許英瑞,吳世芳,楊曉麗,薛元泰,朱妍麗,張衛兵,趙 軍,文鵬程,*
(1.甘肅農業大學食品科學與工程學院,甘肅 蘭州 730070;2.甘肅省商業科技研究所有限公司,甘肅 蘭州 730010;3.青海雪峰牦牛乳業有限責任公司,青海 海南藏族自治州 813000)
牦牛作為一種長期生存于高海拔、寒冷地區的物種[1],惡劣的環境條件使其所產的乳汁比其他物種具有更高的營養價值[2]。研究表明[3],荷斯坦牛乳中干物質含量為16.3%、脂肪含量為5.6%、蛋白質含量為4.68%,而牦牛乳中的干物質含量為19.0%、脂肪含量為8.8%、蛋白質含量為5.41%,二者相比較,牦牛乳的營養成分含量更高,因此,牦牛乳被譽為“天然綠色濃縮乳”[4]。牦牛乳不僅營養價值高、綠色天然、無污染,還具有抗高血壓、抗糖尿病和抗癌等藥用價值[5],這使得牦牛乳成為世界范圍內的研究熱點。
牦牛乳作為一種地域特色資源,藏區牧民自行消費占比較大,能夠帶來的額外收益非常有限,所以有必要大力發展牦牛乳產業,充分利用并開發這項資源。酸乳是一類以鮮乳為原料、經乳酸菌發酵而成的發酵乳制品,不僅具有比鮮乳更高的營養價值,而且還能通過乳酸菌的發酵代謝作用產生多種生物活性物質,從而為人體提供更強的益生性,同時,酸乳所具有的獨特風味同樣使其成為最受消費者喜愛的食品之一[6-7]。
研究[8-9]發現,與牛乳酸乳相比,牦牛酸乳的總固形物、蛋白質、脂肪、乳酸、礦物質(如鈣、磷和鎂)以及VB和VC含量更高;除了優越的營養特性,最新的研究還發現牦牛酸乳具有降低人體膽固醇水平、調節血糖、增強機體免疫力、抗氧化能力、抗動脈粥樣硬化等多種保健功能[10],這為豐富牦牛乳產業提供了新的思路。
樺褐孔菌作為一種藥用真菌,已被廣泛用于治療各種病癥[11],如胃癌、腸癌、肝癌、糖尿病等[12],而發揮藥理功能的主要成分是樺褐孔菌中的多糖類物質[13],具有很高的研究價值。近幾年的研究表明,將活性多糖應用于發酵乳中,可以對發酵乳的品質起到顯著改善作用,然而將多糖類物質應用于牦牛酸乳的生產卻鮮有報道。因此,本研究首先通過液體深層發酵技術生產樺褐孔菌,并提取樺褐孔菌多糖,將多糖作為益生因子應用于牦牛酸乳的生產,采用單因素試驗確定最佳多糖添加量,進一步優化樺褐孔菌多糖牦牛酸乳的生產工藝,基于最佳工藝分別生產樺褐孔菌多糖牦牛酸乳與不添加樺褐孔菌多糖牦牛酸乳,比較其品質差異,研究樺褐孔菌多糖對牦牛酸乳的品質改善效果。
牦牛乳采自甘肅甘南藏族自治州;嗜熱鏈球菌G2、副干酪乳桿菌L9保存于甘肅農業大學食品科學與工程學院功能乳品工程實驗室;樺褐孔菌(CBS314.39)購自中國林業微生物菌種保藏管理中心。
PDA固體培養基、液體種子培養基、玉米發酵培養基、MRS培養基、GM17培養基 海博生物技術有限責任公司。
葡萄糖、磷酸二氫鉀、氯化鈣、磷酸二氫鉀、濃硫酸、苯酚(均為分析純) 國藥集團化學試劑有限公司。
PHS-3C pH計 上??茖W儀器股份有限公司;SW-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司;YX280不銹鋼壓力蒸汽滅菌鍋 上海三申醫療器械有限公司;TGL-20M臺式高速冷凍離心機 上海湘儀離心機儀器有限公司;HG303-4電熱恒溫培養箱、HWS26電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司;XHF-D高速分散器、Scientz-ND真空冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司;7890A/5975C氣相色譜-質譜聯用儀 美國安捷倫科技公司;TA.XT Express質構儀英國Stable Micro System公司。
1.3.1 菌種活化
1.3.1.1 樺褐孔菌的活化
無菌環境下,挑取少許樺褐孔菌原始菌種菌絲體,轉接于PDA固體培養基,28 ℃培養至菌絲體長滿整個平板,重復操作2 次,完成菌種活化[14-15]。
1.3.1.2 嗜熱鏈球菌G2與副干酪乳桿菌L9的活化
無菌環境下,分別稱取嗜熱鏈球菌G2與副干酪乳桿菌L9的凍干菌粉0.06 g于100 mL生理鹽水(0.85 g/100 mL)中,復水0.5 h,以10 倍梯度稀釋法取10-4~10-8濃度梯度涂布平板,放置于37 ℃恒溫培養箱培養48 h后挑取生長良好的單菌落劃線培養3 代,經鏡檢確定為純種菌后保存于4 ℃冰箱備用。挑取已完成純化的單菌落于液體培養基中活化培養3 代,完成菌種活化[16-17]。
1.3.2 樺褐孔菌菌絲體及多糖的制備
1.3.2.1 樺褐孔菌液體種子與菌絲體的制備
無菌環境下,用接種鏟取1 cm2大小的固態樺褐孔菌菌絲體培養物(加入適量無菌水,用研缽研磨至均勻)于100 mL液體種子培養基,28 ℃靜置3~4 d,直至出現半透明狀菌絲體小球,將種子培養物置于恒溫搖床(28 ℃、150 r/min)培養4 d,獲得液體種子;將液體種子以體積分數10%接種于玉米發酵培養基,振蕩培養(28 ℃、150 r/min)10 d,獲得目標產物,將培養完成后的液體菌種用3 層紗布過濾,留菌絲體小球備用,用磷酸鹽緩沖液(0.02 mol/L、pH 7.4)洗去菌絲體小球表面的培養基成分后,置于40 ℃烘箱烘干后粉碎,保存于4 ℃冰箱備用[18-20]。
1.3.2.2 樺褐孔菌多糖的制備
參考禚同友等[21]的方法并稍作修改。稱取一定量的樺褐孔菌菌絲體粉末,按75 mL/g的液料比加水溶解,置于80 ℃環境下水溶提取2.5 h,6 000 r/min離心15 min后取上清液,將上清液濃縮至原體積的1/4后添加4 倍體積的乙醇(體積分數95%),于4 ℃冰箱靜置24 h,再離心(8 000 r/min、10 min),沉淀用無水乙醇清洗3 次,以除去脂類物質,收集沉淀物并凍干,得到樺褐孔菌菌絲體粗多糖。
1.3.3 樺褐孔菌多糖牦牛酸乳的工藝優化
1.3.3.1 發酵劑的制備
分別挑取副干酪乳桿菌L9與嗜熱鏈球菌G2的單菌落于MRS、GM17液體培養基中活化3 代,將活化完成后的液體菌種按體積分數3%的接種量接種于脫脂乳培養基,42 ℃培養至凝乳狀態,得到發酵劑。
1.3.3.2 酸乳的制備工藝

