煙草莖點病菌生物學特性及室內毒力測定

商勝華 江艷 桑維鈞 張開虹 楊茂發

摘 要：為明確煙草莖點病菌廣生莖點霉Phoma omnivirens的最佳培養條件并篩選出有效的防治藥劑，為生產實踐中防治煙草莖點病提供理論依據。以病原菌P.omnivirens為試材，采用菌絲生長速率法，研究了病原菌P.omnivirens的生物學特性，并測定了12種供試殺菌劑對病原菌的抑制效果。病原菌P.omnivirens的最適培養基為牛肉膏蛋白胨培養基、燕麥培養基和馬鈴薯培養基;菌絲在5～30 ℃范圍內均可生長，最適溫度為30 ℃，5 ℃時菌絲生長最慢;PDA培養基pH為10時菌絲生長最快;光照對菌絲生長無顯著影響;最佳碳源為蔗糖，最佳氮源為硝酸鉀和硝酸鈣;菌絲的致死溫度為58 ℃ 10 min。12種殺菌劑中，3%中生菌素WP具有最佳抑菌效果，EC50最小，為0.9419 mg/L;其次是EC50為2.6940 mg/L的0.3%梧寧霉素AS和EC50為2.7917 mg/L的80%代森錳鋅WP。生產上可將這3種藥劑作為防治煙草莖點病的備選藥劑。

關鍵詞：煙草莖點病;廣生莖點霉;生物學特性;毒力測定

中圖分類號：S432.1

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0457（2021）02-0001-08

國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2021.02.001

Abstract：In order to provide theoretical basis for prevention and control of tobacco black spot stalk，this study explored the biological characteristics of Phoma omnivirens and tested its virulence determination.The biological characteristics of P.omnivirens was analyzed by hypha growth rate method，and the effect of twelve fungicides on the pathogen were also determined.The results showed that Nutrient Agar（NA），Oatmeal Agar（OMA） and Potato Dextrose Agar（PDA） were the most suitable culture medium for the growth of P.omnivirens.The mycelium could grow in the temperatures ranging from 5 ℃ to 30 ℃，30 ℃ was the optimum temperature for mycelium growth，and the mycelium grew the slowest at 5 ℃.The mycelium grew fastest at pH 10 in PDA.Different light conditions did not significantly influence the growth of mycelium.The optimal carbon source for the medium were sucrose，and the best nitrogen sources were potassium nitrate and calcium nitrate，respectively.The lethal temperatures of mycelium was 58 ℃ for 10 min.Among the 12 fungicides，3% Zhongshengmycin had the best inhibitory effect with the lowest EC50 of 0.9419 mg/L;followed by 0.3% Tetramycin and 80% Mancozeb，with EC50 of 2.6940 mg/L and 2.7917 mg/L，respectively.These three fungicides can be used to control tobacco black spot stalk in the field.

Keywords：tobacco black spot stalk;Phoma omnivirens;biological characteristics;virulence determination

17世紀初葉，煙草開始傳入我國[1-2]，成為我國重要的經濟作物之一，在我國的經濟發展上起到了極大的促進作用。但煙草病害的發生制約了煙葉產量的提高，使煙農收入受到嚴重影響。截止2002年，已報道116種煙草病害，其中79種為侵染性病害，37種為非侵染性病害[3-4]。煙草莖點病是一種偶發性的真菌性病害，可危害黃花煙和普通煙，田間大多于成株期危害煙株莖基部，使養分和水分的疏導受阻，葉片早衰，嚴重時莖稈和葉片枯死，造成煙葉產量下降、品質降低[5]。研究煙草莖點病菌的生物學特性、篩選高效抑制病原菌生長的殺菌劑對了解煙草莖點病的發生規律和生產上有效防治該病害具有重要意義。于莉等[6]最早在吉林省發現煙草莖點病，并將煙草莖點病病原鑒定為半知菌亞門Deuteromycotina，球殼孢目Sphaeropsidales，球殼孢科Sphaeropsidaceae，莖點霉屬Phoma，Phoma tabaci Em.Sousa da Camara。此后，該病害也僅在吉林[7-8]、陜西[9]和河南[10]三省有過報道，但均未開展深入研究。直至2018年，江艷等[11]在貴州省再次發現了煙草莖點病，并根據形態學特征和分子生物學技術將病原菌鑒定為廣生莖點霉Phoma omnivirens，致病性測定結果表明該病原菌可侵染煙株的葉片和莖稈。目前，還未見關于煙草莖點病病原菌生物學特性研究和防治該病害的相關報道。鑒于此，本研究采用菌絲生長速率法對煙草莖點病菌P.omnivirens的生物學特性及室內毒力測定進行研究。以期能明確最適宜P.omnivirens生長的條件，同時篩選出高效抑制其生長的殺菌劑，為田間防治該病害提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株：研究所用菌株為廣生莖點霉P.omnivirens，采集于貴州省貴安新區具有典型發病癥狀的煙草莖點病病株，經分離、鑒定及致病性測定的病原菌菌株，現保存于貴州大學農學院植物病理教研室，菌株編號為HGUP8001。

