香蕉MaWRKY1轉錄因子在果實和幼苗誘導抗冷性中表達分析

洪克前 谷會 陳麗

摘 ?要：為了探究香蕉MaWRKY1轉錄因子在抗冷誘導過程中的作用，采用外源過氧化氫（H2O2）、茉莉酸甲酯（MeJA）、水楊酸（SA）和丙烯（propylene）等處理香蕉果實，同時采用外源H2O2、MeJA和脫落酸（ABA）等處理香蕉幼苗，處理結束后，將實驗材料放置于7?℃下貯藏，通過Northern blot技術分析實驗材料中MaWRKY1基因表達變化。H2O2、MeJA、SA和propylene等處理均使果實冷害癥狀推遲2?d出現;處理組果實中MaWRKY1 mRNA積累均早且高于對照組。H2O2、MeJA和ABA等處理也均使幼苗推遲18?h顯現冷害癥狀;處理組幼苗中MaWRKY1基因表達提前且表達量相對較高。相比較這幾種外源性調節劑，MeJA和H2O2處理的香蕉果實和幼苗所獲得的抗冷效果優于其他生長調節劑，同時MaWRKY1基因表達水平也比其他處理組提前或表達量更高，推測MaWRKY1可能更加積極響應MeJA或H2O2誘導香蕉耐冷性

關鍵詞：香蕉;WRKY1;轉錄因子;耐冷性

Abstract： To investigate the role of MaWRKY1 in induction of chilling resistance of the banana， fruits were treated with H2O2， MeJA， SA and propylene， respectively， and seedlings were treated with H2O2， MeJA and ABA， respectively. Following treatments， fruits and seedlings were stored at 7?℃. Northern blot technique was adopted to analyze the changes of MaWRKY1 in fruits and seedlings inducted by chilling resistance. The results indicated that H2O2， MeJA， SA， and propylene treatments delayed the occurrence of chilling injury symptom of fruits by 2 d at 7?℃. MaWRKY1 mRNA accumulation in the treated fruits was earlier and higher than that of the untreated. The treatment of H2O2， MeJA， and ABA retarded the occurrence of chilling injury symptom of seedlings by 18 h at 7?℃. In addition， MaWRKY1 mRNA accumulation level was significantly earlier and higher in the treated seedlings than that of the untreated. Compared with other exogenous growth regulators， fruits and seedlings treated with MeJA， and H2O2， respectively had a better chilling resistance， and the MaWRKY1 gene expression was earlier or higher than that in other treated groups， MaWRKY1 might be more active in chilling resistance of banana fruits and seedlings inducted by MeJA or H2O2.

Keywords： banana; WRKY1; transcription factor; chilling resistance

香蕉（Musa acuminate）是世界主要水果之一，經濟價值很高，也是我國華南地區北運和出口的主要水果[1-2]。香蕉是典型的呼吸躍變型果實，常溫下貯藏一周左右即出現呼吸高峰，導致果實迅速成熟軟化并縮短其貯藏期和貨架期。低溫貯藏可有效地抑制香蕉果實的成熟軟化，延長其貯藏壽命，但香蕉果實對低溫極其敏感，在溫度低于11?℃時，即發生冷害，嚴重影響果實的商品價值[3]。施用植物生長調節劑如水楊酸（SA）、茉莉酸甲酯（MeJA）、丙烯（propylene，乙烯功能類似物）、脫落酸（ABA）和過氧化氫（H2O2）等均可提高采后香蕉果實的抗冷性[4-7]，其中許多基因包括MYC、bHLH、PAL、EPX和WRKY等參與了香蕉果實耐冷過程[6-9]。

