噬菌體解聚酶及其與細菌莢膜間作用機制的研究進展

朱明希，何 平，盛躍穎

噬菌體在發現之初，就被認為對細菌治療意義重大。直到青霉素等一系列抗生素被發現、提取和合成，噬菌體療法逐漸居于次位。隨著抗生素的廣泛應用，多重耐藥菌成為重要的醫源性感染源，并且逐漸面臨無藥可醫的境地。在此背景下，噬菌體療法重新在抗菌效能和發展前景上顯示出巨大優勢[1]。噬菌體療法主要是應用噬菌體對致病菌的特異性識別與裂解作用，進行高特異性抗菌，并且理論上對人體正常組織和生理功能的副作用較小，對正常菌群的破壞不大。但是已有文獻也反映，噬菌體療法若要廣泛投入臨床還有很多問題需要克服，如噬菌體與致病菌共進化導致抗菌作用下降，及噬菌體進入人體后會誘導產生抗體等問題[2]。

因此，分離提取噬菌體相關成分進行抗菌治療，同時規避噬菌體的生物風險也開始得到廣泛研究。部分噬菌體的尾絲蛋白被認為包含有特定的解聚酶，能夠識別細菌莢膜并與之結合，主要通過分解莢膜多糖，使莢膜結構完整性破壞而使其喪失對菌體的保護作用，更便于抗生素發揮殺菌作用。甚至有實驗表明，一定條件下機體本身的血清就足以殺死喪失莢膜保護的致病菌[3]。

相比噬菌體，解聚酶對細菌的作用更穩定，對菌株型別的敏感性不易受其他因素影響。已證明針對某種莢膜型的噬菌體，對相同莢膜型的不同菌株的侵染能力有所不同[4]。但若使用針對該莢膜的解聚酶，其對具有相同莢膜型的菌株的作用具有一致性且結果穩定。除此以外，解聚酶的熱穩定性一般較高，可進行提取或表達、純化，適合大量生產[4]。

本文將討論噬菌體尾尖蛋白(tail spike protein, TSP)與細菌莢膜成分(以多糖為主)的相互作用，包括尾尖蛋白包含的解聚酶性質、解聚酶的作用菌株型別及可能的作用機理等。

1 尾絲蛋白-解聚酶概述

細菌莢膜是細菌致病性的重要因素之一，但同時它也為噬菌體的吸附提供位點。噬菌體尾絲一般可特異性識別宿主菌，并通過降解莢膜多糖而穿入細胞，輸入遺傳物質等成分[5-6]。噬菌體尾絲是多種蛋白的復合結構，解聚酶是噬菌體的尾絲實現吸附與降解功能的必要基礎。

自1915年噬菌體被發現后，直到20世紀90年代后期，噬菌體上可以降解細菌莢膜多糖的成分才被真正提取和純化[7]。截至2015年10月，在細菌-噬菌體相互作用的研究領域已有160個以上推定的解聚酶被發現，其編碼核酸序列長度從197 bp至2 417 bp不等[8]。

判斷噬菌體是否能夠產生解聚酶一般是通過觀察其透明噬菌斑(plaque)周圍是否具有半透明的暈圈(halo)，這是噬菌體的解聚酶裂解細菌胞外聚合物(Extracellular Polymeric Substance, EPS)產生的現象。暈圈的大小取決于噬菌體可以產生的解聚酶量以及每個噬菌斑包含的噬菌體個數；同時，噬菌體自身的潛伏期和增殖速率也會對其產生影響[9]。

基于解聚酶的高耐熱性特點可以進行噬菌體與解聚酶的分離。將噬菌體在60 ℃下孵育30 min，待噬菌體被滅活后，再進行菌板點樣實驗觀察是否有半透明暈圈產生[10]。除上述定性分析的方法，還有多種方法可對解聚酶的降解莢膜能力作量化評估。例如，可使用標準結晶紫或二甲基亞甲基藍(DMMB)染料比色法，或對還原糖進行光譜測量以確定莢膜多糖的降解率。除此以外，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳可比較未被降解的莢膜多糖和已被降解的莢膜多糖，或直接用掃描電鏡來測量莢膜厚度，以檢測解聚酶的降解能力。近年來還出現了激光干涉技術，可以根據小分子穿透莢膜的擴散速率來判斷其降解情況[11]。

