基于EEM與PCR-DGGE技術分析溫度對蚯蚓堆肥處理城鎮污泥的影響

侯素霞，雷旭陽*，張輝，丁淑杰，崔廣宇

1.邢臺職業技術學院資源與環境工程系，河北 邢臺 054000；2.同濟大學污染控制與資源化研究國家重點實驗室，上海 200092

蚯蚓堆肥作為一種環境友好的、可持續的安全生物處理技術逐漸被我們所熟知（Elvira et al.，1997；Kuzyakov et al.，2000；Castillo et al.，2013）。在前期的研究中發現，蚯蚓能夠顯著加快城鎮脫水污泥中有機質的降解速率（陳學民等，2010a；陳學民等，2010b；陳學民等，2010c）；將污泥造粒后，能為蚯蚓提供適宜的生存環境（Fu et al.，2015a），并顯著提高堆肥產物穩定化程度（伏小勇等，2015）。在蚯蚓堆肥過程中，微生物對基質中有機質降解起著重要作用，而蚯蚓的介入會對微生物的數量及種群結構產生影響（Munnoli et al.，2015）。在蚯蚓處理豬糞系統中，細菌、真菌的微生物種群多樣性均下降（Gómez-Brandón et al.，2011），而以牛糞混合樹葉作為蚯蚓堆肥基質發現，蚯蚓的存在豐富了系統中微生物種群多樣性（Yakushev et al.，2009）。此外，Fu et al.（2015b）通過研究蚯蚓處理不同粒徑的顆粒污泥發現，隨著兩種粒徑堆肥系統中礦化程度升高，細菌多樣性降低，而真核微生物多樣性升高。因此，蚯蚓堆肥基質和實驗條件與系統微生物種群多樣性關系密切（Koubová et al.，2015）。

溫度作為堆肥過程中諸多環境影響因子中較容易控制的因素之一，不但對蚯蚓的生長繁殖以及代謝活性有著巨大影響，對微生物代謝活性以及種群結構的影響也極為突出（曹先艷等，2008；郭昱廷等，2012）。在 15—25 ℃范圍內，赤子愛勝蚓（Eisenia foetida）在顆粒污泥基質中表現出較好的適應性，溫度升高能夠加快蚯蚓堆肥的穩定化速率，且在25 ℃下系統穩定化程度遠高于15、20 ℃（陳學民等，2016），這可能是由于系統中微生物種群結構發生改變，導致系統穩定程度產生了差異，然而目前鮮有報道。

本文利用三維熒光光譜（EEM）探討了系統中溶解有機質（DOM）的變化規律；繼而通過PCRDGGE技術和測序手段研究不同溫度條件下蚯蚓堆肥微生物種群結構的差異，為蚯蚓處理城鎮污泥補充理論依據。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用赤子愛勝蚓（Eisenia foetida）為實驗室培養。實驗所用污泥為蘭州市七里河污水處理廠脫水污泥，將其制成5 mm粒徑的顆粒，實驗用泥開始和堆肥結束時理化、生化指標見表1。

表1 實驗用泥開始和結束時理化、生化指標Table 1 Physicochemical parameters of the initial substrate and the composting products

實驗分為3組，每組3個平行。每個平行反應器中加入4 kg顆粒污泥和100條蚯蚓，每條蚯蚓重約1.0 g。將3組反應器置于恒溫培養箱中，并分別維持在 (15±1)、(20±1)、(25±1) ℃實驗環境下，每天人工翻動一次。實驗期間用塑料薄膜保濕、深色覆蓋物避光。實驗進行了60 d，分別在第0、10、30、60天采樣一次，分為兩部分，一部分鮮樣進行陰干、研磨，過100目篩（孔徑為0.15 mm）、裝聚乙烯袋保持備用；另一部分鮮樣在?40 ℃保存做分子生物學實驗。

1.2 測定方法

1.2.1 三維熒光光譜分析

取陰干、研磨后的樣品，以去離子水為浸提劑，將樣品與去離子水以質量比1∶20混合，震蕩24 h后離心，過0.45 μm濾膜后保存，采用日立F-7000型熒光光度儀進行三維熒光光譜分析。測定條件：電壓為700 V，激發波長（λEx）250—550 nm，步長5 nm；狹縫寬度5 nm；掃描速度2400 nm·min?1。其中：類絡氨酸、類色氨酸（Ex：220—250 nm/Em：285—380 nm）；類富里酸（Ex：220—250 nm/Em：>380 nm）；類胡敏酸（Ex：>310 nm/Em：>380 nm）；類蛋白質（Ex：>250 nm/Em：<380 nm）。

