中國小腸結腸炎耶爾森菌分布及分子流行病學特征

穆 慧，段 然，秦 帥，肖 萌，賀兆鍇，呂東月，湯德銘，楊晉川，景懷琦，詹 軍，王 鑫

小腸結腸炎耶爾森菌是一種重要的人獸共患腸道病原菌，人類感染主要導致急性胃腸炎、腸系膜淋巴結炎等偽闌尾炎癥狀，有時會出現反應性關節炎或結節性紅斑等后遺癥[1]。根據是否攜帶染色體的粘附侵襲基因(ail)、小腸結腸炎耶爾森菌耐熱性腸毒素A基因(ystA)以及毒力質粒上的粘附素基因(yadA)、yop調節子的轉錄活化因子(virF)，可分為致病性菌株與非致病性菌株[2-3]。致病性小腸結腸炎耶爾森菌與生物1B、2、3、4、5型有密切關系，其中1B被認為是高致病性，生物2-5型為低致病菌[4]。ail基因通常存在于致病性菌株中，但近年來越來越多的研究在生物1A型菌株中檢測到該基因[5-6]。國內學者黃瑛等人[6]報道了ail基因的不同序列型A1型-A3型：A1型與A3型存在于低致病菌與部分生物1A型菌株，A2型存在于高致病菌。小腸結腸炎耶爾森菌最早在美國紐約被報道，此后在世界各國均有發現，是歐洲某些國家腹瀉的主要病原菌[7]。我國小腸結腸炎耶爾森菌分布廣泛[8-9]，在中國的家畜家禽和野生動物等中均有分離，曾引起兩次大流行，造成數百人感染[10]。為了解我國小腸結腸炎耶爾森菌的流行分布情況，本研究對從腹瀉患者、動物、食品和環境標本來源的小腸結腸炎耶爾森菌進行病原學和脈沖場凝膠電泳(PFGE)分子型別特征分析。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 依托國家科技部重大專項與全國小腸結腸炎耶爾森菌病原學監測工作，自1980-2019年中國22個省市自治區，來源于腹瀉病人、家畜家禽、野生動物、食品及外環境的標本分離獲得6 847株小腸結腸炎耶爾森菌。少部分菌株由福建省疾病預防控制中心于恩庶教授惠贈。

1.2 生化表型、血清型、生物型與毒力基因鑒定 對分離到的菌株使用梅里埃Api-20E進行系統生化鑒定，對鑒定為小腸結腸炎耶爾森菌的菌株進行血清型及生物分型，5種(ail、ystA、ystB、yadA、virF)毒力基因的普通PCR檢測[11]，生物型分型方法參照文獻[12]。采用玻片凝集法進行血清分型，分型血清分別來自日本生研株式會社分型血清(O∶3、O∶5、O∶8、O∶9),丹麥SSI診斷血清(O∶3、O∶5、O∶8、O∶9)，本研究組研制的單克隆抗體(O∶3、O∶8、O∶9)及中國生物制品檢定所(現更名為：中國食品藥品檢定研究院)分型血清產品(其他血清型)。自中國醫學菌種保藏中心購買的國際參考菌株52203、52211、52212分別用于O∶3、O∶8、O∶9血清型參比。對部分菌株進行ail基因測序，與NCBI參考序列構建Neighbor-joining系統發育樹(Mega 5.0)。

1.3 脈沖場凝膠電泳(PFGE)分型 參考中國疾病預防控制中心Pulse Net實驗手冊，使用NotI進行酶切；電泳脈沖時間：2～20 s；電泳時間：19 h。具體操作步驟見文獻[13]。采用非加權配對算術平均法(unweighted pair group average method，UPGMA)進行聚類分析，并構建聚類樹。

2 結 果

2.1 來源分布 6 847株小腸結腸炎耶爾森菌主要來源于動物(88.36%，6 050/6 847)，其次是腹瀉病人(6.44%，441/6 847)、食品(4.76%, 326/6 847)及外環境(0.44%, 30/6 847)。在動物源菌株中，家畜以豬源株占比最高(38.21%，2 616/6 847)，野生動物中，嚙齒類相對較高(24.46%，1 675/6 847)(表1)。

2.2 生物血清型分布 2 047株致病性小腸結腸炎耶爾森菌僅存在O∶3和O∶9兩種血清型，其中O∶3血清型以3/O∶3(87.79%，1 797/2 047)為主，其次為4/O∶3(1.07%,22/2 047)、5/O∶3(0.10%, 2/2 047)型；O∶9血清型以2/O∶9型為主(10.45%，214/2 047)，其次為3/O∶9型(0.59%, 12/2 047)。非致病菌4 800株,以生物1A為主(91.4%, 4 387/4 800),生物型2型、3型、4型、5型共計413株(8.6%，413/4 800)，血清型眾多、占比前5位的O∶8、O∶5、O∶3、O∶6、O∶9依次為10%(480/4 800)9.7%(466/4 800)、5.6%(269/4 800)、1.8%(88/4 800)、1.5%(70/4 800)。

