水稻根際解磷菌的分離鑒定與特性研究

聶 振，林思芹，林元山

（湖南農業大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128）

長期不合理施用無機磷肥易生成難溶性沉淀，使我國南方水稻耕作底層土壤板結硬化的問題日益突出[1]。研究表明，土壤微生物可有效改善土壤質量；水稻根際接中微生物復合肥，水稻根際固氮菌、磷細菌及解鉀菌的菌數高于土體1～2 個數量級[2]。解磷菌范圍廣泛，霉菌、放線菌、細菌均有分布，其中細菌解磷效果較好，種類多，如芽胞桿菌、假單胞菌、洋蔥伯克霍爾德菌等[3-4]。假單胞菌JP2-3 在土壤中具有顯著的解磷和硝態氮去除效應，并能促進黃瓜植株生長。解磷菌劑的應用能減少農田土壤磷素的流失[5]。解磷細菌的解磷機制十分復雜，其中，分泌小分子有機酸、無機酸溶解難溶性磷酸鹽的“溶磷”為主，也有解磷菌分泌磷酸酶解磷，還有底物降解釋放磷[6]。為此，深入研究解磷菌及其應用對水稻生產和土壤保護具有及其重要現實意義。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 培養基（1）有機磷篩選培養基[7]：蛋白胨10.0 g，氯化鈉0.5 g，雞蛋黃20.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂粉20.0 g，加蒸餾水至1 000 mL，調pH 值 7.0～7.5，121℃滅菌25 min。（2）無機磷篩選培養基[8]：葡萄糖20.0 g，磷酸三鈣10.0 g，氯化鎂5 g，硫酸銨5.0 g，氯化鉀0.5 g，瓊脂粉20.0 g，加蒸餾水至1 000 mL，調pH 值 7.0～7.5，121℃滅菌25 min。（3）斜面培養基：酵母浸膏 5.0 g，氯化鈉 5.0 g，葡萄糖10.0 g，可溶性淀粉10.0 g，瓊脂粉20.0 g，加蒸餾水至1 000 mL，調pH 值 7.0～7.5，121℃滅菌25 min。（4）解磷基本培養基：葡萄糖2.0 g，硫酸銨0.5 g，磷酸三鈣1.0 g，硫酸鎂0.05 g，氯化鈉0.05 g，氯化鉀0.05 g，七水硫酸亞鐵0.005 g，一水硫酸錳0.003 g，加蒸餾水至100 mL，調pH值 7.0～7.5，121℃滅菌25 min。（5）阿須貝無氮培養基：甘露醇10.0 g，碳酸鈣 5.0 g，七水硫酸鎂 0.2 g，磷酸二氫鉀 0.2 g，硫酸鈣 0.1 g，氯化鈉 0.2 g，瓊脂粉20.0 g，加蒸餾水至1 000 mL，調pH 值 7.0～7.5，121℃滅菌25 min。（6）解鉀培養基：三氯化鐵0.005 g，碳酸鈣0.1 g，磷酸氫二鈉2.0 g，七水硫酸鎂0.5 g ，硫酸銨1.0 g，蔗糖5.0 g，鉀長石粉0.1 g，瓊脂20 g，加蒸餾水至1 000 mL，調pH 值7.0～7.5。121℃滅菌25 min。

1.1.2 水稻根際土壤通過GPS 定位經緯度，在湖南省農業科學院至湖南農業大學一帶水稻田大田（東經113°4′35″～113°4′47″，北緯28°11′41″～28°11′54″） 范圍內，均勻分布采集根際土若干份，取樣深度 5～30 cm，每份樣品濕重200～300 g，置于無菌封口袋中，準確標記，盡快帶回實驗室進行土壤解磷菌株的分離。

1.2 方 法

1.2.1 解磷菌的初步篩選取10 g 新鮮土加入90 mL無菌水至250 mL 無菌三角瓶中， 在200 r/min 恒溫振蕩30 min 后，按10 倍稀釋法依次配制10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的土壤懸浮液，吸取100 μL 均勻涂布于有機或無機磷分離培養基的90 mm 培養皿中，每梯度設3～6 個重復，37℃培養3～7 d，觀察是否出現解磷圈，測量解磷圈直徑（D）和菌落直徑（d），并計算溶磷圈的直徑和菌落直徑的比值（D/d），并接種斜面，4℃冰箱保存。