1.2.2 DNA的提取及PCR擴增

取冷凍污泥 0.3 g室溫下解凍，用強力土壤DNA提取試劑盒（美國，MOBIO）提取DNA，并將提取好的DNA用超純水稀釋20倍，以做后續擴增 實 驗 。16S rDNA 的 引 物 為 341f（5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′），所帶 GC夾子為（5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGG GCACGGGGGG-3′），907r（5′-CCGTCAATTCCTTT GAGTTT-3′）；18S rDNA 的引物為 Fung（5′-ATTCCCCGTTACCCGTTG-3′），所帶 GC夾子為（ 5′-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCC GCCCCCGCCCC-3′），NS1（5′-GTAGTCATATGCTT GTCTC-3′）（Huang et al.，2014；Chen et al.，2015）。50 μL 擴增體系：DNA 模板 1 μL，10×Taq buffer 5 μL，dNTP Mixture 4 μL，前引物（20 μM）0.5 μL，后引物（20 μM）0.5 μL，BSA（5 g·kg?1）1 μL，Ex Taq 0.25 μL，超純水 37.75 μL，同時做不加 DNA 模板的空白對照。將上述反應液在TP600 PCR儀（日本TaKaRa）擴增。16S rDNA擴增條件：預變性95 ℃（10 min），35 個循環（95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s），延伸72 ℃（10 min）。18S rDNA擴增條件：94 ℃（10 min），30個循環（94 ℃ 30 s，50 ℃30 s，68 ℃ 60 s），延伸 68 ℃（10 min），用質量分數為1.2%的瓊脂糖電泳檢測擴增效果。

1.2.3 變性梯度凝膠電泳（Denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）及測序

用DcodeTM system（美國Bio-Rad）擴增PCR產物。電泳條件：質量分數為6%聚丙烯酰胺凝膠，16S rDNA變性梯度（ω尿素/ω甲酰胺）為35%—60%，電壓80 V，時間16 h；18S rDNA變性梯度（ω尿素/ω甲酰胺）為25%—40%，電壓60 V，時間20 h。電泳結束后的膠用 Andy Gold TM Nucleic Acid GelStain（美國Andy）染色30 min，于凝膠成像儀（上海培清JS-2012）拍照。

1.3 數據處理

1.3.1 微生物種群多樣性的計算方法

DGGE指紋圖譜中條帶的數目、亮度及遷移位置反映了基質中微生物種群的多樣性及豐度。各泳道條帶的遷移情況分為4種：出現、加強、消失、減弱。不同位置的條帶代表不同的微生物類群，條帶越多表明微生物種群多樣性越高。而同一水平位置的條帶代表同一微生物種群，條帶的亮暗程度則反映該類微生物的相對數量。根據DGGE圖譜中條帶的位置、數量及亮暗程度，通過quantity one軟件處理后，得出微生物種群結構 Shannon-Wiener指數。Shannon-Wiener指數又稱香濃指數（H′），被用來對各樣品微生物的多樣性進行評價。計算公式如下：

式中：pi=ni/N；ni為峰面積，N為所有峰的總面積；E反映微生物種群的均勻程度；S是某個樣品中所有條帶數目總和。

1.3.2 DGGE條帶的序列測定及系統發育樹的構建

將清晰單一的條帶進行切割，溶于80 μL超純水中，4 ℃放置24 h。繼續PCR擴增，DGGE電泳，切膠，直到條帶清晰并單一。用不含GC夾子的引物對341f-907r、Fung-NS1進行PCR擴增，產物加ExoSAP-IT?試劑（美國Affymetrix）純化，純化條件為37 ℃（45 min），80 ℃（15 min），并提交測序公司測序（上海生工）。利用Chromas軟件對測序結果中的圖譜文件進行分析，篩選測序結果。將篩選出的目標序列利用NCBI網站上BLAST程序與GenBank中已有序列進行同源性比較，下載具有代表性的同源性較高的序列，并利用 MEGA 5.0軟件中的鄰接算法（Neighbor-joining method）構建系統發育樹。

