多肉植物紅司（Echeveria nodulosa）花粉離體萌發和花粉管生長特性研究

楊瀾 張朝君 杜致輝 陳之林

摘 ?要：以10%蔗糖+0.5%瓊脂為基礎培養基，采用花粉離體萌發法研究硼酸濃度、培養溫度和培養時間對多肉植物紅司（Echeveria nodulosa）花粉萌發和花粉管生長的影響。結果表明：硼酸濃度、培養溫度、培養時間三因素以及相互間的交互效應對花粉萌發率的影響差異極顯著;硼酸濃度、培養溫度以及二者間的交互效應對花粉管伸長的影響顯著，而培養時間對花粉管伸長的影響不顯著。12～28?℃有利于提高花粉管萌發率，20～36?℃有利于花粉管的伸長。三因素交互效應顯示：60?mg/L硼酸+12?℃+16?h為紅司花粉萌發最佳條件，萌發率為52.43%。30 mg/L硼酸+36?℃+16?h為花粉管生長適宜條件，花粉管平均長度達527.74 μm。

關鍵詞：多肉植物;紅司;培養溫度;花粉管生長

Abstract： Using the in vitro pollen germination method to study the effects of boric acid concentration， temperature and time on the pollen germination and pollen tube growth of succulent plant Echeveria nodulosa， 10% sucrose+0.5% agar was the basic medium. The effects of boric acid， culture temperature， culture time and interaction effects of the three factors on the pollen germination rate had significant differences. The effects of boric acid， culture temperature and interaction effects between them on the pollen tube elongation were significantly different. Culture temperature had no significant effect on pollen tube growth. 12?28?℃ was good for improving the germination rate of pollen tube， and 20?36?℃ was better for the elongation of pollen tube. The three-factor interaction effects showed that 60?mg/L boric acid+12?℃+16 h was the best condition for the pollen germination of E. nodulosa， with a germination rate of 52.43%. 30?mg/L boric acid+36?℃+16 h was the suitable condition for the pollen tube growth.

Keywords： succulents; Echeveria nodulosa; culture temperature; pollen tube growth

多肉植物紅司（Echeveria nodulosa）屬于景天科（Crassulaceae）擬石蓮屬（Echeveria）原生種，原產于墨西哥，葉片上分布著奇特的紅色紋路，花粉量豐富，花期5—7月。紅司能較好適應高低溫環境，且觀賞性較好，引進國內后進行大量的商品化生產。在育種方面，紅司也是一種重要的育種父本材料，曾育出園藝品種E. shaviana× E. nodulosa和E.setosa var. ciliata×E. nodulosa。擬石蓮屬是景天科中最具有代表性的一個屬，其種類比例占到景天科原種的97%，而分布在墨西哥的擬石蓮屬多肉植物擁有豐富的多樣性，85%的物種生長在墨西哥[1-2]。此外，擬石蓮屬多肉植物的形態特征具有較高的吸引力，被世界園藝家和收藏家認為是觀賞價值很高的園藝植物。

González-Mancera等[1]通過電鏡掃描擬石蓮屬花粉，發現大多數品種花粉表現出相似的特征，大小為27～42?m，外形為球狀或橢圓形，表面具有網狀或條形紋飾，但有一些表現出不同的特征，如花粉表面具有孔溝或多個萌發孔。Jimeno-Sevilla等[3]研究發現擬石蓮屬植物E.?rosea具有一種特殊的蜂鳥授粉系統，在自然條件下可以獲得較高的結果率。但實際上擬石蓮屬的多肉植物被園藝家引種栽培在室內，缺少有效的傳粉者，自花授粉結實率普遍較低，只能采取人工輔助授粉方式對其進行遺傳改良，形成具有較高觀賞價值的園藝新品種。人工授粉的方式可有效提高育種成功率，Parra-Tabla等[4]研究發現人工授粉E. gibbiflora產生的種子比自然授粉多1.74倍。花粉活力是影響人工授粉成功的關鍵因素之一，而植物的遺傳起源是影響花粉活力的重要因素，突變體或種間雜交高度不育[2]。低活力的花粉會影響雜交中可存活種子的數量，只有高活力的花粉在柱頭上才有較高的萌發率，能快速伸長到達子房成功完成受精，是人工輔助授粉及雜交授粉的重要保障，因此，研究花粉的活力對育性和結實率具有重要意義[5-6]。在研究花粉活力的過程中，離體萌發法被認為是檢測花粉活力快速、可靠且穩定的方法，檢測結果與在柱頭上的花粉活力相似[7]。本研究為了摸清多肉植物紅司花粉活力及花粉管生長特性，以便育種上能更加高效地運用紅司培育新品種，采用離體萌發法研究硼酸濃度、培養溫度、培養時間三因素及其相互間的交互效應對于紅司花粉萌發率及花粉管生長的影響，以期篩選出花粉萌發及花粉管生長的最佳培養條件，揭示紅司花粉育性，從而提高育種效果和加速育種過程，并為多肉植物育種方提供依據。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

