牡丹江野生鹿血中伯氏疏螺旋體分子檢測

于昕宇，胡 陽，樊佳鵬，鄧小麗，王春仁，常巧呈

黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江大慶 163000

伯氏疏螺旋體隸屬于螺旋體目，螺旋體科，疏螺旋體屬，病原通常呈單細胞疏松盤繞的左旋螺旋結(jié)構(gòu)，是一類可寄生于哺乳動物各器官組織內(nèi)的革蘭氏陰性菌。其宿主動物主要分兩大類：一類為小型的禽類、獸類及嚙齒類動物，最為常見的是各種鼠類、兔子以及鳥類，是幼蜱和若蜱的供血宿主和病原儲存宿主；另一類為大型的鹿科動物及家畜，常見的有鹿、馬、牛、羊、犬等，是成蜱的主要供血宿主。伯氏疏螺旋體引起的疾病為“萊姆病”，該病在世界各地流行，在我國主要分布東北地區(qū)，給人類健康和畜牧業(yè)造成的經(jīng)濟損失十分巨大。本實驗對牡丹江海林市野生鹿血攜帶伯氏疏螺旋體病原的情況進行分子流行病學(xué)調(diào)查，報道如下。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2019年6月間，從我國牡丹江地區(qū)海林市采集20份野生鹿的血液樣本，所有樣本均為靜脈采血，分別收集到含有抗凝劑管中并標(biāo)記，置-20℃冰箱保存。

1.2 主要試劑

血液DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；DL-2 000 Marker、2×Tamaster Mix均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 dNA提取

將采集到的血液，按照血液DNA提取試劑盒說明書提取DNA，并置-20℃冰箱保存，備用。

1.4 伯氏疏螺旋體基因序列的擴增

參考相關(guān)文獻中的引物序列擴增鹿血液樣本中的伯氏疏螺旋體5S-23SrDNA基因片段[1]。擴增目的片段的引物序列為：上游引物 5'-CGACCTTCTTCGCCTTAAAGC-3'和下游引物5'- TAAGCTGACTAATACTAATTACCC -3’。PCR擴增體系（總體積25 μL）：2xTap Master Mix(Dye Plus) 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，模板DNA1μL，dd H2O 10.5μL。PCR擴增程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，62℃退火1 min（每循環(huán)下降0.5℃），72℃延伸1 min，共38個循環(huán)；72℃再延伸7min。取PCR擴增產(chǎn)物，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 伯氏疏螺旋體測序及進化分析

將檢測出陽性的PCR擴增產(chǎn)物送往吉林庫美生物工程股份有限公司進行測序。測序成功的序列經(jīng)拼接后，使用CLC軟件對所得完整序列進行分類。隨后通過NCBI上的BLAST程序檢索參照序列,應(yīng)用MEGA6與相關(guān)病原進行進化性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 伯氏疏螺旋體5S-23SrDNA序列擴增

瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示5S-23SrDNA部分序列大小為412 bp左右（圖1），與預(yù)期結(jié)果相符。

2.2 伯氏疏螺旋體5S-23SrDNA序列的進化及分析

本實驗所獲得的伯氏疏螺旋體測序結(jié)果比對分析可分為2個類型，分別是B.afzelii和B.garinii，其中B.afzelii型與德國分離得到的B.afzelii型CP018262.1在同一進化分支上，B.garinii型與法國分離到的B.garinii型 CP028861.1在同一進化分支上（見圖2）。

圖2 伯氏疏螺旋體陽性測定結(jié)果構(gòu)建進化樹

3 討論

研究表明通過擴增伯氏疏螺旋體的核糖體5 S-23S基因之間的可變區(qū)，可以檢測并鑒定出目前已發(fā)現(xiàn)的幾乎所有伯氏疏螺旋體基因型。故本研究采用擴增伯氏疏螺旋體的5S-23SrDNA基因片段進行伯氏疏螺旋體的檢測，結(jié)果顯示在20份野生鹿血樣本中，7份檢出為伯氏疏螺旋體DNA片段，陽性率為35%。該檢測結(jié)果提示牡丹江海林市地區(qū)存在較高的伯氏疏螺旋體的自然感染，為蜱傳病原相關(guān)疾病的潛在疫原地，可能會對人群和家畜的健康產(chǎn)生潛在危害。

源性分析發(fā)現(xiàn)，6條陽性序列與法國分離到的B.garinii型CP028861.1在同一進化分支上，有1條與德國分離得到的B.afzelii型CP018262.1在同一進化分支上。由伯氏疏螺旋體引起的萊姆病于1975年在美國被首次描述和發(fā)現(xiàn)，伯氏疏螺旋體在我國主要分布在東北、華北和西北的林區(qū)，發(fā)病率高，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，該病原是一種嚴(yán)重威脅人類健康和畜牧業(yè)發(fā)展的蜱傳疾病[2]。在全球范圍內(nèi)伯氏疏螺旋體至少有23個基因型[3]。在這些基因中已有研究發(fā)現(xiàn)至少有8種對人類有致病型[4]，其中包括本研究中發(fā)現(xiàn)的B.garinii和B. afzelii，與在牡丹江地區(qū)的景區(qū)檢測到的基因型一致。而在被調(diào)查過的其他省份的景區(qū)中均未檢測到伯氏疏螺旋體[5]。這也更加充分的表明了牡丹江地區(qū)是伯氏疏螺旋體重要的自然疫原地。

本次調(diào)查是首次在該地野生區(qū)動物鹿的血液中檢測到伯氏疏螺旋體，該地區(qū)萊姆病的防控具有重要意義。