固相萃取/超高效液相色譜－串聯質譜法測定香辛調料中的曲托喹酚

張海超，王 敬，賈海濤，李 瑋，艾連峰*，康維鈞

（1．石家莊海關技術中心，河北 石家莊 050051；2．河北醫科大學 公共衛生學院，河北 石家莊 050017）

曲托喹酚是一種天然的芐基異喹啉類生物堿（如圖1），同時也是一種β2受體激動劑，具有罌粟堿的解痙作用，作用與沙丁胺醇相似，強度為異丙腎上腺素的5～10倍［1］，在臨床上常被用作平喘藥治療支氣管哮喘、哮喘樣支氣管炎。自2019年1月起，曲托喹酚被世界反興奮劑機構列入了禁藥名單。由于曲托喹酚存在于一些天然產物中［2］，極有可能被運動員誤食而引發興奮劑檢測陽性事件。我國反興奮劑中心在2019年8月印發的《大型賽事食源性興奮劑防控工作指南（暫行）》的通知中也將曲托喹酚列入建議檢測化合物清單，明確檢測基質為香辛調料。因此，為杜絕食源性興奮劑事件的發生，建立香辛調料中曲托喹酚的檢測技術，對維護體育運動中的食品安全具有重要意義。

圖1 曲托喹酚的分子結構式Fig．1 Formula structure of tretoquinol

目前關于曲托喹酚的檢測研究報道極少，僅見Okano等［3］采用液相色譜－串聯質譜法測定人體尿液中曲托喹酚的研究，關于植物源性食品中曲托喹酚的研究未見報道。液相色譜－串聯質譜法具有靈敏度高、選擇性好的優點，在其他β2受體激動劑檢測技術上得到了廣泛應用［4－11］。目前關于β2受體激動劑的前處理方式主要有QuEChERS法［4，6］和固相萃取法［7－10］。由于香辛調料成分復雜，含有揮發性油、有機酸、生物堿等多種醇、醛、酮、萜類化合物，采用QuEChERS法會存在凈化不完全。并且有研究報道，PSA、GCB、C18、Florisil等QuEChERS法常用的固相吸附劑對與曲托喹酚性質類似的化合物去甲烏藥堿有不同程度的吸附現象［5］。因此本研究結合曲托喹酚的理化性質，在對比兩種固相萃取凈化技術后，采用MCX柱凈化，超高效液相色譜－串聯質譜法（UPLC－MS/MS）測定了花椒、大料、辣椒、白胡椒、香砂、陳皮、梔子、小茴香、桂皮、孜然、山楂、黑胡椒、香茅草、丁香、香菜籽、千里香、良姜和香葉共18種常見香辛調料基質中的曲托喹酚。該方法簡單、靈敏、普適性強，可為我國體育賽事食品安全保障工作和相關檢測標準的制定提供技術支撐。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

UPLC 8050超高效液相色譜－串聯質譜儀（日本Shimadzu公司）；Sigma 3K－15型離心機（美國Sigma公司）；PT2100型均質器（瑞士Kinematica公司）；N－EVAP112氮吹儀（美國Organomation公司）；渦旋混合器（美國Scientific Industries公司）；Milli-Q純水系統（美國Millipore公司）；Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2．1 mm×100 mm，1．7μm）；Oasis MCX固相萃取柱、Oasis PRiME HLB固相萃取柱（60 mg，3 mL，美國Waters公司）。

乙腈、甲醇、乙醇（色譜純，德國Merck公司）；甲酸（色譜純，德國Fluka公司）；水為Milli-Q高純水；花椒、大料、辣椒、白胡椒、香砂、陳皮、梔子、小茴香、桂皮、孜然、山楂、黑胡椒、香茅草、丁香、香菜籽、千里香、良姜和香葉均從市場上隨機抽取。

100μg/mL曲托喹酚（First Standard品牌標準品）購于天津阿爾塔科技有限公司。

1.2 標準溶液的配制

準確移取曲托喹酚標準品1 mL，用甲醇稀釋，配置成質量濃度為1．0μg/mL的標準溶液，于-18℃下避光保存。在實驗過程中根據需要精確吸取適量標準溶液用0．1%甲酸－乙腈（9∶1，體積比）稀釋至所需質量濃度。

1.3 樣品預處理

準確稱取2 g樣品（精確到0．01 g）于50 mL塑料離心管中，加入20 mL 0．2%甲酸乙醇，于均質器上以10 000 r/min均質1 min。以10 000 r/min離心5 min，取適量上清液過濾膜待凈化。