2.3 毒力基因分布 如表1所示，致病株共有兩種組合，其中I型占92.67%(1 897/2 047)，攜帶ail、ystA、yadA和virF基因，II型占7.33%(150/2 047)，為丟失毒力質粒的致病菌。非致病株以攜帶ystB基因的III型和所有毒力基因均不攜帶的IV型占比較高，分別占62.83%(3 016/4 800)、36.19%(1 737/4 800)。上述4種典型的基因型別(I、II、III、IV)在所有調查的22個省份多有分布。此外，非致病株還存在僅攜帶ail基因(VI型)或同時攜帶ail和ystB基因(V型)的菌株分布于個別省份。對這兩類菌株的ail進行CDS測序，并與NCBI中的參考序列構建系統進化樹，結果顯示VI型[14]菌株的ail基因與已發表的A1序列型相同，V型菌株ail基因與既往發表的A1、A2、A3型序列均不相同[6]，為新的ail序列型。

表1 不同來源小腸結腸炎耶爾森菌毒力基因分布

2.4 地域分布特征 本研究自22個省市自治區分離到小腸結腸炎耶爾森菌，其中非致病菌在22個省份均有分布，致病菌分布19個省市自治區、分別位于華東(江蘇、浙江、安徽、山東、上海)、華北(北京、天津、內蒙古)、西北(青海、寧夏)、西南(四川、貴州、云南)、東北(吉林、黑龍江)華南(福建、廣西)、華中(江西、河南)。不同省份致病性菌株的優勢血清型存在不同，18個省市自治區以O∶3血清型為主，寧夏以O∶9血清型略占優勢。

2.5 生化反應 系統生化結果顯示致病株與非致病株的主要生化編碼不存在交叉，如致病株的主要生化編碼1014522、1014520、1015523等未見于非致病株的主要生化編碼，非致病株的主要生化編碼1155723、1155523、1114523未見于致病株的主要生化編碼(表3)。比較兩類菌株占比前10位的生化編碼發現，非致病菌普遍比致病性菌株具有更多的陽性生化反應。致病株中，O∶3血清型的主要生化編碼為1014522、1014520、1015523，O∶9血清型的主要生化編碼為1154523。

表2 致病性與非致病性小腸結腸炎耶爾森菌在不同省市自治區的分布

表3 占比前10位的致病性、非致病性小腸結腸炎耶爾森菌生化編碼

2.6 PFGE分型結果 依次分析O∶3血清型與O∶9血清型致病性小腸結腸炎耶爾森菌PFGE型別。1 821株O∶3致病株酶切為93種帶型，占比前5的帶型依次為K6GN11C30021、K6GN11C30012、K6GN11C30068、K6GN11C30042、K6GN11C30058，分別占比46.35%(844/1 821)、22.5%(410/1 821)、4.89%(89/1 821)、4.23%(77/1 821)、1.65%(30/1 821)。優勢帶型K6GN11C30021、K6GN11C30012地域分布最廣泛，分布于17個省市自治區，K6GN11C30012型別的小腸結腸炎耶爾森菌宿主分布最廣泛，除了分布于腹瀉病人、家畜家禽及食品，嚙齒動物和兔中也有分布且為這兩種宿主的優勢帶型。對89株來源于腹瀉病人的小腸結腸炎耶爾森菌菌株進行分析，88.76%(79/89)的人源株與分離自動物或食品的分離株共有20種相同的帶型；75.38%(67/89)人源菌株與當地的動物或食品具有相同的帶型。其他人源株暫未發現與動物及食品菌株一致的帶型。

226株O∶9血清型菌株分為14個帶型，占比前5的帶型依次為K6GN11C90008、K6GN11C90010、K6GN11C90018、K6GN11C90004、K6GN11C90003，分別占比26.11%(59/226)、23.89%(54/226)、21.24%(48/226)11.06%(25/226)、7.52%(17/226)，其中與人相關的帶型有5種(圖1)，3種帶型K6GN11C90003、K6GN11C90004、K6GN11C90008為人源菌株與當地動物或食品中菌株共有，涉及77.78%(7/9)人源菌株。