1.2.2 解磷菌的搖瓶復篩將初篩菌株接種于解磷基本培養基中，于37℃恒溫搖床、200 r/min 的條件下培養6 d，發酵液在分離因素10 000 g 離心 5 min，以不接種培養基作為空白對照，上清液用鉬銻抗比色法[9]測定可溶性磷含量，每處理設3 個重復。菌體磷按釩鉬銻抗比色法測定[10]。

1.2.3 解磷細菌的鑒定（1）解磷菌形態、生理生化特征按平板觀察。常規染色顯微觀察，參照《伯杰細菌鑒定手冊》的方法進行。（2）16S rDNA 測序分析。高活性解磷菌株送蘇州金唯智生物科技有限公司，進行16S rDNA 測序，構建系統發育樹，確定種屬。

1.2.4 菌株解鉀能力鑒定將菌株接種至解鉀培養基，37℃培養箱中培養4～7 d，觀察是否有解鉀圈。

1.2.5 菌株固氮能力鑒定將菌株接種至阿須貝培養基，37℃培養箱中培養4～7 d，觀察菌株能否生長。

2 結果與分析

2.1 平板初篩

從水稻田中取回12 份土壤樣品，分別進行無機磷降解菌和有機磷降解菌的單菌落分離，分別獲得具有水解圈的無機磷降解菌79 株，有水解圈的有機磷降解菌287 株。經形態初步判斷，無機磷降解菌以細菌為主，少量放線菌，霉菌和酵母菌未曾發現；有機磷降解菌種類分布較廣，以細菌和霉菌為主，其次為放線菌，少量酵母菌。部分篩選菌落直觀圖片見圖1。從圖1a 可知，無機磷篩選培養基，以無機氮硫酸銨為氮源，營養匱乏，解磷菌在無機磷平板上菌落和溶磷圈較小，土壤無機磷降解菌菌落總數維持在（5.0±0.5）×107CFU/g 土壤；相反，從圖1b 可知，因養分充足，在有機磷篩選平板上的菌落較大，水解圈也大，土壤有機磷降解菌菌落總數達（8.0±0.5）×108CFU/g。溶磷圈直徑與菌落的直徑之比（D/d）在1～2 之間，特別是無機磷培養基的溶磷圈難以測定，需要復篩確定解磷水平。由于耕地土壤板結主要是無機磷板結危害影響大，因而，重點研究無機磷的降解菌更有實際意義。

圖1 解磷菌的平板初篩及顯微觀察

2.2 解磷菌的搖瓶復篩

將初篩菌株進一步接種于解磷基本培養基，于37℃恒溫搖床、200 r/min 的條件下培養6 d 后，測定發酵液的可溶性磷含量，盡管平板初篩獲得較多的單菌落，但搖瓶復篩的差異很大，有的菌落難以在解磷基本培養基中有效生長繁殖，有的解磷活性很低，甚至檢測不出。解磷活性較高的部分菌株解磷能力結果見表1。從表1 可以看出，菌體磷在55 μg/mL 以內，發酵液水溶性磷均低于30 μg/mL，說明菌體在苛刻條件下，主要用于菌體磷的合成，用于自身代謝需要。發酵液的pH 值普遍低于初始培養基pH 值，一般處于pH 值 5.0～6.8，說明在現有培養基條件下，改變酸堿度的能力有限，但發酵液的pH 值高低與水溶性磷和菌體磷不成正相關關系，可能與菌體分泌小分子酸的強弱有關，其具體小分子酸的種類和強度有待進一步確定。菌株LSQ31 和NZ 204 的菌體磷和水溶性磷較高，特別菌株LSQ31 菌體磷達52.4 μg/mL，水溶性磷達26.9 μg/mL，總磷達79.3 μg/mL。有望深入基礎研究、探索應用潛力。