解聚酶可特異性降解宿主菌的莢膜，部分噬菌體的尾絲甚至包含不止1種解聚酶，可具有雙特異性甚至是多特異性，擴大了噬菌體的宿主范圍。雙重宿主特異性使這類噬菌體具有明顯的進化優勢。這種現象的產生較為普遍，可能是具有2種不同宿主特異性尾尖蛋白的噬菌體在侵染同一宿主后，產生了第3種同時具有2種尾尖蛋白的噬菌體[5]。以肺炎克雷伯菌的噬菌體?K5-2為例，Dean Scholl等人通過實驗證明每一個噬菌體?K5-2都含有K5和K30/K69兩種解聚酶，而不是存在2個分別包含K5和K30/K69解聚酶的噬菌體集群[3]。再如，針對肺炎克雷伯菌的噬菌體IME205可產生2種解聚酶Dpo42和Dpo43，分別對肺克K47莢膜型菌株及K64莢膜型菌株有特異性作用[12]。

2 解聚酶的結構、分類及作用機制

2.1 解聚酶的結構 不同的解聚酶在作用底物、理化性質等方面具有顯著差異，但它們具有相似的保守結構特征。大部分解聚酶存在于噬菌體尾絲的底板部位，一般構成同源三聚體(其中也有例外，如大腸桿菌噬菌體 63D 的解聚酶呈現同源四聚體結構[9])。每一個亞基都是平行的右手β-螺旋結構，該結構有利于拓展活性位點，可識別多糖結構并與其更緊密地貼合。正是由于這種三聚體以及每個亞基的β-折疊高度交織的結構，使解聚酶的化學性質十分穩定，可以在較寬泛的溫度區間和pH值區間內都能保持活性[9,13-14]。

解聚酶因底物的不同而具有不同結構，但解聚酶所在的尾尖蛋白結構具有一定相似性。一般地，尾尖蛋白結構可以分為3個部分：N-末端結構域、中間結構域及C-末端結構域。以鮑曼不動桿菌噬菌體ΦAB6為例，其尾尖蛋白TSP三聚體結構中的一個單體如圖1所示[15]。N-末端結構域可對應圖中particle-binding domain，一般用于受體結合蛋白(receptor binding protein, RBP)或受體結合區(receptor binding domain, RBD)與尾絲結構或底板結構的連接；中間結構域的空間占比較大，活性部分可對應圖中RBD，一般用于宿主的識別和發揮解聚酶活性；C-末端結構域即C-terminal domain，一般用于解聚酶單體蛋白的三聚體化，同時也發揮受體識別的作用。對于同一噬菌體群，其N-末端和C-末端的結構域是保守的，但中間結構域的可變性很大，用于適應不同宿主以及不同生存環境[13]。

圖1 ΦAB6 尾尖蛋白(TSP)單體的結構域[15]

除上述的尾絲自身結構外，還存在很多噬菌體通過附加在尾部的輔助結構域來介導與宿主的識別。例如部分長尾噬菌體和肌尾噬菌體，在其尾部蛋白的C-末端結合有Ig樣結構域，目前推測該結構域與細胞表面糖類結構的結合作用有關[13]。

2.2 解聚酶的分類及作用機制 根據解聚酶的存在形式可分為以下兩類：其一是作為噬菌體結構的組成部分，其二是裂解宿主細胞過程中產生的可溶性蛋白質。絕大多數的噬菌體解聚酶屬于第一種類型，而第二類解聚酶不與結構基因有關，目前尚無法進行認定分類。本篇綜述將著重討論作為噬菌體的結構——尾絲蛋白復合物的組成部分而存在的解聚酶。

根據解聚酶的作用機制不同，可分為水解酶和裂解酶兩大類。這兩種解聚酶的作用方式將細菌的肽聚糖、莢膜多糖或脂多糖降解為低聚糖。

2.2.1 水解酶 此類解聚酶的作用機制為催化糖苷鍵水解，包括唾液酸酶、乙酰化酶、木糖苷酶、葡聚糖酶、鼠李糖胺酶等。以唾液酸酶為例，唾液酸酶作用于多聚糖末端的唾液酸的α-鍵。唾液酸廣泛存在于細胞表面寡聚糖的末端，并且在多種致病菌中，唾液酸屏障都具有免疫防御的作用，與細菌致病力相關。唾液酸酶的作用可能對細菌生存沒有直接影響，但莢膜結構的破壞使細菌對補體等的殺菌作用更加敏感，并且增強了巨噬細胞的吞噬作用[8]。

近年來研究發現，不同解聚酶對其作用的底物有不同的作用結構，并有其特異性的作用方式。如大腸桿菌噬菌體 HK620的尾絲蛋白 TSP 具有內切N-乙酰氨基葡糖苷酶活性，可以分解宿主菌表面脂多糖的O抗原，能將O抗原的六糖重復序列分解為六糖分子。缺失N-末端結構域的TSP(TSPΔD)為三聚體結構，三聚體軸心可平行地結合細菌O抗原六糖重復序列結構的一個六糖結構(如圖2)。TSPΔD的每一個單體結合位點都位于β-螺旋結構域，結合槽表面帶有負電荷，能與一個六糖結構形成17個氫鍵，隨后通過水解產生的六糖分子，其還原端均具有N-乙酰氨基葡萄糖。由于空間限制，TSPΔD的結合槽內每次只能容納一個六糖序列，理論上若僅從O抗原的外端進行切割，產物應為單一的六糖分子，然而通過分析裂解產物發現還存在更長的糖鏈，因此推測也存在從O抗原的內端進行切割的情況[16]。