操作要點:均質[22]:20 MPa均質5 min;預熱、配料:緩慢攪拌,預熱至80 ℃;殺菌[23]:95 ℃條件下滅菌5 min;冷卻、接種:待殺菌結束后轉移至超凈工作臺中冷卻至(40±2) ℃,按比例接入發酵劑后恒溫發酵;后熟:發酵結束后轉入4 ℃冰箱放置24 h完成后熟。
1.3.3.3 樺褐孔菌多糖添加量的確定
在發酵時間12 h、發酵溫度42 ℃、蔗糖添加量7 g/100 mL、發酵劑復配比1∶1的條件下,將樺褐孔菌多糖按不同添加量(0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%)添加于牦牛酸乳中,以感官評分及滴定酸度為評價指標確定樺褐孔菌多糖在牦牛酸乳中的最佳添加量。
1.3.3.4 單因素試驗設計
嗜熱鏈球菌G2與副干酪乳桿菌L9發酵劑復配比:設置發酵時間為12 h、發酵溫度42 ℃、蔗糖添加量7 g/100 mL,考察嗜熱鏈球菌G2與副干酪乳桿菌L9復配比(1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1)對酸乳感官評分及滴定酸度的影響。
發酵時間:設置發酵劑復配比為1∶1、發酵溫度42 ℃、蔗糖添加量7 g/100 mL,考察發酵時間(8、10、12、14、16 h)對酸乳感官評分及滴定酸度的影響。
發酵溫度:設置發酵劑復配比為1∶1、發酵時間12 h、蔗糖添加量7 g/100 mL,考察發酵溫度(38、40、42、44、46 ℃)對酸乳感官評分及滴定酸度的影響。
蔗糖添加量:設置發酵劑復配比為1∶1、發酵時間12 h、發酵溫度42 ℃,考察蔗糖添加量(5、6、7、8、9 g/100 mL)對酸乳感官評分及滴定酸度的影響。
1.3.3.5 正交試驗設計
在單因素試驗基礎上,選取發酵劑復配比、發酵時間、發酵溫度、蔗糖添加量4 個單因素進行牦牛酸乳制備工藝的優化,以酸乳感官評分結合滴定酸度為指標設計正交試驗,因素水平如表1所示。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Level and code of independent variables used for orthogonal array design
1.3.3.6 感官評定
由10 位本實驗室具有豐富感官評價經驗的研究生組成感官評價小組,分別對樺褐孔菌多糖牦牛酸乳的色澤、氣味、口感和組織狀態進行打分,評分標準見表2。