1.3.3 DGGE指紋圖譜的主成分（PCA）分析圖

使用Quantity One軟件對DGGE指紋圖譜進行計算，然后使用statistics 10.0對3個溫度組中各條帶的pi值進行主成分分析（PCA）。

2 結果與分析

2.1 不同溫度組DOM的光譜特征變化情況

溶解性有機質（DOM），在堆肥過程中可利用其判斷堆肥的腐熟程度（陸彥宇，2017；單光春，2018），因此為了考察溫度對蚯蚓堆肥處理城鎮污泥的影響，本實驗對3個溫度組分別在0、10、30、60 d的DOM進行分析，結果如圖1所示。

DOM 的組分主要是由腐殖質（包括腐殖酸HA、富里酸FA）和一些親水性有機酸、氨基酸、碳水化合物、表面活性劑以及多環芳烴類等物質組成（何小松等，2010；管茂全等，2013）。由圖1可知，初始污泥組中可以分為4個峰區，其中Peak A的波長范圍Ex/Em：225/325 nm，為芳香類蛋白質，主要與微生物的活動有關；PeakB的波長范圍Ex/Em：275/340 nm，主要為溶解性微生物產物；Peak C和Peak D的波長范圍分別為Ex/Em：275/450 nm、Ex/Em：350/430 nm，均為腐殖酸類物質（李海青等，2020）。

圖1 堆體不同階段DOM的EEM譜圖Fig.1 EEM spectra of DOM at different stages

隨著時間的推移，Peak A、Peak B的峰區一直存在但強度和面積均逐漸變弱，說明系統中一直存在芳香類蛋白質并一直在被利用和降解并未消失，這是因為蚯蚓的存在能夠促進系統中可溶性有機質的降解，隨著時間的推移，蚯蚓堆肥系統中微生物量逐漸降低，導致可溶性代謝產物的減少。初始污泥中 Peak C和 Peak D峰區的強度和面積弱于Peak A、Peak B，表明城鎮污泥中DOM主要是以芳香類蛋白質和微生物代謝產物為主。在堆肥30 d時Peak C和Peak D峰區消失，表明系統中腐殖酸類物質基本被降解完。前人的研究發現，高溫堆肥接近尾聲時，系統中會產生大量的腐殖酸，這與堆肥系統中含有大量的木質素有關（陳迪等，2015）。本研究所用基質為城鎮市政污泥，木質素含量較少，且蚯蚓的存在可能有利于腐殖質的分解，因此與前人研究并不矛盾。在同一時期，系統隨著溫度的提高，峰區強度與面積均出現縮小趨勢，表明隨著溫度的升高，蚯蚓吞食和系統內的微生物的協同增效作用能夠加快系統中DOM的降解效率，提高系統的礦化程度，促進系統的穩定化進程（陳學民等，2016）。

2.2 微生物種群多樣性分析

3個溫度條件下的16S rDNA和18S rDNA種群DGGE指紋圖譜見圖2，Shannon-Wiener指數見圖3。由圖2-A可知，16S rDNA指紋圖譜中條帶1、3、4、5、6、8、9、10、12、14、16、17、18、19、21、22、23、25、26共存于3個溫度組中。條帶2、7、11、13、27僅存在15 ℃組、20 ℃組；條帶15、20、24僅存在于25 ℃組。圖2B顯示，18S rDNA指紋圖譜中條帶6、7、8、9、10、11、12、13、17均存在于3個溫度組中，條帶1、2僅存在15 ℃組；條帶16存在15 ℃組和20 ℃組；條帶15存在20 ℃組和25 ℃組；條帶3、4、5、14僅存在25 ℃組。圖3可知，細菌和真核微生物Shannon-winter 指數在 15 ℃組和 20 ℃組之間均無明顯差異，25 ℃組細菌的Shannon-Wiener指數低于15 ℃組、20 ℃組，而25 ℃組真核微生物高于15 ℃組、20 ℃組。

圖2 16S rDNA（A）和18S rDNA（B）的DGGE指紋圖譜Fig.2 DGGE fingerprint and its schematic representation of 16S rDNA(A) and 18S rDNA(B) at three different temperature conditions

