一株海洋來源的抑制淡水魚類致病菌菌株的篩選與鑒定

張藝政 王 念 武天舒 謝軍偉 孫 星

（1.滁州學院生物與食品工程學院，安徽 滁州 239000；2.江蘇碧清園食品科技有限公司，江蘇 鹽城 224100）

0 引言

近年來，隨著養殖科技水平的提升以及人們對水產品需求的增加，淡水養殖業得到了蓬勃發展［1-3］。然而，由于多年來人們一直片面追求產量而忽略質量，導致淡水養殖水體的水質不斷下降，滋生出諸多淡水魚類致病菌，嚴重影響淡水魚養殖業的生產效益［4-5］。使用普通抗生素藥物防治淡水魚類致病菌會出現諸多問題，如致病菌耐藥性增強、藥物殘留污染環境、水產品品質下降等［6］。因此，尋找到一種高效無污染的防治技術至關重要。

生物防治技術以無污染、成本低、作用時間長等優勢，逐漸成為魚類病害防治的熱門技術。其中，海洋來源的微生物因其特殊的生境而具有耐高鹽、耐高壓、寡營養等強大的適應環境能力及良好的抑菌作用，被引入諸多生境中用于防治魚類病害［7-9］。筆者從黃海海域采集淺海的海泥與海草等樣品，從中篩選可抑制奇異變形桿菌的菌株，以期為防治淡水魚類致病菌提供更多的理論依據。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗樣品

海泥與海草，采自江蘇省連云港市黃海海域海岸線淺海地區；奇異變形桿菌，來自滁州學院生物與食品工程學院微生物實驗室。

1.2 培養基

2216E培養基：蛋白胨5.0 g、酵母膏1.0 g、磷酸高鐵0.1 g、瓊脂15.0～20.0 g、蒸餾水1 000 mL，加熱溶解后121 ℃高壓滅菌15 min，待冷卻至50 ℃倒入無菌平皿備用。

LB液體培養基：胰蛋白胨10.0 g、酵母提取物5.0 g、氯化鈉10.0 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH值約為7.0。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株的提取與分離。取少許海草與海泥放入試管，倒入10 mL蒸餾水，充分振蕩；用移液槍吸取1 mL渾濁液滴在2216E培養基上，用滅過菌的涂布棒將渾濁液均勻涂布在培養基表面，放入37 ℃恒溫培養箱中培養24 h；將培養基上長出的菌落根據形態分離純化成單菌落，保存于4 ℃冰箱。

1.3.2 抑菌菌株的篩選。用滅過菌的接種環分別挑取分離出的單菌株及奇異變形桿菌少許菌絲，接種到LB液體培養基中，在180 r/min、37 ℃的恒溫搖床中過夜培養；用移液槍吸取1 mL奇異變形桿菌的菌液滴到2216E培養基上，用滅過菌的涂布棒均勻涂開，而后在培養皿中放3張已滅過菌、直徑6 mm的濾紙片，分別吸取分離出的單菌株菌液0.5 mL滴到各濾紙片上。將接種好的單菌株篩選培養皿放入37 ℃恒溫培養箱中培養24 h，觀察每個培養基中3個濾紙片周圍有無抑菌圈，測量抑菌圈的直徑，取平均值，保留具有明顯抑菌圈、可抑制奇異變形桿菌的菌株。

1.3.3 抑菌菌株的生理生化鑒定。對篩選出的菌株進行形態觀察，根據《常見細菌系統鑒定手冊》進行革蘭氏染色、淀粉水解、分解纖維素、硫化氫反應、過氧化氫反應、甲基紅反應、乙酰甲基醇反應和吲哚反應等試驗。

1.3.4 16S rDNA鑒定。取少量篩選到具有抑菌作用菌株的菌絲，接種到2216E培養液中37 ℃振蕩過夜培養。根據DNA提取試劑盒推薦步驟，對菌株的DNA進行提?。阂迫? mL菌液到EP管中，8 000 rpm/min離心2 min，取沉淀物。根據細菌16S rDNA兩端的保守序列，設計細菌通用引物（滁州通用生物有限公司）為PCR擴增，引物序列27F：5＇-TACCTTGTTACGACTT-3＇，1492R：5＇-ATTAGATACCCTDGTAGTCC-3＇。反 應 條件：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火1 min，72 ℃延長1.5 min；30個循環；最后72 ℃延伸5 min。