表2 牦牛酸乳感官評定標準Table 2 Criteria for sensory evaluation of yak yogurt
1.3.4 樺褐孔菌多糖酸乳品質評價
以正交試驗最佳生產工藝條件為基礎生產牦牛酸乳,不添加樺褐孔菌多糖的牦牛酸乳為對照組,添加樺褐孔菌多糖的牦牛酸乳為處理組,通過測定2 組牦牛酸乳的品質研究樺褐孔菌多糖對牦牛酸乳品質的改善效果。
1.3.4.1 酸乳活菌總數測定
采用GB 4789.28—2013《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 培養基和試劑的質量要求》[24]所述方法進行測定。
1.3.4.2 酸乳滴定酸度及pH值測定
滴定酸度測定:采用GB 5009.239—2016《食品安全國家標準 食品酸度的測定》[25]所述方法;pH值測定:采用pH計直接測定,將酸乳放置于室溫條件下并攪拌均勻,插入電極頭直接測定其pH值。
1.3.4.3 酸乳持水力測定
采用Ferragut等[26]的方法并稍作修改,取干凈離心管稱質量(m1,g),然后量取約5 mL酸乳置于離心管中并記錄其質量(m2,g),離心(5 000 r/min,15 min),棄上清液后記錄離心管的質量(m3,g)。持水力按下式計算。

1.3.4.4 酸乳質構測定
采用質構儀A/BE-35探頭測定。測試條件:測定速率2.0 mm/s,測前速率5.0 mm/s,探頭下降距離20 mm;每組平行測定3 次。
1.3.4.5 酸乳風味測定
萃取頭老化:將萃取頭與進樣器連接并插入進樣口,推進手柄桿,伸出纖維頭,270 ℃老化處理1 h,直到無色譜峰出現、基線穩定,縮回纖維頭。
樣品處理:取酸乳樣品20 g于50 mL萃取瓶,加入磁力攪拌轉子,旋緊瓶蓋,45 ℃吸附萃取30 min,萃取結束后迅速將萃取頭插入氣相色譜儀的進樣口,解吸5 min,每組平行測定3 次。
檢測條件:氣相色譜條件:HP-INNWAX色譜柱(60 m×0.25 mm,0.5 μm),采用程序升溫方式,起始溫度為60 ℃,保持1 min,以2 ℃/min升溫到255 ℃,保持20 min;進樣口溫度260 ℃,載氣為He;恒壓模式:10 psi(68.95 kPa),分流比為5∶1;質譜條件:電子轟擊離子源,電子能量70 eV,接口溫度250 ℃,離子源溫度230 ℃,溶劑延遲8 min,質量掃描范圍25~550 u。
數據統計采用Excel軟件,繪圖采用Origin 2018軟件,結果采用SPSS 22.0軟件中的單因素方差分析進行顯著性分析,P<0.05具有統計學意義。