將MCX固相萃取柱分別采用3 mL甲醇和3 mL水活化，取上述2 mL上清液于固相萃取柱上，待樣液流出，采用3 mL水和3 mL甲醇淋洗，最后用4 mL 5%氨水甲醇洗脫，接收洗脫液于40℃下氮吹至干，用1 mL 0．1%甲酸－乙腈（9∶1）渦旋溶解殘渣，過0．22μm有機濾膜后供UPLC－MS/MS測試。

1.4 儀器分析條件

色譜條件：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2．1 mm×100 mm，1．7μm）；流動相：含0．1%甲酸的水溶液（A）和乙腈（B）；流速：0．4 mL/min；柱溫：35℃；進樣量：5μL；梯度洗脫程序：0～0．5 min，10%B；0．5～4 min，10%～90%B；4～5 min，90%B；5～5．01 min，90%～10%B；5．01～7 min，10%B。

質譜條件：電噴霧電離源ESI（+），采用多反應監測（MRM）模式。離子源溫度為350℃，毛細管溫度為250℃，加熱模塊溫度為350℃，氮氣流速：3．0 L/min，干燥氣流速：10．0 L/min，加熱氣流速：10．0 L/min。MRM監測離子對的質荷比（m/z）分別為346．3、164．2和346．3、137．0，碰撞能量分別為19 eV和45 eV，Q1電壓分別為15 V和15 V，Q3電壓分別為15 V和25 V，其中m/z346．3、164．2為定量離子對。

2 結果與討論

2.1 提取溶液的選擇

提取溶液的選擇以提取更多的目標化合物和更少的雜質為目的。本研究以曲托喹酚的回收率和基質標準溶液的響應值作為判斷標準，在空白樣品中添加50μg/kg曲托喹酚標準溶液作為模擬樣品進行考察。曲托喹酚屬于一種芐基異喹啉類生物堿，其油水分配系數（logP）為2．23，解離常數（pKa）為9．53，水溶性較強，故采用酸性極性溶劑更有利于曲托喹酚的提取。本實驗對比了0．2%甲酸乙醇、0．2%甲酸乙腈、0．2%甲酸水－甲醇（1∶9），0．2%甲酸水－甲醇（9∶1）4種提取溶劑的提取效果。結果顯示，0．2%甲酸水－甲醇（9∶1）的提取回收率約70%，0．2%甲酸乙腈的提取回收率為80%～90%，0．2%甲酸乙醇和0．2%甲酸水－甲醇（1∶9）的提取回收率均在95%以上，且以0．2%甲酸乙醇的提取液響應值更高。

考慮到水和提取溶劑間極性的差異，樣品中含水量的不同可能會影響曲托喹酚的提取效率，本實驗對樣品中含水量的影響進行了考察。以花椒基質樣品為例，向樣品中加適量水浸泡，模擬不同含水量的實際樣品，并采用20 mL含0．2%甲酸的乙醇溶液進行提取，考察曲托喹酚的提取效率。結果表明，樣品中含水量的上升會導致雜質提取較多，引起曲托喹酚提取率的降低，考慮到香辛調料一般為干樣，故在提取過程中，選擇不加水浸泡直接采用含0．2%甲酸的乙醇溶液提取。

2.2 固相萃取凈化的選擇

香辛調料基質的成分復雜多樣，需采取固相萃取凈化方式以降低背景干擾，減少基質效應。由于曲托喹酚在酸性條件下易形成陽離子。本研究對比了兩種固相萃取柱Oasis MCX和Oasis PRiME HLB對花椒、辣椒、桂皮、孜然和小茴香5種基質的凈化效果。結果表明采用PRiME HLB時，曲托喹酚的回收率為54%～125%，而采用MCX柱的回收率為71%～115%。且PRiME HLB固相萃取柱表現出更強的基質效應。分析原因可能是PRiME HLB含有特定比例的親水基和疏水基，對生物堿和基質雜質均有一定保留能力，專屬性差，不能有效去除基質干擾；而MCX柱為將磺酸基鍵合在高度交聯的聚苯乙烯/二乙烯苯（PS/DVB）表面得到的混合型陽離子吸附劑，具有反相和強陽離子交換雙重保留性能，對堿性物質有良好的選擇性和靈敏度。因此，MCX柱對香辛調料中的曲托喹酚表現出了更優越的凈化性能。

2.3 檢測條件的優化

采用不接分析柱的方式向質譜系統注入1μL 1μg/mL標準溶液，在正離子模式下進行全掃描，確定分子離子峰，再以待測物分子離子峰為母離子，對其進行子離子掃描。選擇兩個特征離子164．2和137．2，然后優化出最佳碰撞能量CE和Q1、Q3電壓，最終確定多反應監測的離子對及碰撞能量（見“1．4”）。