表1 解磷菌對無機磷的降解利用分析

2.3 氮源對菌株LSQ31 解磷的影響

由于無機磷培養基中有機氮源匱乏，菌體生長較少，而且周期長。在水稻耕作施肥的情形下，水稻田既有有機肥也有無機肥，肥料中的氮源對解磷菌的生長繁殖及解磷效果有影響。圖2 顯示，在搖瓶發酵條件下，維持基本培養基不變（葡萄糖2.0%），單一更換不同的氮源，菌株LSQ31 在有機氮源的發酵液中的菌體磷、水溶性磷和總磷差異顯著（P＜0.05，下同）；發酵液pH 值總體呈酸性。其中菌株LSQ31 在黃豆粕中的菌體磷達102.5 μg/mL，水溶性磷達44.8 μg/mL，總磷達147.3 μg/mL；發酵液渾濁度更深，pH 值 5.5，顯示更多的生物量。菜籽粕是其次好的一種氮源，有利于解磷菌生長、解磷。

2.4 碳源對菌株LSQ31 解磷的影響

碳源是微生物菌體合成、產物合成和能量代謝的重要成分，也是構成菌體小分子有機酸的碳架。圖3顯示，在搖瓶發酵條件下，變更基本培養基中氮源為黃豆粕（0.5%），同時更換不同的碳源，菌株LSQ31在不同碳源發酵液中的菌體磷、水溶性磷和總磷差異較大，影響解磷效果降序次序是葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、果糖及可溶性淀粉。其中菌株在葡萄糖中的菌體磷達98.4 μg/mL，水溶性磷達46.8 μg/mL，總磷達145.2 μg/mL；葡萄糖和蔗糖二者的影響差異不大，麥芽糖、果糖和乳糖也比較接近。比較氮源、碳源對解磷的影響，顯然有機氮源的影響更為明顯。

圖3 碳源對菌株LSQ31 解磷的影響

2.5 LSQ31 菌株的鑒定與保存

2.5.1 LSQ31菌株形態學觀察將LSQ31 菌株接種于LB 培養基平板上進行培養24～72 h，菌落呈圓形，淺黃色不透明，表面粗糙、濕潤、有暈環、無凸起；在顯微鏡下觀察該菌為球狀，無芽孢產生，運動，不產孢；經革蘭氏染色觀察其為革蘭氏陰性菌株，如圖1c 所示。

2.5.2 LSQ31菌株的16S rRNA序列分析LSQ31

菌株經測序以及在GenBank 進行BLAST 比對分析，LSQ31 菌株與Vogesella urethralisYM-1(NR169490.1)的同源性達99%。結果見圖4，初步鑒定菌株LSQ31為Vogesella屬，并且命名為Vogesellasp. LSQ31（福格斯氏菌LSQ31）。

圖4 LSQ31 菌株系統發育樹

2.6 LSQ31 菌株的生理生化特征

LSQ31 菌株能在LB 培養基上能生長良好，最適生長溫度為37℃，生物量24 h 達到峰值；在pH 值 5.5～7.5，33～37℃能很好地生長，能好利用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、阿拉伯糖、果糖、淀粉；能利用明膠、干酪素以及常規的有機氮源。菌株在LB 液體培養基培養15 d，仍然有生物活性；在LB 斜面培養基上4℃冰箱保存90 d 仍然存活；在LB 斜面培養基上室溫保存40 d 仍然存活，90 d 后全部死亡。LSQ31 菌株能在無氮培養基上，可能有固氮功能；也能在解鉀培養基上生長，也說明該菌具有一定的解鉀能力。

3 結論與討論

從水稻根際土壤中篩選出一株解磷活性較高的菌株LSQ31。該菌為革蘭氏陰性球菌，無芽孢。經16S rDNA 測序分析，菌株LSQ31 鑒定為Vogesella 屬，并且命名為福格斯氏菌（Vogesella sp.）LSQ31。該菌能利用多種碳源和有機氮源，具有與有機肥相互作用有效解磷，并改善土壤退化的潛力。

福格斯氏菌（Vogesella）的解磷作用，國內外鮮見報道。目前，土壤退化較為突出的問題為土壤鹽漬化、土壤酸化、土壤板結和土壤重金屬污染[11]。添加石灰治理土壤酸化、微生物、有機質可以有效修復土壤鹽漬化、板結和重金屬污染[12-13]。試驗篩選的福格斯氏菌LSQ31 菌株能更好的利用黃豆粕、菜籽粕等有機氮源，以發揮解磷功效，預示該菌株與有機肥可以實現相互作用實現土壤修復，特別在土壤板結和重金屬污染方面。該菌的解磷活性與不動桿菌解磷活性（143 μg/mL）相當[6]，具有進一步研究和應用的潛力。