圖1 樺褐孔菌多糖對牦牛酸乳感官評分及滴定酸度的影響Fig. 1 Effect of Inonotus obliquus polysaccharides on sensory evaluation score and titratable acidity of yak yogurt
由圖1可知,樺褐孔菌多糖添加量對牦牛酸乳的感官評分及滴定酸度影響顯著(P<0.05)。隨著樺褐孔菌多糖添加量的增大,牦牛酸乳的感官評分呈現先增大后減小的趨勢,當樺褐孔菌多糖添加量為0.4%時,牦牛酸乳的感官評分最高。酸乳的滴定酸度能夠較大程度地影響其口感,滴定酸度較高或較低都會引起不適,綜合考慮,添加0.4%樺褐孔菌多糖進行牦牛酸乳的工藝優化試驗。
2.2.1 發酵劑復配比對牦牛酸乳感官評分及滴定酸度的影響

圖2 發酵劑復配比對牦牛酸乳感官評分及滴定酸度的影響Fig. 2 Effect of starter culture composition on sensory evaluation score and titratable acidity of yak yoghurt
目前市場上的酸乳發酵多采用混合菌種發酵,不同菌種在酸乳發酵階段分別控制產酸、產香特性。由圖2可知,當發酵劑中副干酪乳桿菌L9含量較高時,牦牛酸乳的滴定酸度較大,口感明顯不適;當嗜熱鏈球菌G2含量較高時,酸乳的凝乳表現較差,乳清析出嚴重。2 種發酵劑菌種含量過高或過低都會對酸乳的口感造成負面影響,當嗜熱鏈球菌G2與副干酪乳桿菌L9發酵劑復配比為1∶1時牦牛酸乳感官評分最高,且酸度適口。
2.2.2 發酵時間對牦牛酸乳感官評分及滴定酸度的影響

圖3 發酵時間對牦牛酸乳感官評分及滴定酸度的影響Fig. 3 Effect of fermentation time on sensory evaluation score and titratable acidity of yak yoghurt
由圖3可知,隨著發酵時間的延長,牦牛酸乳的感官評分及滴定酸度均顯著上升(P<0.05),當發酵時間達到12 h時,牦牛酸乳的感官評分及滴定酸度與發酵14 h相比差異不顯著,此時酸乳凝乳狀態良好,酸度適中,故較適發酵時間為12 h。
2.2.3 發酵溫度對牦牛酸乳感官評分及滴定酸度的影響
環境溫度能夠顯著影響乳酸菌的生長繁殖,由圖4可知,發酵溫度處于44~46 ℃時,乳酸菌的生長條件被高溫抑制,從而導致酸乳的產酸、產香不足,使牦牛酸乳感官得分較低。當發酵溫度處于40~42 ℃時,牦牛酸乳口感較佳,且感官評分及滴定酸度差異均不顯著,故選擇較低的40 ℃作為發酵溫度進行優化試驗。

圖4 發酵溫度對牦牛酸乳感官評分及滴定酸度的影響Fig. 4 Effect of fermentation temperature on sensory evaluation score and titratable acidity of yak yoghurt
2.2.4 蔗糖添加量對牦牛酸乳感官評分及滴定酸度的影響