擴增后，對PCR產物進行電泳檢測，取5 μL擴增樣品在1%瓊脂糖凝膠上、80 V電壓下進行電泳檢測，將條帶清晰、大小正確的目的片段送至通用生物公司進行測序。

1.3.5 序列分析和數據處理。測序完成后，將所測細菌16S rRNA基因序列（大約1 500 bp），與在美國國家生物技術信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）數據庫中選取的與這些菌株親緣關系較近的相關標準菌16S rDNA基因序列，用BioEdit的多序列比對排列軟件進行序列比對；用DNASTAR Lasergene軟件建立Neighbour-Joining發育樹。

2 試驗結果與分析

2.1 抑菌菌株的篩選

筆者從海泥與海草中共分離出32株單菌株，利用奇異變形桿菌對分離出的菌株進行抑菌篩選，僅篩選出一株對奇異變形桿菌生長具有良好抑制作用的菌株，編號為YZ1。菌株YZ1單菌落為乳白色，圓形、全緣、半透明、濕潤、易挑取，菌落直徑1.0～1.5 mm，抑菌圈直徑為22.3 mm。

2.2 菌株YZ1的生理生化鑒定

生理生化鑒定結果表示，菌株YZ1為革蘭氏陽性菌，淀粉水解試驗呈陽性，分解纖維素試驗呈陰性，硫化氫反應呈陽性，在過氧化氫試驗中出現氣泡，甲基紅試驗呈陰性，乙酰甲基醇試驗呈陽性，吲哚反應呈陰性（見表1）。

表1 菌株YZ1的生理生化鑒定結果

2.3 菌株YZ1的16S rDNA鑒定

提取菌株YZ1的DNA，通過PCR擴增目的片段，將目的片段進行測序，利用DNA Star軟件分析目的片段的DNA序列，序列全長為1 429 bp（見圖1）。

圖1 目的片段DNA序列圖（1 429 bp）

將目的片段的DNA序列在NCBI網站進行BLAST比對（見表2），其中近200株芽孢桿菌（Bacillussp.）的DNA序列與目的片段的DNA序列相似性在99%以上。選擇其中9株相似性較高的菌株序列，利用DNASTAR Lasergene軟件構建系統進化樹（見圖3），發現菌株YZ1與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciensstain）M16.s的親緣關系最為接近，結合菌株YZ1的生理生化鑒定結果及采樣地點，證明菌株YZ1屬于海洋來源的芽孢桿菌，暫將其命名為Bacillussp.YZ1。

表2 菌株YZ1 DNA序列BLAST比對結果

圖2 菌株YZ1的系統進化樹

3 結論

因特殊的生境，海洋源微生物具有獨特適應能力、代謝過程及生理功能，進而產生不同于陸地微生物的結構，以及新穎、功能獨特的生物活性物質［8］，應用前景廣泛。筆者通過對從海泥與海草中分離出的32株菌株進行抑菌試驗，僅發現一株菌株可抑制奇異變形桿菌生長，編號為YZ1。筆者初步觀察菌株YZ1的形態（乳白色，圓形、全緣、半透明、濕潤、易挑取，菌落直徑為1.0～1.5 mm）；并對菌株YZ1進行生理生化鑒定，發現其為革蘭氏陽性菌，能水解淀粉，產生硫化氫氣體，分解過氧化氫產生氣泡，但不能分解纖維素和葡萄糖；通過16S rDNA鑒定，其與芽孢桿菌屬在同一物種水平上，與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciensstain）的親緣關系最近，初步認定菌株YZ1屬于海洋來源的解淀粉芽孢桿菌。此結果為淡水魚類病原菌的防治提供了一個可行途徑，但其防治效果和防治機制還需要進一步的研究。