抗冷反應的轉錄因子中，WRKY是植物特有的一類轉錄因子家族。自WRKY轉錄因子最早在甜薯中發現以來[10]，目前許多WRKY轉錄因子家族成員從多種植物中被分離出來，如擬南芥和水稻中分別有72和109個成員被鑒定出來[11-12]。WRKY轉錄因子在生物脅迫中扮演著重要角色，同時在非生物耐受性包括抗冷性方面起著重要作用[13-15]。如大豆GmWRKY21和大麥TaWRKY10轉錄因子分別在擬南芥中超表達，提高了擬南芥植株的耐冷性[15-16]，而擬南芥AtWRKY34在抗冷過程中呈現負調控作用[17]。目前，模式植物如擬南芥和水稻中有許多脅迫反應相關WRKY被鑒定和研究，而非模式植物，如蔬菜和果實中有關WRKY功能方面也有相關研究[18-20]。筆者前期研究結果表明，香蕉MaWRKY1轉錄因子參與了果實抗病性[21]，而其在果實耐冷性中作用尚未見報道。基于此，本實驗通過Northern blot技術，研究誘導香蕉果實耐冷害響應中MaWRKY1基因表達變化，以期進一步了解該基因的生理功能。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

供試香蕉品種為‘巴西（Musa acuminate， AAA group‘Brazil），果實和幼苗分別購自廣東省番禺香蕉果園和廣東省果樹研究所香蕉組培中心。

1.2 ?方法

1.2.1 ?材料處理 ?（1）香蕉果實抗冷性處理：采收成熟度七至八成的香蕉果實，落梳后立即運回實驗室。每梳香蕉分成單個蕉指后，挑選果實大小相近、無病蟲害、無機械損傷的果實300個，用0.05%（W/V）施保功進行表面殺菌，沖洗干凈后晾干備用，然后室溫下晾30?min后裝入不封口的聚乙烯塑料袋（厚度為0.04?mm）中，每袋6個，10袋一組，共5組。第1組為對照組，果實用聚乙烯塑料袋包裝置于7?℃恒溫箱中貯藏。第2組至第5組為處理組，第2組、第3組和第4組處理參考Chen等[3]的方法進行，分別采用1.0?mmol/L過氧化氫（H2O2）、0.1?mmol/L茉莉酸甲酯（MeJA）和1.0?mmol/L水楊酸（SA）在0.1 MPa負壓下，浸泡果實30?min。第5組處理參考Wang等[5]的方法進行，采用1000?μL/L丙烯（propylene）處理約12?h，取出后開蓋暴露于空氣中2?h，釋放殘留的丙烯，然后用聚乙烯薄膜袋包裝放入7?℃恒溫箱。處理結束后，果實置室溫下晾干，然后分別用聚乙烯薄膜袋包裝放入7?℃恒溫箱中貯藏。上述對照和處理材料分別在貯藏0、1、3、5、7、9、11、13?d時取樣。取樣時將香蕉的果皮與果肉分離后分別用液氮速凍并儲存于?80?℃備用。

（2）香蕉幼苗抗冷性處理：選擇香蕉幼苗高度約30～35?cm，帶有6～7葉和1心，且心葉尚未展開，生長良好的植株。上述所選香蕉幼苗共200株，分成4組，每組50株。第1組為對照組，采用蒸餾水對幼苗進行葉面噴施;第2組分別采用1.0?mmol/L H2O2﹑0.1?mmol/L MeJA和0.1?mmol/L ABA對香蕉幼苗進行葉面噴施。上述2組處理完后，常溫下晾干，然后放置在7?℃恒溫箱中。分別在貯藏0、2﹑6﹑12﹑18﹑24﹑36﹑48、60?h時取樣，取樣時選取香蕉幼苗心葉下的第1葉，用液氮速凍并儲存于?80?℃備用。

1.2.2 ?冷害指數測定 ?香蕉果實冷害指數測定參照Jiang等[22]的方法，按照香蕉果實遭受冷害嚴重程度分為5級。0級為果皮全為綠色或成熟時為黃色;2級為果皮稍顯灰色;3級為出現輕微的褐色凹陷小斑點（面積<0.3?cm2）;4級為出現中度褐色凹陷斑點（面積0.3～0.8?cm2）;5級為出現嚴重褐色凹陷斑點（面積>0.8?cm2）。統計9個蕉指，冷害指數=Σ（冷害級別×該級別果數所占比例）。