供試藥劑：3%中生菌素WP，福建凱立生物制品有限公司;0.3%梧寧霉素AS，遼寧微科生物工程股份有限公司;80%代森錳鋅WP，四川國光農業股份有限公司;20%苯醚甲環唑EW，青島瀚生生物科技股份有限公司;40%丙環唑ME，青島瀚生生物科技股份有限公司;70%甲基硫菌靈WP，江蘇龍燈化學有限公司;50%福美雙WP，河北贊峰生物工程有限公司;12.5%腈菌唑EW，青島瀚生生物科技股份有限公司;8%寧南霉素AS，德強生物股份有限公司;80%乙蒜素EC，河南科邦化工有限公司;8×108個/g蠟質芽孢桿菌WP，山東泰諾藥業有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的生物學特性研究

培養基對菌絲生長的影響：參照方中達[12]的方法配置以下培養基：牛肉膏蛋白胨培養基（NA）、燕麥瓊脂培養基（OMA）、馬鈴薯瓊脂培養基（PDA）、玉米粉瓊脂培養基（CMA）、查氏培養基（Czapek）、胡蘿卜瓊脂培養基（CDA）、麥芽汁瓊脂培養基（MEA），pH為配制培養基時的自然值。供試菌株接于PDA平板， 25 ℃黑暗恒溫培養5 d，用打孔器沿菌落邊緣打孔，取打下的菌餅接于供試培養基平板中央，菌絲面朝下，每處理3個重復，置于25 ℃黑暗恒溫的同一培養箱中培養，每天觀察菌落情況，5 d后測量菌落直徑。該研究中接種的所有菌餅打取方法及接種方法如上，培養皿直徑均為90 mm，菌落直徑均使用十字交叉法測量。

溫度對菌絲生長的影響：將5 mm菌餅接種于PDA平板中央，分別置于5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 ℃的培養箱中恒溫黑暗培養，每處理3個重復，每日觀察，5 d后測量菌落直徑，培養基pH為配制時的自然值。

pH值對菌絲生長的影響：用1 mol/L的稀鹽酸和1 mol/L的氫氧化鈉溶液將PDA培養基的pH值調為4、5、6、7、8、9、10、11，平板中央接入直徑5 mm的菌餅，每處理3個重復，25 ℃恒溫黑暗的同一培養箱中培養，每日觀察，5 d后測量菌落直徑。

光照條件對菌絲生長的影響：在PDA平板上接入直徑5 mm的菌餅，培養基pH為配制時的自然值，分別置不同光照（連續光照、24 h光暗交替和連續黑暗）條件下25 ℃恒溫培養，每處理3個重復，每日觀察，5 d后測量菌落直徑。

菌絲致死溫度：在每支試管中裝入5 mL無菌水，并接入3個直徑為5 mm的菌餅，分別置于40、45、50、55、60、65、70 ℃的水浴鍋中恒溫水浴10 min，取出流水冷卻，將各處理的菌餅接于PDA平板，培養基pH為配制時的自然值，每平板1個菌餅，置于25 ℃恒溫黑暗的同一培養箱中培養，每日觀察，5 d后根據各處理能否長出菌絲確定致死區間，能長出菌絲的最高溫度為致死區間下限，無菌絲長出的最低溫度為致死區間上限;區間內以1 ℃為一個梯度，每溫度為一個處理，根據各處理能否長出菌絲確定致死溫度，即不長菌絲的最低溫度為菌絲致死溫度。