圖3 不同溫度16S rDNA和18S rDNA的DGGE指紋圖譜Shannon-Wiener指數Fig.3 Shannon-Wiener index of biodiversity on 16S rDNA and 18S rDNA at three different temperature conditions

2.3 微生物種群主成分分析（PCA）

通過計算各條帶的 pi值，對 3個溫度組 16S rDNA和18S rDNA的DGGE指紋圖譜中各條帶進行主成分分析（PCA）見圖 4，樣品之間的距離代表它們的差異大小。

圖4 16S rDNA（a）和18S rDNA（b）的DGGE指紋圖譜PCA分析圖Fig.4 Principal components analysis of the microbial community on 16S rDNA (a) and 18S rDNA (b)

16S rDNA的DGGE圖譜PCA分析得出，第一主成分（PC1）與第二主成分（PC2）的累積方差貢獻率達到 95.19%。其中第一主成分的貢獻率為61.47%；第二主成分的貢獻率為33.72%。第一主成分中15 ℃組和20 ℃組載荷均在0.95以上，表明第一主成分主要與 15 ℃組和 20 ℃組有關。第二主成分中25 ℃組載荷在0.95以上，表明第二主成分主要與25 ℃組有關。

18S rDNA的DGGE圖譜PCA分析得出，第一主成分（PC1）與第二主成分（PC2）的累積方差貢獻率達到 98.63%。其中第一主成分的貢獻率為85.15%；第二主成分的貢獻率為13.48%。15 ℃組、20 ℃組和25 ℃組在第一主成分中載荷均在0.9以上，而在第二主成分中的載荷均低于0.5，表明第一主成分與3個溫度組均有關，第二主成分與3個溫度組的關聯較低。

2.4 微生物種群基因測序

將16S rDNA和18S rDNA的DGGE圖譜中特異性條帶進行測序，把得到的序列與GenBank數據庫中已有序列進行比對分析，獲得各個序列的同源性信息，構建系統發育樹（圖5和圖6）。16S rDNA的 DGGE圖譜中特異性條帶 1、3、4、6、7、8、12、21、25所對應微生物與近源微生物的相似度關系分屬4個門：擬桿菌門（Bacteroidetes）、綠菌門（Chlorobi）、酸桿菌門（Acidobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）。18S rDNA的DGGE圖譜中特異性條帶7、8、9、10、11、13所對應微生物與近源微生物的相似度關系分為真菌界（Fungi）和原生動物界（Protozoa）。

圖5 16S rDNA的DGGE圖譜系統發育樹Fig.5 Neighbour-joining tree of partial 16S rDNA gene sequences from DGGE image

圖6 18S rDNA的DGGE圖譜系統發育樹Fig.6 Neighbour-joining tree of partial 18S rDNA gene sequences from DGGE image

2.5 討論

從理論上講，DGGE圖譜中的條帶代表一個微生物類群，條帶的有無及明暗程度，可判斷各樣品中微生物種群結構及菌種的相對數量。表1和圖1顯示，25 ℃組系統有機質的降解速率、礦化程度高于15 ℃和20 ℃組。由圖2、3可知，25 ℃組細菌種群多樣性低于15 ℃組、20 ℃組，而真核微生物種群多樣性高于15 ℃組、20 ℃組，這可能由于溫度高強化了蚯蚓和微生物對基質的降解和同化作用（韓雅莉，1993；孫振鈞等，2004），腐殖質含量降低，僅剩下穩定的芳香族類物質，營養物質單一、礦化程度升高，導致了細菌種群多樣性降低，而真核微生物種群多樣性升高。