E372為Glu372，D339為Asp339。

除了對大腸桿菌的噬菌體及解聚酶研究較深入外，也有研究對肺炎克雷伯菌的噬菌體及其解聚酶作用機制開展了較全面的研究。如研究發現肺炎克雷伯菌噬菌體KP32的尾絲蛋白 KP32gp38 具有解聚酶活性。其酶的催化結構為一個“催化口袋”，在這個“口袋”中存在4個重要的氨基酸殘基，分別是：Glu170，Asp229，Glu239和Asp241(如圖3C)。該糖苷水解酶通過以上氨基酸殘基的羧基之間的距離(Glu239與Asp229的羧基間距；Asp241與Glu170的羧基間距)來實現其生理活性——羧基間的距離不同，糖苷酶的作用機制也將發生變化。而在尾絲蛋白 KP32gp38 催化位點的鄰近部位還有一個結構，稱為糖類結合模塊(carbohydrate binding modules, CBMs)(如圖3A、B)。該模塊的頂端區域含有芳香殘基，這一類殘基可通過其芳香環與糖類底物間成鍵，從而將底物錨定于催化位點的鄰近部位，并促進催化作用。根據噬菌體家族的不同，CBM的糖類結合位點以及結合糖類的特異性可能不同[17]。

E170為Glu170，D229為Asp229，E239為Glu239，D241為Asp241。

2.2.2 裂解酶 裂解酶是通過β消除機制裂解β-1,4糖苷鍵，過程中不利用水分子，如透明質酸裂解酶、藻酸鹽裂解酶和果膠裂解酶等。以透明質酸裂解酶為例，透明質酸是一種線性未硫酸化的糖胺葡聚糖聚合物，葡萄球菌、梭狀芽孢桿菌、鏈球菌等具有透明質酸裂解酶，可以增加組織滲透性，增強其致病力。在一些前噬菌體中也可發現該酶，用于突破細菌莢膜以及促進溶原性轉化。細菌細胞壁的肽聚糖結構是由N-乙酰葡糖胺(NAG)和N-乙酰胞壁酸(NAM)兩種單糖互相間隔連接成長鏈，這種肽聚糖分子交織覆蓋在細胞膜上。從結構來看，部分解聚酶能作用于肽聚糖分子間的聯合鍵，如：N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷酶可切割NAG、NAM間的β-1,4糖苷鍵；N-乙酰基-β-D-胞壁質酶可切割NAM和NAG間的β-1,4糖苷鍵；N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酸酰胺酶可切割切割糖基與肽間的的酰胺鍵等[18]。

針對大腸桿菌K5菌株的噬菌體K5A能編碼一種裂解酶KflA，該裂解酶存在于尾絲蛋白，可裂解K5的莢膜多糖上的重復序列。Kf5A由三聚體構成，每個單體可分為3部分——N-末端的α-螺旋結構域、中段單鏈、C-末端的右手β-螺旋結構域。3個單體在C-末端纏結。Kf5A中主要起催化β-消除反應的氨基酸殘基是Glu206和Lys208。Glu206的羧基從C5獲得質子，發生質子化；葡萄糖醛酸的C5的質子發生解離；質子化的Glu206的羧基和去質子化的葡萄糖醛酸的C5之間形成氫鍵。Lys208作為中間傳遞體，接受C5的質子并將其傳遞給糖苷鍵上的氧原子，通過上述過程實現裂解糖苷鍵作用[19-20]。

除此以外，極少部分的噬菌體具有脂肪解聚酶，其作用于三酰基甘油的羧基酯鍵的酶，可釋放有機酸和甘油。目前在某些嗜纖維素菌屬噬菌體和假單胞菌噬菌體中發現脂肪解聚酶結構域的存在[8]。

對于不同科的噬菌體，解聚酶的所在位置也可不同。對于肌尾噬菌體科，其尾絲上可能存在的解聚酶有唾液酸酶或果膠裂解酶：底盤上可能存在的解聚酶有唾液酸酶、果膠裂解酶或肽酶；對于短尾噬菌體科，其頸部可能有唾液酸酶或果膠裂解酶，尾絲可能有唾液酸酶或果膠裂解酶，底盤可能有果膠裂解酶；對于長尾噬菌體科，頸部可能有唾液酸酶或果膠裂解酶，尾絲可能有果膠裂解酶，底盤可能有唾液酸酶或果膠裂解酶[8]。