供試材料紅司為2015年引種種植于貴州省農業科學院園藝研究所多肉種質資源保育棚。取樣植株的種植年限為4年，選取發育正常、長勢健壯、無病蟲害且生長情況接近的紅司5株，并分別編號為1～5號，插上標簽。取材時間為2019年7月，晴天早上9：00—10：00之間，分別采集1～5號紅司植株花朵，每株植株采集5朵，采集的花粉均為花朵剛開放且柱頭出現粘液時期的花粉。

1.2 ?方法

1.2.1 ?花粉離體培養 ?用鑷子將花粉輕輕剝落至滴有蒸餾水的離心管中混勻制成懸浮液。以0.5%瓊脂（Agar）+10%蔗糖（Sucrose）為基礎培養基，添加不同濃度的硼酸，制成的培養基倒入玻璃培養皿中冷卻凝固。分別取100??L的花粉懸浮液滴入固體培養基中，置于恒溫培養箱內進行不同處理的暗培養。將培養基置于顯微鏡進行觀察，統計花粉萌發率和測量花粉管長度?？瞻讓φ誄K為0.5%瓊脂（Agar）+10%蔗糖（Sucrose）為基礎培養基，滴入花粉懸浮液后不培養直接觀察。

1.2.2 ?硼酸濃度設置 ?變量因素A為硼酸。分別添加A1（0 mg/L）、A2（30 mg/L）、A3（60 mg/L）、A4（100 mg/L）4種濃度水平的硼酸。

1.2.3 ?培養溫度設置 ?變量因素B為培養溫度，設定為5種水平，設計覆蓋了低中高3個溫區，分別是B1（12?℃）、B2（20?℃）、B3（28?℃）、B4（36?℃）、B5（44?℃）。

1.2.4 ?培養時間設置 ?變量因素C為培養時間，設定為4種水平，分別是C1（1?h）、C2（3?h）、C3（16?h）、C4（24 h）。

1.2.5 ?離體萌發率統計和花粉管長度的測量 ?試驗設計為三因素多水平處理，4×5×4共80個組合。在顯微鏡下隨機觀察，以花粉管長度大于花粉直徑為花粉萌發標準[8]。每個組合重復3次，每次的觀察視野為3個。每個組合觀察視野的花粉粒總數為350～780粒，統計花粉萌發率（花粉萌發率=萌發的花粉數/花粉?？倲怠?00%，結果取平均值）。同時，用顯微鏡微尺測量花粉管長度，每個組合觀察視野的花粉管數量為30～80個，計算其平均值。

1.3 ?數據處理

利用Excel軟件進行數據整理，用SAS 9.0軟件對組合進行差異顯著性、多元相關性及聚類分析。

2 ?結果與分析

2.1 ?三因素對紅司花粉萌發率的影響

如表1所示，硼酸濃度、培養溫度、培養時間對紅司花粉萌發率均有極顯著影響?？瞻讓φ誄K的花粉萌發率僅為3.71%。從表2可見，60?mg/L硼酸濃度下花粉萌發率最高，為15.87%。12?℃低溫條件下花粉萌發率最高，為21.86%;花粉萌發率隨著培養溫度的升高而降低，44?℃高溫下會抑制花粉萌發。培養16?h，花粉萌發率達到最大值18.70%，顯著高于其他3個時間點;培養時間增加至24 h時，觀察視野中許多花粉管出現破裂，扭曲交纏，不利于統計萌發數量，導致萌發率在數據上出現下降。

從表3可見：60?mg/L硼酸+12?℃培養3 h、16 h，花粉萌發率達到48.59%、52.43%;兩因素的組合中，60 mg/L硼酸+12?℃（A3B1）的培養條件下，萌發率為38.43%，顯著高于其他水平組合;硼酸濃度與時間的最佳組合為60?mg/L硼酸+16?h（A3C3），萌發率為20.67%;培養溫度與時間的最佳組合為培養12?℃+16?h（B1C3），萌發率為31.43%。硼酸酸濃度、培養溫度、培養時間三因素組合條件下花粉的萌發率大于雙因素組合。