3 討 論

小腸結腸炎耶爾森菌是一種重要的人類腸道致病菌，本研究對6 847株菌進行病原學與脈沖場凝膠電泳分子分型特征分析發現，我國小腸結腸炎耶爾森菌地域分布廣泛，宿主眾多，在腹瀉病人、家畜家禽、及野生動物中都有分布，眾所周知，豬為小腸結腸炎耶爾森菌的主要宿主[15-17]，農家犬可能是我國致病性小腸結腸炎耶爾森菌感染的重要來源[18-19]。農家犬攜帶的致病性菌株比例較高、與腹瀉患者及豬分離株具有相似的帶型模式(圖2)，部分地區的犬分離株與腹瀉患者及豬分離株具有相同的PFGE帶型(圖1)，提示農家犬與人類感染密切相關。既往研究表明致病性小腸結腸炎耶爾森菌分布具有地域差異，主要分布于北方寒冷地區[20]，本研究顯示分布于我國華東、華北、西北、西南、華南等地區均檢出致病性小腸結腸炎耶爾森菌，初步推測隨著時間的遷移，致病性菌株的分布可能已經沒有明顯的地域差異，這可能與經濟發展，各地區間交通貿易往來頻繁有關。

(紅色為人源株相關信息)

圖2 宿主來源占比前6位的O∶3血清型致病性小腸結腸炎耶爾森菌PFGE帶型構成(圖注僅包含前10種帶型)

不同國家地區的小腸結腸炎耶爾森菌生物血清型分布不同，歐洲、日本、加拿大等國家4/O∶3占主導地位[21-22]。本研究表明，中國致病性菌株僅存在于O∶3與O∶9血清型中，其中O∶3型菌株1 821株，O∶9型菌株226株，以3/O∶3型為主要生物血清型，其次為2/O∶9。3/O∶3型致病菌多分離自豬源株，而2/O∶9型致病菌主要分離自嚙齒類，提示不同宿主動物可能對不同生物血清型菌株的易感性存在差異。生化結果顯示致病性菌株與非致病菌的主要生化編碼不存在交叉，非致病菌普遍比致病性菌株具有更多的陽性生化反應，表明其可能具有更強的生化代謝能力與環境適應力。致病株中，O∶3血清型與O∶9血清型的主要生化編碼亦不存在交叉，表明二者可能具有不同的生化分解能力與生態位。

位于染色體上的ail、ystA基因和位于毒力質粒上的yadA、virf基因決定了小腸結腸炎耶爾森菌的致病性[23]，后者在人工傳代中容易丟失[3]。ail基因既往僅存在于致病菌中，但越來越多的研究在生物1A型菌株中發現該基因[24]，如德國的生豬肉，芬蘭病人與食品分離株[25-26]。國內學者黃瑛等人[6]報道了致病性小腸結腸炎耶爾森菌中ail編碼序列(CDS)A1型-A3型：A1型存在于低致病菌與部分生物1A型菌株，A2型存在于的高致病菌、與A1型相比有21個堿基突變，A3型來自我國低致病菌，與A1型相比存在3個堿基突變。本研究發現多個省份的非致病菌中存在ail基因，只攜帶ail基因的菌株與黃瑛等人[6]報道的A1序列型相同，同時攜帶ail、ystB基因的菌株與既往發表的A1、A2、A3等序列均不相同[6]，為新的ail序列型。

中國致病性小腸結腸炎耶爾森菌PFGE型別多樣，不同地區的PFGE帶型既有共性，又有獨特性，提示小腸結腸炎耶爾森菌的基因有一定的遺傳穩定性及多態性[27]。O∶3血清型菌株的聚類相似性為79.63%，O∶9血清型菌株聚類相似性為83.25%，說明O∶3血清型菌株的PFGE型別更多樣化。來自于19個省市自治區的O∶3血清型菌株，酶切為93種帶型，分布較廣的帶型有5個，菌株數目占比79.63%，其中K6GN11C30021、K6GN11-C30012為優勢帶型，分別占比46.35%、22.5%。K6GN11C30021是人感染小腸結腸炎耶爾森菌株的主要帶型，也是豬和犬的主要帶型。K6GN11C30012帶型宿主分布最廣泛，除了分布于腹瀉病人、家畜家禽及食品中，嚙齒類和兔源株中也有分布且為這兩種宿主的優勢帶型。不同帶型的菌株地域分布范圍具有差異：K6GN11C30021、K6GN11C30012分布最廣泛、均分布于17個省市自治區，其次為K6GN11C30042(13個省)、K6GN11C30068(8個省)、K6GN11C30058(5個省)，而K6GN11C30064僅分布于廣西，K6GN11C30051僅分布于江蘇。不同宿主中帶型種類最為多樣的為豬源菌株，其次為人和犬分離菌株。毒力質粒的丟失不影響PFGE帶型。

不同地區人源菌株PFGE型別分析發現，共有14個省份的人源菌株與當地動物、食品分離株具有相同的PFGE型別，提示動物或食品分離株與人類感染間可能存在關聯。O∶3血清型人源菌株分布于14個省份共有20種帶型，多數省份人源菌株具有2種以上帶型，在當地動物、食品分離株發現相同帶型。O∶9血清型人源菌株分布于5個省份共有5種帶型，4個省份在當地動物、食品分離株發現相同帶型。因此應加強動物及食品的監測力度，防止人群通過染疫的動物及食品感染。

利益沖突：無