碳、氮源對菌絲生長的影響：以等量的麥芽糖、葡萄糖、甘露醇、乳糖、淀粉、果糖、肌醇代替查氏培養基中的蔗糖，同時蔗糖為碳源作為對照;以等量L-苯丙氨酸、氨基乙酸、草酸銨、L-精氨酸、L-谷氨酸、硝酸鉀、硝酸鈣、硫酸銨代替查氏培養基中的硝酸鈉，硝酸鈉為氮源作為對照，制成不同碳、氮源的培養基平板，接入直徑5 mm的菌餅，培養基pH均為配制時的自然值，25 ℃恒溫黑暗的同一培養箱中培養，每日觀察，5 d后測量菌落直徑。

1.2.2 室內毒力測定

采用菌絲生長速率法[13]，測定各供試殺菌劑對病原菌P.omnivirens的抑制作用，供試藥劑劑型及生產廠家見1.1。參照高亞星等[14]配制不同濃度梯度農藥的方法，將供試藥劑用無菌水配制成各藥劑所需的濃度梯度的10倍，然后按9∶1 的比例將PDA培養基與所配藥劑混合，制成各濃度梯度的含藥平板，以加等量無菌水的培養基平板為對照，每處理3個重復，各平板接入直徑為5 mm的菌餅，25 ℃黑暗條件恒溫培養，每日觀察，7 d后十字交叉法測量菌落直徑，并根據抑制率公式[15]計算各處理抑制率。

抑制率（%）=[（對照菌落直徑-菌餅直徑）-（處理菌落直徑-菌餅直徑）]/（對照菌落直徑-菌餅直徑）×100

1.3 數據統計與分析

研究數據用Excel 2016進行統計和生長速率計算，采用DPS 7.05的Duncan氏新復極差法進行差異顯著性分析，采用Graphpad prism 7.0繪制柱形圖，用農藥室內試驗數據處理系統軟件[16]計算毒力回歸方程Y=A+B*X，抑制中濃度EC50和相關系數 R，X為藥劑濃度的對數值，Y為菌絲體抑制百分率的機率值。

2 結果與分析

2.1 病原的生物學特性

2.1.1 不同培養基對菌絲生長的影響

煙草莖點病菌在不同培養基中的生長速率如圖1所示，在供試的7種培養基上均能生長，最利于煙草莖點病菌生長的培養基是PDA、OMA和NA，菌絲生長最快，與其他培養基上的菌絲生長速率差異顯著，其次是CMA、Czapek、CDA，而在MEA培養基上生長最慢，生長速率最小。

2.1.2 溫度對菌絲生長的影響

如圖2所示，P.omnivirens在5～30 ℃條件下均能生長，且隨著溫度的升高生長越快，各處理的菌絲生長速率差異顯著。5 ℃時菌絲生長緩慢，僅長出少許稀薄的菌絲，30 ℃時菌絲生長最快且濃密，35 ℃及以上溫度時菌絲停止生長。

2.1.3 pH對菌絲生長的影響

如圖3所示，P.omnivirens對pH有較強的適應性，在pH 4～11范圍內均可生長，在pH 4～10范圍內生長速率呈上升趨勢，pH 5～9之間各處理菌絲生長速率差異不顯著，pH達到11時其生長速率減慢，由此可知P.omnivirens既能適應酸性環境，也能適應堿性環境，最適生長pH為10。

2.1.4 光照對菌絲生長的影響

由圖4可以看出，P.omnivirens菌絲在3種光照條件（連續光照、24 h光暗交替和連續黑暗）下生長速率差異不顯著，說明光照條件的變化對P.omnivirens菌絲的生長速率影響不顯著，但菌絲顏色會隨著黑暗時間的增長而加深。

2.1.5 菌絲的致死溫度

P.omnivirens在各預設溫度條件下水浴10 min后，小于等于55 ℃時菌絲均可生長，大于等于60 ℃時菌絲不生長，說明菌絲的致死區間為55～60 ℃;再此區間內進一步的試驗結果顯示，58 ℃及以上溫度水浴10 min后菌絲均不生長，說明菌絲的致死溫度為58 ℃ 10min。