香蕉幼苗冷害指數測定參照韓冬芳[23]的方法，按照香蕉幼苗遭受冷害嚴重程度分為5級進行測定。0級為葉色正常，葉片無冷害癥狀;1級為冷害輕度，葉片冷害部分僅限于葉緣，冷害面積小于整個葉面積的5%;2級為冷害中度，葉片冷害部分較少，冷害面積小于整個葉面積的40%;3級為冷害嚴重，葉片冷害部分較多，冷害面積小于整個葉面積的70%;4級為冷害極嚴重，冷害面積大于整個葉面積的70%，或整片枯死。統計9盆香蕉苗，冷害指數=Σ（冷害級別×該級別果數所占比例）。

1.2.3 ?總RNA提取 ?香蕉果皮（肉）及幼苗組織中總RNA的提取方法為熱硼酸法，參照Wan等[24]的方法進行。

1.2.4 ?RNA印跡 ?取香蕉果皮（肉）及幼苗組織總RNA約10?g，在瓊脂糖凝膠（含1.2%甲醛）上進行變性凝膠電泳。電泳后的凝膠放置2×SSC的溶液中浸洗2次，每次20?min。浸洗結束后，采用上行毛細管轉移法將變性RNA從凝膠轉移到尼龍膜（Biodyne?B 0.45?m，PALL）上，轉移完成后，將尼龍膜置于恒溫箱中80?℃烘烤約2?h，最后將含有RNA尼龍膜經紫外交聯后存放于4?℃冰箱備用。

1.2.5 ?Northern blot ?Northern blot參考賀立紅等[25]的方法進行，具體步驟如下：將結合有RNA的尼龍膜置于預雜交液中預雜交3?h。預雜交結束后，在雜交液中加入DIG標記的探針，于45?℃雜交箱中雜交過夜。雜交后的尼龍膜用含有0.1% SDS的2SSC漂洗2次，每次10?min。然后再用同樣濃度的SSC在62?℃下洗2次，每次30?min，漂洗結束后用Tween-20洗去膜上未結合的抗體，最后通過化學發光原理檢測雜交信號的強弱。

2 ?結果與分析

2.1 ?香蕉果實誘導抗冷性中冷害指數變化

如圖1所示，對照果實在7?℃下貯藏第3天開始出現冷害癥狀，果皮開始變灰色或出現凹陷小斑點，冷害指數隨貯藏時間增加顯著上升，貯藏至第11天時達最大值即5級。H2O2、MeJA、SA和propylene等處理延緩冷害癥狀出現且推遲冷害指數上升，處理組果實均貯藏至第5天開始出現冷害癥狀，冷害指數上升較緩慢。H2O2、MeJA、SA和propylene等處理果實，貯藏至第11天時，冷害指數分別約是對照果實的60%、58%、68%和66%;經過這些外源性生長性調節劑處理，提高了果實抗冷性，延緩了冷害癥狀的發生，綜合整個貯藏期冷害指數的變化，MeJA處理組比其他處理組抗冷效果更好。

2.2 ?果皮中MaWRKY1基因表達分析

外源H2O2、MeJA、SA和propylene處理香蕉果實后置于7?℃低溫貯藏，以Northern blot檢測果實中MaWRKY1基因表達。結果表明，對照組果皮第3天即有MaWRKY1基因表達，至第5天表達量最高，之后逐漸下降;H2O2、MeJA、SA和propylene等處理組果皮中，MaWRKY1第1天均被誘導表達，MeJA處理組基因表達明顯高于其他處理組;處理組MaWRKY1表達量峰值均在第3天，隨后呈下降模式，但在第11天和第13天，MeJA處理基因表達依然高于其他處理組（圖2）。綜合以上結果，與對照和其他處理組相比，MeJA處理組更能快速、持久地誘導MaWRKY1基因的表達。