圖5 蔗糖添加量對牦牛酸乳感官評分及滴定酸度的影響Fig. 5 Effect of sucrose addition on sensory evaluation score and titratable acidity of yak yoghurt
蔗糖作為一種碳元素含量豐富的物質,可以作為營養成分用于酸乳的發酵代謝過程,為酸乳帶來更加豐富的風味與更好的凝乳表現,過低的蔗糖添加量會導致酸乳凝乳性能較差、口感較酸等問題,而過高的蔗糖添加量則會掩蓋酸乳原本特有的發酵香味,導致酸乳甜度較高。由圖5可知,當蔗糖添加量為5~8 g/100 mL時,隨著蔗糖添加量的增大,牦牛酸乳的感官評分及滴定酸度均有所提升且提升效果顯著(P<0.05),在蔗糖添加量為8 g/100 mL的條件下,感官評分及滴定酸度均為最高值,此時酸乳的口感細膩潤滑、酸甜可口。
綜上所述,選取嗜熱鏈球菌G2與副干酪乳桿菌L9發酵劑復配比為1∶1、發酵時間為12 h、發酵溫度為40 ℃、蔗糖添加量為8 g/100 mL為較適參數,進行牦牛酸乳制備工藝正交優化試驗。
由表3可知:單因素試驗中影響樺褐孔菌多糖牦牛酸乳感官評分的因素依次為發酵劑復配比>蔗糖添加量>發酵溫度>發酵時間,最優發酵工藝為A2B3C1D2,即發酵劑復配比1∶1、發酵時間14 h、發酵溫度38 ℃、蔗糖添加量8 g/100 mL;各因素對樺褐孔菌多糖牦牛酸乳滴定酸度影響的順序依次為發酵時間>發酵劑復配比>發酵溫度>蔗糖添加量,最優發酵工藝為A2B3C2D1,即嗜熱鏈球菌G2與副干酪乳桿菌L9發酵劑復配比1∶1、發酵時間14 h、發酵溫度40 ℃、蔗糖添加量7 g/100 mL。由4 項單因素試驗結果可知,發酵劑復配比、發酵時間、發酵溫度和蔗糖添加量均可顯著影響牦牛酸乳的品質(P<0.05);正交試驗采用雙重指標考察多糖牦牛酸乳的品質,得出的最佳工藝條件雖有所差異,但大體接近。考慮到若將酸乳的滴定酸度作為評測樺褐孔菌多糖牦牛酸乳的唯一指標,可能會造成酸乳口感不均衡、凝乳性能表現較差等問題,綜合考慮,將感官特性作為評價指標對牦牛酸乳進行測評。得出正交試驗最佳工藝條件為發酵劑復配比1∶1、發酵時間14 h、發酵溫度38 ℃、蔗糖添加量8 g/100 mL,在此工藝條件下發酵得到的樺褐孔菌多糖牦牛酸乳發酵香味濃郁、凝乳表現良好、口感細膩。

表3 正交試驗結果Table 3 Orthogonal array design with experimental results
2.4.1 活菌總數、滴定酸度、pH值及持水力
采用最佳工藝條件發酵生產牦牛酸乳,由表4可知,與對照組相比,樺褐孔菌多糖酸乳乳酸菌活菌總數增加34.1%,滴定酸度增加11.0%,pH值也相應地有所下降,持水力增加16.8%。

表4 牦牛酸乳部分品質指標測定結果Table 4 Quality attributes of yak yogurt with and without added Inonotus obliquus polysaccharides
2.4.2 質構特性

表5 牦牛酸乳質構測定結果Table 5 Texture measurement of yak yogurt with and without added Inonotus obliquus polysaccharides
質構特性作為酸乳部分指標的數據體現,能夠對品質做出客觀評價,并且與產品質量穩定性密切相關[27]。由表5可知,樺褐孔菌多糖可以大幅提升牦牛酸乳的硬度與黏度,但內聚性和黏度指數相較于無多糖牦牛酸乳有所下降。造成這一現象的原因可能是低含量的多糖與乳中的酪蛋白產生分子間作用力,促進了酪蛋白的相互聚集[28];也可能是由于樺褐孔菌多糖首先對乳酸菌產生增殖作用,使得胞外多糖的產量增大,胞外多糖再通過與酪蛋白相互結合并聚集,提高了酸乳的黏度和膠著性[29]。
2.4.3 風味