2.1.6 不同碳、氮源對菌絲生長的影響

研究結果表明，7種碳源對菌絲生長速率的影響存在差異（圖5），以蔗糖為碳源的查氏培養基菌絲生長最快，肌醇為碳源時，菌絲生長最慢，因此，蔗糖為最佳碳源。由圖6可知，P.omnivirens在9種氮源的查氏培養基中生長速率差異顯著，以硝酸鉀和硝酸鈣為氮源的培養基菌絲生長最快，其次是L-精氨酸和硝酸鈉，以硫酸銨為氮源的培養基菌絲生長最慢，因此硝酸鉀和硝酸鈣為最佳氮源。

2.2 室內毒力測定

研究結果表明（表1），12種殺菌劑在對應的濃度梯度范圍內均對煙草莖點病菌有較好的抑菌作用，且抑制率與供試藥劑濃度呈正相關。80%代森錳鋅WP和50%福美雙WP在使用濃度分別為16 mg/L和500 mg/L時抑制率均大于90%。3%中生菌素WP、0.3%梧寧霉素AS和20%苯醚甲環唑EW隨濃度的增加抑制率均達85.97%～89.03%，其余藥劑隨濃度的增加抑制率也在63.5%～79.5%之間。

12種殺菌劑中，3%中生菌素WP的EC50最小，為0.9419 mg/L;其次是0.3%梧寧霉素AS和80%代森錳鋅WP，EC50值分別為2.6940 mg/L和2.7917 mg/L。40%丙環唑ME和20%苯醚甲環唑EW的EC50值也小于20 mg/L。抑制中濃度EC50是殺菌劑毒力的可靠標準，EC50越小，說明其抑菌效果越好[17]。因此，在12種殺菌劑中，3%中生菌素WP對煙草病菌的抑制效果最好，0.3%梧寧霉素AS和80%代森錳鋅WP次之。

3 結論與討論

病原菌的生物學特性是監控病害發生的前提條件[18-19]，但目前未見P.omnivirens的生物學特性研究的相關報道。本研究結果表明，煙草莖點病菌P.omnivirens對不同培養基、溫度、pH、碳氮源具有不同程度的適應性，對不同光照條件的選擇無顯著差異;最適培養基為牛肉膏蛋白胨培養基、燕麥培養基和馬鈴薯培養基，3種培養基中，以馬鈴薯培養基配制最為簡單、廉價，且在微生物相關研究中使用頻率高，因此本文其他部分的研究均使用該培養基作為供試培養基;最適生長溫度為30 ℃，35 ℃及以上時，菌絲停止生長，這與李海洋等[20]對同屬P.dictamnicol生物學特性的研究結果一致，說明該菌在高溫條件下不易存活，這或許是煙草莖點病目前尚未大面積發生的原因之一;菌絲在pH為4～11之間均可生長，pH為10時菌絲生長速率最大;最佳碳源為蔗糖，最佳氮源為硝酸鉀和硝酸鈣，菌絲致死溫度為58 ℃ 10 min;不同光照條件下菌絲的生長速率無顯著差異。

Phoma是一個廣泛分布的屬，在該屬已報道的3000種中有110種為病原菌，常引起植物葉片枯萎、根部腐爛甚至整株植株萎蔫[21]。本研究對煙草莖點病菌P.omnivirens的生物學特性的研究結果不僅有助于了解煙草莖點病的發生和病害循環，為防治該病害奠定基礎，也可為P.omnivirens引起的其他病害及同屬病原菌的相關研究提供參考。

目前，生產上的農作物病蟲害防治主要還是依靠化學農藥，但隨著人們對環境和食品安全要求的提高，生物農藥也逐漸得到關注。本文采用菌絲生長速率法測定 12 種殺菌劑（7種化學殺菌劑和5種生物農藥）對煙草莖點病菌P.omnivirens的室內毒力，結果顯示生物農藥3%中生菌素WP和0.3%梧寧霉素AS對菌絲的抑制效果最好，EC50分別為0.9419 mg/L和2.6940 mg/L，生產上也將這兩種生物農藥用于防治其他病害[22-23]，可將其作為田間防治煙草莖點病的選用藥劑。同時，化學殺菌劑50%代森錳鋅WP也對煙草莖點病菌表現出較好的抑制效果，其EC50為2.7917 mg/L，也可作為生產上防治煙草莖點病的備選藥劑。但該研究選用的殺菌劑僅在室內進行試驗，具有一定的局限性。田間防治效果還與病原菌的孢子[24]、殺菌劑的特性[25]以及寄主植物的生長環境等[26]有關，后續還需進一步的田間防治試驗進行驗證。另外，針對不同地區的煙草莖點病，其病原菌菌株不同，生物學特性和防治藥劑是否一樣還需進一步探究。

參 考 文 獻：

[1] 陳重明，陳迎暉.煙草的歷史[J].中國野生植物資源，2001，20（5）：30-33.