2.3 ?果肉中MaWRKY1基因表達分析

如圖3所示，對照組果肉中MaWRKY1基因第5天開始表達，表達趨勢較為平穩。盡管H2O2處理組與對照組相比，MaWRKY1初始表達時間基本一致，但其基因表達量明顯高于對照組。MeJA、SA和propylene等處理組果肉中，MaWRKY1基因表達分別出現在第3天、第3天和第1天，明顯早于對照組MaWRKY1基因表達;并且，處理組中基因表達量顯著高于對照組。

2.4 ?香蕉幼苗誘導抗冷性中冷害指數變化

由圖4可知，對照組幼苗在7?℃低溫貯藏18?h時出現冷害癥狀，H2O2、MeJA和ABA等處理組低溫貯藏36?h時顯現輕微冷害癥狀，冷害指數均約為0.2，而對照組冷害指數則接近0.6，差異顯著。低溫貯藏至60?h，對照組幼苗已死亡（冷害指數達1.0級），H2O2、MeJA和ABA等處理組冷害指數僅為0.4～0.6。經H2O2、MeJA和ABA等處理，延緩了香蕉幼苗冷害癥狀的出現，減輕了冷害程度的發生，相比較而言，H2O2和MeJA處理組幼苗具有較低的冷害指數，暗示這2個處理組抗冷效果較好。

2.5 ?香蕉幼苗組織中MaWRKY1基因表達分析

Northern-blot檢測結果表明，對照葉片中MaWRKY1在7?℃低溫貯藏12?h有微弱表達，之后表達量基本恒定，低溫貯藏48?h表達量達到峰值，隨后其表達量下降。外源H2O2、MeJA和ABA處理組葉片中MaWRKY1在低溫貯藏2?h均有表達，低溫貯藏18、24、24?h，其表達量開始逐漸升高，低溫貯藏48?h表達量均達到峰值（圖5）;與對照相比，H2O2等處理組MaWRKY1基因表達提前，且表達量顯著增加。說明在外源H2O2、MeJA和ABA處理提高香蕉葉片抗冷性過程中，誘導了MaWRKY1表達。

3 ?討論

采后香蕉果實對低溫敏感，容易遭受冷害，嚴重制約果實的貯藏、運輸和銷售等。植物生長調節劑包括過氧化氫（H2O2）、茉莉酸甲酯（MeJA）、水楊酸（SA）、和丙烯（propylene，乙烯類似物）等在香蕉果實抗冷性方面發揮重要作用[4-5]。本實驗中未經處理的對照組果實放置在7?℃下貯藏，第3天出現冷害癥狀，經H2O2、MeJA、SA和丙烯等處理的果實均比對照組推遲2?d出現冷害癥狀。龐學群等[4]報道，采用外源H2O2、SA和MeJA等處理香蕉果實放置7?℃下貯藏，對照果實也是貯藏第3天出現冷害癥狀，但處理組比對照果實延緩2～5?d出現冷害癥狀。Wang等[5]報道丙烯處理香蕉果實放置7?℃下貯藏，對照果實第4天出現冷害癥狀，處理比對照果實延緩3?d出現冷害癥狀。本研究采用H2O2、MeJA、SA和丙烯等處理香蕉果實，誘導果實抗冷性效果與龐學群等[4]和Wang等[5]報道的并非完全一致。筆者分析認為，可能香蕉果實成熟度、產地、采收季節和采前管理措施等因素不同，導致不同研究者所得結果稍有不同。但本研究與龐學群等[4]和Wang等[5]所得結果也有相同點，即H2O2、SA、丙烯和MeJA等處理香蕉果實均延緩了冷害癥狀的出現，提高了果實的抗冷性。