從圖4可以看出，15 ℃組與20 ℃組的微生物種群結構略有差異，但種群類別完全相同，差異主要體現在微生物種群的相對數量有所不同。同時，15 ℃組、20 ℃組的細菌種群結構與 25 ℃組差異性較大，這是由于個別微生物種群類別的出現和消失以及共有微生物種群的相對數量不同所致。16S rDNA的DGGE指紋圖譜PCA分析結果顯示，3個溫度組共有條帶數均占各溫度組總條帶數的 79%以上，除條帶3、4、6、8外，其他共有條帶均集中在原點附近，表面3個溫度組中主要細菌種群類別并未出現較大差異，這可能與3個溫度組的系統中DOM的主要成分有關。18S rDNA的DGGE指紋圖譜PCA分析結果顯示，3個溫度組的真核微生物種群結構之間均存在差異，但相鄰溫度的兩組之間差異較小，并且共有條帶數分別占3個溫度組總條帶數的75%、82%、64%，表明15 ℃、20 ℃組的真核微生物種群類別與25 ℃組差異性較大。此外，條帶8對3個溫度組的貢獻均較高，條帶9對15 ℃組貢獻較大，條帶13對20 ℃組、25 ℃貢獻較高。綜上可知，蚯蚓堆肥系統中微生物種群對于溫度的改變存在緩沖區間，當溫度在 15—20 ℃范圍內變化時，系統中微生物種群類別及結構差異較小；而當溫度接近 25 ℃時則會對系統中微生物種群類別及結構產生影響，造成這種結果的原因可能與25 ℃組的有機質含量顯著低于15 ℃組和20 ℃組有關。

圖5顯示，系統中共有的細菌種群有條帶3、4、6、7、8、21屬于擬桿菌門，是蚯蚓堆肥中存在的主要細菌門類（Danon et al.，2008），也是活性污泥法和生物膜法水處理工藝系統中的優勢細菌（Wagner et al.，2002），并且對纖維素、幾丁質等難降解大分子有機物具有較強的降解能力（Li et al.，2013a；Li et al.，2013b）。條帶1和12分別為綠菌門和酸桿菌門均屬于厭氧菌，綠菌門具有固氮作用，能夠利用各種形式的碳素和氮素作為自己的碳源和氮源，為某些異養微生物提供有機氮源（Keppen et al.，2008）；而酸桿菌門微生物能夠降解多種有機物質，從簡單的糖類到復雜的半纖維素等都具有降解能力（Ward et al.，2009）。以上條帶所對應的微生物對 25 ℃組的貢獻度均高于 15 ℃組和20 ℃組。此外，條帶25屬于變形菌門，且屬于γ變形菌門（Gammaproteobacteria）中的黃單胞菌（Xanthomonadaceae），專性好氧，是一種植物病原菌，在3個溫度組的相對數量均較低。圖6顯示，系統共有的真核微生物種群有條帶10、11、13屬于子囊菌門（Ascomycota），對木質素及纖維素等具有較強降解能力（Guillén et al.，2005；Baldrian et al.，2008），對3個溫度組均有貢獻。條帶7對應的微生物為兩性綿酶菌（Achlya bisexualis），屬于水霉目的一類霉菌，常在活性污泥法水處理工藝系統中發現（Matsunaga et al.，2014），對3個溫度組的貢獻均較弱。條帶9屬于毛霉菌（Mucorales）是一類典型的木質素、纖維素降解菌，能夠分泌完整的纖維素降解酶（Saha，2004；Karimi et al.，2013），對 15 ℃組貢獻較大。條帶 8對應的無根蟲門（Apusozoa）屬于原生動物，目前對于其功能報道較少，然而該類微生物對3個溫度組的貢獻均較高，表明此時的系統環境適合其生存，無根蟲門可能對于系統穩定化起到積極作用。

溫度可以直接或間接地改變蚯蚓和微生物的活性，從而對蚯蚓堆肥基質的性質產生影響，這種影響反饋到微生物種群結構，使其發生改變更加適應環境。因此，堆肥結束時系統較為穩定，系統中主要是以降解纖維素、幾丁質等難降解有機質為主的擬桿菌門和子囊菌門為優勢種群，且溫度高，相對數量多，系統中易利用有機質所占比小大，系統更穩定。

3 結論

（1）DOM的三維熒光分析表明，隨著溫度的提高，蚯蚓堆肥可以充分降解利用城鎮污泥中的腐殖酸類有機質，促進系統腐熟程度，增加其穩定化效率。

（2）蚯蚓處理城鎮污泥系統中的微生物種群結構對 15—20 ℃的溫度條件反應不敏感，細菌和真核微生物的種群多樣性差異均較小。溫度為 25 ℃時，系統中細菌種群多樣性降低，真核微生物種群多樣性升高。

（3）堆肥結束時，3個溫度組系統中均以擬桿菌門和子囊菌門為優勢種群，且溫度越高，擬桿菌門微生物和子囊菌門微生物的相對數量越多，系統中易利用有機質所占比重越小，系統更加穩定。