2.2 ?三因素對紅司花粉管生長的影響

硼酸濃度和培養溫度及二者間的交互效應對花粉管生長存在極顯著影響（表4）?？瞻讓φ誄K的紅司花粉管平均長度僅為44.40?μm。培養基中加入不同濃度的硼酸可促進花粉管生長，30?mg/L硼酸濃度為最佳處理水平，花粉管平均長度達到223.22?μm（表5、圖1）。低溫對花粉管的伸長有抑制作用，12?℃低溫培養下花粉管生長過慢，平均長度值僅為100.2?μm，20～36?℃為紅司花粉管生長適宜溫度區間（表5、圖2）;培養時間對花粉管生長的影響并不顯著（表4），培養時間3～16?h為花粉管快速生長階段，培養16?h時花粉管平均長度達到194.33 μm（表5）。

低濃度硼酸在高溫培養條件下對花粉管伸長有促進作用。30 mg/L硼酸在36?℃條件下分別培養3、16、24?h，花粉管平均長度分別達到了453.16、527.74、571.52?μm（表6），但培養24 h后400?μm以內花粉管數量明顯減少（表7），不利于授粉成功率提高，因此，花粉管生長最佳處理水平為A2B4C3。

2.3 ?三因素的交互效應對花粉管生長影響的聚類分析

采用類平均法將OB1～OB80共80個組合聚為3類，閾值為1.3193。如表7所示：第1類中，花粉管長度在400～1100?μm的花粉比例最高，平均數量為35.3個，200～400?μm的花粉平均數量為8.0個，200?μm以內的花粉平均數量為6.3個;第2類中，200?μm以內的花粉比例最高，平均數量為75.1個;其次為200～400?μm，花粉平均數量為11.7個，400～1100?μm的花粉僅為2.6個。第3類中，花粉管長度主要在200?μm，平均數量為30.45個，其次為200～400?μm的花粉，平均數量為5.7個，400～1100?μm的花粉平均數量為2.9個。說明30?mg/L硼酸在36?℃培養3～16?h后，對花粉管的伸長有明顯的促進作用。

2.4 ?三因素與紅司花粉萌發和花粉管生長的相關性

硼酸濃度、培養溫度、培養時間多個變量對花粉萌發和花粉管生長影響的相關性分析發現（表8）：花粉萌發率與培養溫度呈極顯著負相關（P<0.01），相關系數值為?0.6044;花粉萌發率、花粉管生長與硼酸濃度和培養時間均呈正相關關系，但相關性均不顯著。兩組變量的典型相關性分析也得到了相同結果，證實多個變量因素中培養溫度（B）與花粉萌發率（y）極顯著相關，逐步回歸分析獲得二者的最優方程y=31.06-0.58?B（R2=0.3773），方程極顯著（P<0.01）。說明溫度是影響紅司花粉萌發率最主要的因素，隨著溫度的增加，花粉萌發率表現為下降。此外，一定范圍內硼酸濃度值對萌發和花粉管生長是有利的。

3 ?討論

影響花粉離體萌發率的因素除了培養基、溫度、硼酸濃度等因素外，還應該考慮取材的一致性，應盡量減少取材的次數，取回的多個花朵制成花粉混合懸浮液，讓每個處理都能在材料上保持基本一致。另外，較少的處理組合很難反應花粉萌發及花粉管生長的真實狀況，應盡量采用多因素多水平組合處理。0.5%瓊脂（Agar）+10%蔗糖（Sucrose）為基礎培養基，滴入花粉懸浮液后不培養直接觀察，可摸清楚花粉在培養前的萌發狀態。本試驗中，花粉在空白對照處理下花粉有3.71%極少量的萌發，花粉管平均長度僅為44.40?μm。

硼元素對花粉管生長具有調節作用，在構建花粉細胞壁方面發揮作用，同時可能作為一種相關因子影響關鍵酶活性，改變細胞壁多糖網狀結構以至細胞壁的延展性[9]。近年研究表明培養基中添加一定濃度硼酸有利于花粉萌發生長[10-12]。杜紀紅等[13]認為不同植物種類的花粉萌發和花粉管生長所需的最適硼酸濃度不同：如培養黃薇花粉適宜硼酸濃度為500～1000?mg/L[14];150?mg/L硼酸能顯著提高福鼎大白茶花粉萌發率[15];王玉林等[16]發現添加100?mg/L硼酸可使火龍果花粉離體萌發率顯著提高59.75%，而花粉管生長需要500?mg/L高濃度的硼酸;因此有必要對不同的植物開展研究。本研究結果表明，多肉植物紅司花粉萌發適宜的硼酸為60～100?mg/L，而花粉管的伸長僅需要30?mg/L低濃度的硼酸，隨著濃度的增加，花粉管生長受到抑制。