[2] 任民，王志德，牟建民，等.我國煙草種質資源的種類與分布概況[J].中國煙草科學，2009，30（S）：8-14.

[3] 朱賢朝，王彥亭，王智發.中國煙草病害[M].北京：中國農業出版社，2002：3-4.

[4] NYVALL R F.Field crop disease handbook[M].New York：van nostrand reinhold，1989：661-707.

[5] 蔣士君，吳元華.煙草病理學[M].北京：中國農業出版社，2013（2）：175-176.

[6] 于莉，華致甫，李玉.煙草上的一種新病害—煙草莖點病[J].吉林農業大學學報，1993（1）：97-107.

[7] 陳瑞泰，朱賢朝，王智發，等.全國16個主產煙?。▍^）煙草侵染性病害調研報告[J].中國煙草科學，1997，18（4）：1-7.

[8] 高崇，高玉亮，吳國賀，等.吉林省煙草有害生物種類及分布況調查[J].黑龍江農業科學，2016（11）：77-81.

[9] 田佳，安德榮，雷超，等.陜西煙田病害種類調查[J].中國煙草科學，2016（5）：57-62.

[10] 苗圃.河南省煙草真菌性根莖病害鑒定及黑脛病菌生理小種鑒定[D].洛陽：河南科技大學，2013.

[11] 江艷，桑維鈞，曾爾玲，等.煙草莖點病在貴州省的發生及病原鑒定[J].江蘇農業科學，2018，46（10）：92-95.

[12] 方中達.植病研究方法[M].北京：中國農業出版社，1998（3）：46-50.

[13] 慕立義.植物化學保護研究方法[M].北京：中國農業出版社，1994：76-81.

[14] 高亞星，彭麗娟，蔣選利.8 種藥劑對煙草黑脛病菌室內毒力測定[J].山地農業生物學報，2016，35（6）：31-34，39.

[15] 孫廣宇，宗兆鋒.植物病理學實驗技術[M].北京：中國農業出版社，2002：94-106，139-146.

[16] 司升云，蔡定軍，吳仁峰，等.農藥室內生物測定數據處理系統[CP/DK].武漢市蔬菜科學研究所，2006.

[17] 李海薇，侯仙，王夢瑤，等.海島棉枯萎病病原菌分離及室內藥劑篩選[J].中國農學通報，2019，35（9）：68-74.

[18] 余賢美，侯長明，王潔，等.柿樹炭疽病菌的生物學特性及其抑菌藥劑篩選[J].中國南方果樹，2018，47（2）：114-119.

[19] 鄭肖蘭，賀春萍，高亞男，等.咖啡炭疽病菌生物學特性及其毒力測定[J].熱帶農業科學，2015，35（12）：94-98.

[20] 李海洋，魏春艷，劉麗玲，等.白蘚莖點霉葉斑病菌的生物學特性及藥劑敏感性[J].吉林農業大學學報，2017，39（3）：281-286.

[21] DEBASISH D，AHAMED K，NRISINGHA D.Phoma diseases：Epidemiology and control[J].Plant Pathology，2020，69（7）：1203-1217.

[22] 周開拓，蔣承耿，王秋萍，等.中生菌素對貴州煙區煙草青枯病的毒力測定及田間防效試驗[J].農業科技與裝備，2017（11）：14-16.

[23] 楊霞，吳躍開，付莉，等.不同生物農藥和化學農藥對核桃枝枯病的防治試驗[J].農藥，2017，56（8）：609-612.

[24] 宋慧云，段志豪，張偉豪，等.宮粉羊蹄甲炭疽病病原鑒定及其藥劑篩選[J].南方農業學報，2018，49（10）：1975-1981.

[25] 單體江，宋慧云，段志豪，等.短萼儀花炭疽病病原鑒定及其藥劑篩選[J].中國植保導刊，2019，39（2）：5-11.

[26] 楊友聯，劉永翔，劉作易.水果采后炭疽病病原鑒定[J].西南農業學報，2014，27（3）：1114-1123.