為了應對低溫，植物進化出復雜的生理和生物化學機制以適應低溫脅迫，在分子水平上誘導脅迫響應基因包括低溫調節基因和低溫功能基因的表達[26]。轉錄因子作為一種重要的調節基因，在響應脅迫信號和調節功能基因的表達方面發揮重要作用[27]。誘導基因轉錄是植物對低溫脅迫的反應，目前已從香蕉果實鑒定出多個響應低溫誘導WRKY轉錄因子，其中包括MaWRKY11[2]、MaWRKY26[28]和MaWRKY31、MaWRKY33、MaWRKY60、MaWRKY71[7]。本研究中，7?℃下貯藏，幼嫩的香蕉葉片中MaWRKY1轉錄因子mRNA積累在貯藏12?h便顯現出來，果皮中MaWRKY1 mRNA積累在第3天開始顯現，果肉中mRNA積累稍慢，在貯藏5?d時開始出現。表明MaWRKY1響應了低溫脅迫，但不同組織對低溫響應所需時間不同，呈誘導型表達;同時該研究拓展了MaWRKY家族響應低溫的新成員。

WRKY轉錄因子在植物應答逆境脅迫中發揮重要作用，很多WRKY轉錄因子能被逆境信號誘導表達，參與多種信號途徑的傳導，其中包括JA、SA、ABA和ET等信號通路[29]。因此，WRKY轉錄因子受多種植物生長調節劑調控，包括MeJA、SA、乙烯和ABA[6]。逆境脅迫所激活激素信號途徑，相關基因表達水平進而發生變化。例如，擬南芥AtWRKY70轉錄因子參與抗病中可以分別被外源SA和JA誘導和抑制[30]，煙草NtWRKY4在抗煙草花葉病毒中被SA誘導表達[31]。MeJA作為JA的甲酯衍生物，參與植物信號轉導途徑，調節低溫脅迫防御反應，從而提高植物對低溫的耐受性[32]。施用外源MeJA能提高多種果蔬的耐冷性和減輕冷害的發生率[28， 33]。

本研究中，H2O2、MeJA和SA等誘導香蕉果實耐冷性過程中，MaWRKY1轉錄因子呈現類似的表達模式，這些信號分子均使MaWRKY1表達提前且表達量顯著上調，果皮和果肉中MaWRKY1基因表達峰值均在第3天和第7天出現;但香蕉幼苗中MaWRKY1響應H2O2和MeJA誘導模式不同，前者中MaWRKY1表達時間更早且表達量（貯藏36?h前）明顯高于后者。MaWRKY1響應ET誘導香蕉果實耐冷性過程中，盡管貯藏第5天處理組果皮中MaWRKY1基因表達稍微低于對照，但其他時間點前者基因表達量明顯高于后者，推測MaWRKY1作為轉錄因子，主要在貯藏前期（第3天前）通過高量表達，調節抗冷相關基因，進而提高香蕉耐冷性。

ABA作為一種重要的植物生長調節劑，調控WRKY轉錄因子參與的抗逆反應。如小麥中的TaWRKY1和TaWRKY33轉錄因子參與了ABA誘導的耐旱性[34];香蕉MaWRKY31、MaWRKY33、MaWRKY60和MaWRKY71等轉錄因子在ABA調控果實抗冷性中具有重要作用[7]。本研究中，ABA處理減輕香蕉幼苗冷害發生的同時，誘導了MaWRKY1基因表達量增加，可能MaWRKY1參與了ABA誘導的幼苗耐冷性。

綜上所述，外源H2O2、MeJA、SA、ABA和propylene等誘導了香蕉耐冷性，這些外源生長調節劑可能通過不同的信號途徑，如SA、ABA和JA/ET等激活了MaWRKY1 mRNA的積累，MaWRKY1進一步調節下游的功能基因的表達，進而提高了香蕉耐冷性;綜合分析H2O2等處理對香蕉冷害指數和MaWRKY1 mRNA積累時間和量的變化模式，認為適宜濃度的外源MeJA和H2O2處理的香蕉果實和幼苗所獲得的抗冷效果優于其他植物生長調節劑。但MaWRKY1如何響應低溫脅迫，通過何種信號途徑通路調節相應的功能基因還需要深入探討。

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責任編輯：黃東杰