除了硼酸之外，溫度是影響萌發率及花粉管生長的重要因素，本實驗設置的處理溫度范圍為12～44?℃，從低溫區覆蓋至高溫區，數據分析結果顯示不同水平的溫度處理對花粉萌發和花粉管生長影響差異極顯著（P<0.01）。不同植物種類適宜花粉萌發的溫度有差異。地被菊的花粉適宜萌發溫度只有10～15?℃[17]，梅花等早春開花植物花粉萌發最佳溫度20?℃左右[18]，茉莉花粉最佳培養溫度為25～30?℃[19]，即使種內不同品種的花粉適宜萌發溫度也有較大差異，實驗室前期研究發現，擬石蓮屬一些早開花品種如‘花月夜‘靈隱的花粉在15?℃低溫離體培養下花粉活力較高，平均萌發率分別達到66.67%、29.51%。而品種‘莎維娜的花粉在30?℃高溫培養下花粉萌發率達到26.67%。因此有必要針對重要的育種材料開展研究。紅司花粉萌發的適宜溫度范圍較廣，試驗表明12～28?℃溫度下花粉萌發率均較高，其中12?℃低溫條件下花粉萌發效果最佳（21.86%）;12?℃是本試驗設置的低溫，如果溫度更低，萌發率有可能更高，因此可以在實際育種工作中，嘗試更低溫度處理紅司花粉。相關性分析發現溫度與萌發率呈負相關，與花粉管長度呈正相關，說明花粉萌發和花粉管生長可能需要不同的溫度條件。本試驗中，12～28?℃培養有利于提高花粉管萌發率，20～36?℃有利于花粉管的伸長，與蒿柳研究結果類似[20]。這對多肉植物育種可能有很好的指導作用，可以嘗試前期低溫誘導花粉大量萌發后，提高培養溫度促進花粉管伸長。

不同植物種類花粉管生長適宜觀察的培養時間存在差異。海仙花花粉培養6?h花粉管生長最快，狀態最好[21];礬根‘紅妝魅影培養時間達到2?h時，礬根花粉管發生明顯伸長[22];野杏花粉離體培養最佳時間為6?h[23]。本研究為了探明紅司花粉在24 h內萌發及花粉管生長情況，同時基于試驗的可操作性。從早上9點取新鮮花粉處理后，放在不同處理下分別培養1、3、16、24 h，取出觀察拍片。數據分析結果表明：時間是影響紅司花粉萌發率的極顯著因素（P<0.01），對花粉管長度影響則不顯著（P>0.05）。空白對照中紅司花粉有3.71%少量萌發，平均花粉長度為44.40?μm。處理1?h后花粉的平均萌發率升高至10.43%，花粉管長度為130.42?μm。隨著培養時間的延長，3～16?h花粉萌發率迅速提高，花粉管生長加快。培養至16?h，平均萌發率（18.70%）與花粉管長度（194.33 μm）均達到最大值。培養時間的增加有利于花粉萌發率的上升及花粉管的伸長，但時間過長，部分已萌發的花粉出現花粉管破裂，扭曲交纏，不利于數據統計，這也是花粉在培養24?h之后萌發率在數據上出現下降原因之一。綜上所述，紅司花粉離體培養適宜的觀察時間可能在3～16?h之間，需要在實際育種工作中進一步縮小變量范圍，摸索最佳觀察時間。

方差分析顯示，硼酸濃度、培養溫度、培養時間及交互效應對花粉萌發率的影響差異極顯著，60?mg/L硼酸+12?℃+16?h培養下，萌發率達到最大值52.43%，極大的提高了花粉萌發率。硼酸濃度、培養溫度及交互效應對花粉管伸長的影響極顯著。培養基中添加30?mg/L硼酸36?℃培養3～24?h后，400～1100?μm長度的花粉管比例最高，平均數量為35個，平均花粉管長度為3?h：453.16?μm、16?h：527.74?μm、24 h：571.52?μm，培養24 h雖然花粉管平均長度值最大，但400 μm以內的花粉管數量僅為5個，不利于提高授粉成功率。綜合分析認為60?mg/L硼酸+12?℃+16?h （A3B1C3）為紅司花粉萌發較理想條件，30 mg/L硼酸+36?℃+16?h（A2B4C3）為紅司花粉管生長的適宜條件。

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