選擇Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2．1 mm×100 mm，1．7μm）對曲托喹酚進行分離，比較了流動相以0．1%甲酸水溶液或水作為水相（A）、甲醇或乙腈作為有機相（B）時的分離效果。結果表明，乙腈和甲醇對目標物的靈敏度影響不大，但乙腈作為有機相時峰形更為尖銳。進一步考察流動相中添加不同含量甲酸對化合物的影響。結果顯示，未加甲酸時，曲托喹酚的響應值最高，但峰形展寬嚴重；加入0．1%甲酸后，峰形尖銳，但化合物的峰面積降低約20%；繼續加大甲酸濃度，實驗結果無變化。綜合考慮，本實驗選擇0．1%甲酸水-乙腈作為流動相。由于定溶液對化合物在色譜柱上峰形存在影響，高比例有機相溶劑易導致色譜峰出現溶劑效應，通過實驗比較，采用0．1%甲酸水-乙腈（9∶1）定容，可保證化合物峰形良好且保留時間穩定。圖2為優化條件下0．5 ng/mL曲托喹酚標準溶液的定量離子色譜圖。

圖2 0．5 ng/mL曲托喹酚標準溶液的定量離子色譜圖Fig．2 Chromatogram of quantitative daughter ion of 0．5 ng/mL tretoquinol standard solution

2.4 基質效應

采用5 ng/mL基質標準溶液與5 ng/mL溶劑標準溶液分別進樣3針，將峰面積平均響應值進行比較，利用以下公式評價基質效應的影響［12］：基質效應（ME）=（B/A），其中：B為樣品基質中添加相同含量曲托喹酚的響應值；A為相同含量標準溶液的響應值；ME>1，說明存在基質增強效應；ME<1，說明存在基質減弱效應。實驗發現經MCX柱凈化后基質效應的影響明顯減弱，比如白胡椒凈化前基質效應為0．08，凈化后基質效應為0．86，相差近10倍。但經凈化后各基質表現的基質效應不同（見圖3）。為保證定量結果的準確性，實驗采用空白基質溶液對定量結果進行校正。

圖3 曲托喹酚的基質效應Fig．3 Matrix effect of tretoquinol

2.5 線性關系、檢出限與定量下限

取標準溶液適量，用花椒、大料、辣椒、白胡椒、香砂、陳皮、梔子、小茴香、桂皮、孜然、山楂、黑胡椒、香茅草、丁香、香菜籽、千里香、良姜和香葉18種空白基質溶液分別配制成0．1、0．2、0．5、1、5、20、50 ng/mL標準工作液，在“1．4”條件下依次測定。以各組分的峰面積為縱坐標（y），對應的質量濃度為橫坐標（x，ng/mL）進行線性分析。結果顯示，各基質中的曲托喹酚均在0．1～50 ng/mL范圍內呈良好線性關系，相關系數（r）為0．998 5～0．999 9。在空白樣品中添加低濃度的標準溶液，按“1．3”步驟進行樣品前處理后進樣測定，以信噪比S/N≥3和S/N≥10確定各基質的檢出限（LOD）均為0．2μg/kg，定量下限（LOQ）均為0．5μg/kg。方法適用于曲托喹酚的定量分析。

2.6 準確度與精密度

在優化條件下，用空白樣品進行加標回收和精密度實驗，在18種香辛調料中添加0．5、2、10、100μg/kg 4個不同質量濃度的標準溶液后，按本方法進行加標回收率實驗，每個水平平行測定6次，測得曲托喹酚的回收率為74．5%～98．8%，相對標準偏差（RSD）為3．1%～9．1%（見表1）。方法具有較好的準確度和精密度。

表1 方法的加標回收率及相對標準偏差（n=6）Table 1 Spiked recovery and RSD of the method（n=6）

2.7 實際樣品的分析

采用本方法對隨機在市場上購買的十三香、五香粉、燒烤粉、孜然粉、蒜香粉、麻辣粉共20份樣品進行測定，均未發現陽性結果。

3 結 論

本研究采用酸性乙醇提取，MCX固相萃取柱凈化，以超高效液相色譜－串聯四極桿質譜法建立了香辛調料中曲托喹酚的檢測方法。結果表明，方法的檢出限（LOD）為0．2μg/kg，定量下限（LOQ）為0．5μg/kg，平均回收率為74．5%～98．8%，相對標準偏差（RSD）為3．1%～9．1%。此方法簡單、快速，普適性強、靈敏度高。該方法的建立可為體育賽事香辛調料中曲托喹酚的分析提供技術參考。