2.3 解聚酶的作用條件 尾絲蛋白的解聚酶活性范圍較廣泛，對環境的要求較低。如鮑曼不動桿菌的新型肌尾噬菌體(vB_AbaM_B9)，其莢膜解聚酶B9gp69在一個很寬泛的pH值(5～9)、離子強度(0～500 mmol/L)和溫度(20 ℃～80 ℃)范圍內都能保持活性。并且在體外人肺細胞、哺乳動物細胞和人血清模型中進行試驗，證明B9gp69對細胞無害。人血清中，K45菌株對血清的補體殺傷具有抗性，而經過解聚酶B9gp69處理后，K45菌株對體外血清敏感并被殺滅[21]。

噬菌體解聚酶具有其各自發揮作用的最佳環境，在特定條件下表現出最大活性。以針對大腸桿菌K1型莢膜多糖的大腸桿菌噬菌體的神經氨酸酶為例：其表現最大活性的酸堿度區間在pH 5.2到5.5。緩沖液的摩爾濃度同樣對酶活性大小造成影響：在磷酸鹽和乙酸鹽緩沖液中，神經氨酸酶的最大Kl水解速率均為0.05 mmol/L。向乙酸鹽緩沖液中添加9 mmol/L CaCl2會嚴重降低酶的活性，在此基礎上再加入155 mmol/L NaCl，抑制作用將更為明顯[21]。

2.4 解聚酶的變異 為了適應莢膜多糖結構以完成侵染，解聚酶可發生結構變化。通常來說，自然發生的適應可以有以下兩種類型：

其一，通過突變來改變活性位點，屬于垂直轉移。此種突變一般發生在中間結構域，并且不會改變β-螺旋結構。噬菌體可以通過改變蛋白的折疊方式，使同一肽鏈因最終空間構象的不同而能夠適應不同的底物[9]。

其二，通過與其他噬菌體進行多糖識別結構域的交換來實現特異性的改變。這類噬菌體通常具有高度保守的N-末端結構域，因其與解聚酶與尾絲結構或底板結構的連接相關。有的噬菌體還進化出更復雜的受體結合蛋白RBP結構來實現解聚酶和病毒體的連接[9]。

3 總結與展望

目前噬菌體療法尚未被廣泛普及，很大程度上是由于噬菌體存在潛在安全風險。噬菌體的遺傳物質中可能攜帶抗生素抗性基因或其他細菌毒力因子，通過轉導等方式可能轉移到細菌中，造成致病菌抗性增強。若不選用溶原性噬菌體而選用裂解性噬菌體，則可能引起大量細菌裂解，導致短時間內大量內毒素和超抗原釋放，從而引發炎癥反應，使患者產生嚴重不良反應。并且噬菌體本身存在的免疫原性可能激發機體的清除作用，使得有效噬菌體濃度難以維持[22]。解聚酶作為非生物體，其安全性相比噬菌體更好，實際的應用療效與毒副作用仍有待進一步研究。

解聚酶可以使細菌的莢膜被降解，雖無法直接殺死細菌，但若輔以抗生素治療能達到更好殺菌效果。研究顯示，細菌感染的個體可以依靠自身免疫力甚至是被抑制的免疫力將經解聚酶酶處理的細菌殺死，這是由于解聚酶降解細菌莢膜后，細菌對補體系統的殺菌作用更敏感，并且能增強巨噬細胞的吞噬作用[8,23]。

目前部分噬菌體解聚酶已經在臨床得到應用。如已有臨床使用3種解聚酶的復合物破壞陰溝腸桿菌的生物膜。部分特定酶沒有已知噬菌體編碼，可通過對噬菌體進行基因改造來實現[8]。

在醫學、化學甚至食品加工行業，噬菌體解聚酶均有潛在應用前景。除此以外，解聚酶還可應用于細菌檢測與診斷。特定的解聚酶已應用于肺炎克雷伯菌的莢膜分型。例如，對于肺炎克雷伯菌而言，莢膜合成位點——K-locus 長10～30 bp，K-locus的中央區域高度可變，編碼合成莢膜特異糖類、加工輸出蛋白質等。因噬菌體對莢膜成分特異性識別，可針對莢膜型別來進行肺炎克雷伯菌的分型，即Kl分型方法[24-25]。

噬菌體以其簡單的生物學特性和基因編輯的簡便性，便于誘導編碼多種蛋白質等生物成分，可作為天然的蛋白質庫，在生物技術方面擁有巨大意義[8]。由此可以推測，除了將已有解聚酶應用于抗菌治療外，利用噬菌體的基因工程技術設計制造針對某些耐藥性致病菌的解聚酶也具有廣闊的臨床應用前景。

利益沖突：無