢在于其多方位的觀察視角和不同的觀察算法，可以通過表面繪制和多平面重建等技術(shù)來顯示數(shù)據(jù)。3D-US在評價解剖結(jié)構(gòu)方面已被證實較二維超聲更具可靠性及可重復性［8］。

miR 在癌細胞的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用［9］。既往研究表明miR能夠通過與抑癌基因mRNA序列上相應的位點結(jié)合，調(diào)控基因表達，促進腫瘤的發(fā)生［10］。miR-21 是進化上高度保守的miR，在肝癌、結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤病程中均呈高表達且與腫瘤病情的進展密切相關(guān)［11-12］。Szarvas等［13］對膀胱尿路上皮癌篩查研究發(fā)現(xiàn)尿液上清可顯示80%的腫瘤畸變。既往研究發(fā)現(xiàn)，尿液miR 分子表達篩查膀胱癌有較高的敏感度和特異度［14］，且尿液miR-21分子表達的穩(wěn)定性較高，具備無創(chuàng)檢測的優(yōu)點，可作為BUC 診斷、預后和臨床隨訪的良好分子標志物［15］；但目前關(guān)于 BUC 病灶內(nèi) miR-21 表達水平的變化趨勢尚未明確。

本研究對比分析78 例BUC 患者和80 例良性泌尿疾病患者尿液miR-21 表達水平，結(jié)果顯示BUC患者尿液miR-21 表達水平與良性泌尿系疾病患者相比顯著升高，提示尿路上皮癌患者尿液miR-21表達上調(diào)可能與其致癌作用存在密切關(guān)系。進一步分析表明，不同的腫瘤分期、分級BUC 患者尿液miR-21 表達水平不同，而與年齡和性別無關(guān)，提示尿液miR-21 表達與尿路上皮癌的組織病理學特征存在相關(guān)性。ROC 曲線結(jié)果提示尿液miR-21 對BUC 有一定診斷價值，但單一應用尿液miR-21 水平診斷BUC，其敏感度仍不足（82.05%），在臨床上診斷BUC尚缺乏說服力，無法完全代替膀胱鏡。本研究應用尿液miR-21 表達聯(lián)合3D-US，探索具有較高敏感度、無創(chuàng)且便捷的BUC 聯(lián)合診斷模式。在臨床診斷中，將 BUC 患者的尿液 miR-21 表達和 3D-US 檢查結(jié)果做并聯(lián)試驗，只要其中一項檢查陽性即認為聯(lián)合檢測陽性，只有兩項檢查結(jié)果均為陰性才認為聯(lián)合檢測陰性，結(jié)果表明，3D-US 診斷BUC 的特異度較高（91.25%）、敏感度較低（78.21%），而尿液miR-21 表達聯(lián)合3D-US 診斷BUC 的敏感度和特異度均較高（94.87%、96.25%），Youden 指數(shù)（0.911）與膀胱鏡（0.912）接近，且陰性預測值高達95.06%。

綜上所述，尿路上皮癌患者尿液miR-21表達上調(diào)，且與組織病理學分期、分級有關(guān)。尿液miR-21表達聯(lián)合3D-US 可作為一項篩查BUC 有效且無創(chuàng)的診斷方法，能夠有效輔助BUC 患者的術(shù)前診斷、臨床治療方案選擇及預后判斷。