表6 牦牛酸乳揮發性風味物質測定結果Table 6 Analysis of volatile flavor substances of yak yogurt with and without added Inonotus obliquus polysaccharides
由表6可知,未添加樺褐孔菌多糖的牦牛酸乳共檢測出5 種特征風味物質,而添加了樺褐孔菌多糖的牦牛酸乳共檢測出12 種特征風味物質,可以看出樺褐孔菌多糖對牦牛酸乳的特征風味影響十分明顯。未添加樺褐孔菌多糖的牦牛酸乳,果香類風味物質相對含量為12.48%,奶油香類物質相對含量為62.94%;而添加樺褐孔菌多糖的牦牛酸乳果香類風味物質相對含量為36.96%,牦牛酸乳的果香味得到十分明顯的提升,但奶油香類風味物質相對含量相較于對照組有所下降。研究表明,樺褐孔菌多糖牦牛酸乳中的特征風味物質酮類與酚類占絕大多數,其中又以酮類居多,酮類化合物是酸乳中重要的風味物質,一般通過不飽和脂肪酸的氧化反應與熱降解反應、氨基酸的降解反應產生[30]。通過對比實驗組與對照組發現,樺褐孔菌多糖能夠豐富牦牛酸乳中的酮類物質,使其擁有更多的特征香氣,樺褐孔菌多糖可以作為一種改善牦牛酸乳風味的優良添加劑。
研究前期首先確定樺褐孔菌多糖的最佳添加量,發現添加0.4%樺褐孔菌多糖對牦牛酸乳的感官特性提升效果最佳,表明適宜添加量的樺褐孔菌多糖會對酸乳的感官特性產生正面影響。Sheraji等[31]研究發現,添加芒果皮多糖的脫脂酸乳其風味、結構、酸度和顏色優于普通脫脂酸乳,說明芒果皮多糖同樣可以用于提升脫脂酸乳的感官特性。Kip等[32]使用偏最小二乘法以及感官評價研究菊粉對低脂酸乳口感的改善作用,發現菊糖能夠顯著改善酸乳的稠度和黏度,并對口感起到積極影響。
將最佳工藝應用于樺褐孔菌多糖牦牛酸乳的生產,發現與未添加樺褐孔菌多糖的牦牛酸乳相比,樺褐孔菌多糖牦牛酸乳的乳酸菌活菌數增加34.1%,滴定酸度增加11.0%,pH值相應地有所下降,持水力增加16.8%,可以認為樺褐孔菌多糖改善了牦牛酸乳的品質。已有研究證實,杏鮑菇多糖[33]與滑菇多糖[34]可以顯著提高酸乳貯藏期間的乳酸菌活菌數,這是因為多糖含有豐富的碳源,可促進發酵乳中乳酸菌的生長與增殖。樺褐孔菌多糖能夠提升牦牛酸乳的持水力、硬度與黏度,這與多糖分子的強親水性密切相關,多糖類物質有絡合水的能力,可以以共價鍵的形式與蛋白質分子相互作用,增強發酵乳的凝乳能力[35]。
采用氣相色譜-質譜聯用測定2 組牦牛酸乳的特征風味物質,結果表明,未添加樺褐孔菌多糖的牦牛酸乳共檢測出5 種風味物質,添加樺褐孔菌多糖的牦牛酸乳共檢測出12 種風味物質。張素敏等[36]將海藻糖應用于酸乳中制備功能性酸乳,結果發現,全蔗糖酸乳與海藻糖酸乳中均檢出100 種風味物質,本研究檢測出的風味物質較少,這可能是由于測定方法與設定程序的不同所導致的。潘燁燦等[37]測定蛹蟲草浸提液酸乳的風味成分,結果顯示,共檢測出19 種風味物質,且酮類風味物質較多,這與本研究所得結果基本一致。
通過液體深層發酵技術生產樺褐孔菌菌絲體并制備樺褐孔菌多糖,研究樺褐孔菌多糖添加對牦牛酸乳品質的影響。確定樺褐孔菌多糖的最佳添加量為0.4%,通過研究嗜熱鏈球菌G2與副干酪乳桿菌L9發酵劑復配比、發酵時間、發酵溫度及蔗糖添加量對牦牛酸乳品質的影響,采用正交試驗優化牦牛酸乳的生產工藝參數,比較添加樺褐孔菌多糖牦牛酸乳與未添加樺褐孔菌多糖酸乳的差異,結果表明,添加樺褐孔菌多糖可顯著提升牦牛酸乳中乳酸菌活菌數,提升菌株產酸能力,同時顯著提升產品的持水力。本研究結果可為牦牛酸乳的品質改善提供新的思路,也可為樺褐孔菌多糖在特色乳制品中的利用提供理論依據。