顯齒蛇葡萄葉代用茶總黃酮以二氫楊梅素計的試驗驗證

張學英

（湘西自治州食品藥品檢驗所，湖南吉首 416000）

顯齒蛇葡萄（Ampelopsis grossedentata），是種子植物門雙子葉植物綱葡萄科蛇葡萄屬顯齒蛇葡萄種。顯齒蛇葡萄是一種野生藤本植物，廣泛分布于我國湖南、湖北、貴州、福建、廣西等省份。2013 年12 月24 日，原國家衛生和計劃生育委員會，將顯齒蛇葡萄葉納入可用于食品生產加工的新食品原料管理[1]，從此顯齒蛇葡萄葉代用茶（即莓茶或藤茶）納入我國食品生產許可市場準入發證范圍，俗稱藤茶、莓茶、茅巖莓、神仙草等。2019 年國家衛健委將顯齒蛇葡萄葉列入最新版食藥同源目錄[2]，由此顯齒蛇葡萄葉開啟食藥兩用新用途的廣大發展空間。近年來顯齒蛇葡萄葉代用茶（即莓茶或藤茶）產業因投入少、周期短、見效快、市場需求大、產品延伸研究空間大等特點，己成為湖南省張家界市和湘西州（特別是永順縣和鳳凰縣）脫貧攻堅和鄉村振興大力扶持項目。2020 年湖南省永順縣成功申請“永順莓茶”農產品地理標志[3]，給永順縣莓茶產業帶來了更大發展空間。

顯齒蛇葡萄葉代用茶（即莓茶或藤茶）其食藥兩用價值研究較多，其藤茶研究有藤茶栽培與開發利用[4]、藤茶有效成分及功效的研究進展[5]；其藥用價值研究[6-9]；其作為代用茶研究[10-11]；另有顯齒蛇葡萄葉代用茶檢測方法研究[12-16]。自然界中許多植物都含有天然黃酮類物質，總黃酮為黃酮類物質的總稱，常見黃酮類物質有蘆丁、斛皮素、二氫楊梅素、陳皮苷、葛根素等，但植物各異，則其總黃酮含量及主要黃酮單體成分也不盡相同，如有的植物多含蘆丁而有的則不含蘆丁等，不同植物黃酮類物質各異且各有特色。顯齒蛇葡萄被稱為“天然黃酮之王”，是自然界中總黃酮含量較多的一種植物，其主要特征物質是二氫楊梅素、楊梅苷、楊梅素等。經查資料食品中總黃酮的檢測方法有保健食品中總黃酮的測定（以蘆丁計）[17]、食品中總黃酮檢測法（以蘆丁計）[18-25]等。然而顯齒蛇葡萄葉代用茶（即莓茶或藤茶）的總黃酮應以什么計？或者說以蘆丁計是否合理？卻沒有相關文獻資料。筆者通過顯色劑選擇、分光光度計光譜掃描和液相色譜驗證等試驗，旨在驗證顯齒蛇葡萄葉代用茶中總黃酮以二氫楊梅素計的科學性。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 試劑甲醇（HPLC）；70%甲醇（自配）；乙腈（HPLC）；磷酸（HPLC）；0.1%磷酸水溶液（自配）；乙腈+0.1%磷酸水溶液（15+85，自配）；無水乙醇（HPLC、AR）；95%乙醇（AR）；70%乙醇（自配）；醋酸鉀（AR）；冰醋酸（AR）；98.2 g/L 醋酸鉀水溶液（100 ml 中含4 ml 冰醋酸，自配）；三氯化鋁（AR）；25 g/L 三氯化鋁水溶液（自配）；硝酸鋁（AR）；100 g/L 硝酸鋁水溶液（自配）；亞硝酸鈉（AR）；50 g/L 亞硝酸鈉水溶液（自配）；氫氧化鈉（AR）；40 g/L 氫氧化鈉水溶液（自配）。

1.1.2 儀器高效液相色譜儀（帶自動進樣裝置）、UV-2550 紫外可見分光光度計、 BSA-224S 感量0.000 1 g 分 析 天 平、JY502 感 量0.01 g 天 平、KQ5200V 型超聲波清洗器、常用玻璃器皿等。

1.1.3 標準品及標準溶液標準溶液Ⅰ（二氫楊梅素標準溶液620 μg/mL）：上海源葉生物科技有限公司生產二氫楊梅素（CAS 號27200-12-0，分子式C15H12O8，純度99.5%），稱取干燥恒重二氫楊梅素0.015 5 g 于小燒杯中，用色譜純甲醇溶解定容至25 mL 棕色容量瓶中混勻靜置，轉入試劑瓶中，稱重-18℃冷凍貯存，使用時放至常溫稱重并用色譜純甲醇補至衡重。標準溶液Ⅱ（二氫楊梅素標準溶液62 μg/mL）：標準溶液Ⅰ用95%乙醇溶解按1 ∶10 稀釋即可，冷藏貯存。標準溶液Ⅲ（楊梅苷標準溶液75 μg/mL）：上海源葉生物科技有限公司生產楊梅苷（CAS 號17912-87-7，分子式C21H20O12，純度98.5%），稱取干燥恒重楊梅苷0.007 5 g 于小燒杯中，用色譜純甲醇溶解定容至100 mL 棕色容量瓶中混勻靜置，轉入試劑瓶中，稱重-18℃冷凍貯存，使用時放至常溫稱重并用色譜純甲醇補至衡重。標準溶液Ⅳ（蘆丁標準溶液124 μg/mL）：上海安譜生產的蘆丁標準品（CAS 號153-18-4，分子式C27H30O16，純度99.3%），稱取干燥恒重蘆丁0.012 4 g 于小燒杯中，用95%乙醇溶解定容至100 mL 棕色容量瓶中混勻靜置，轉入試劑瓶中，冷藏貯存。

1.1.4 試驗樣品試驗樣品來源于湖南省市場監督管理局。科研樣品主要收集2020 年湖南省永順縣、鳳凰縣、古丈縣、張家界市、江華縣、桂東縣等不同地域莓茶或藤茶成品，有人工種植和野生莓茶或藤茶成品。樣品檢測前在實驗室進行簡單處理：60℃恒溫復干1 h →粉碎→備用。

1.2 方 法

1.2.1 分光光度計總黃酮檢測方法參照張學英[16]的方法，精確稱取約0.5 g 顯齒蛇葡萄葉代用茶粉末樣品置于100 mL 比色管中，加入70%乙醇水溶液50 mL 浸潤混勻，在50℃水浴超聲提取30 min，趁熱過濾至100 mL 容量瓶中，如此重復提取2 次，合并提取液并用70%乙醇定容至100 mL，搖勻靜置，提取液用蒸餾水按2 ∶25 稀釋備用。精確吸取標準溶液Ⅱ0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL 于10 mL 比色管中，二氫楊梅素標曲系列濃度為0、3.1、6.2、12.4、18.6、24.8 μg/mL；精確吸取樣品處理液1.0 mL 于10 mL 比色管中；在標曲系列和樣品比色管中加入少量蒸餾水約至5 mL，再加入25 g/L 三氯化鋁2 ml 搖勻放置5 min，再加入98.2 g/L 醋酸鉀2 mL，用蒸餾水定容搖勻，顯色反應呈淺黃色，15 min 后于294 nm 波長處測定吸光度值。總黃酮含量計算公式C=（C'×10）×F×100/ （m×V1/V2×1 000），式中C為總黃酮含量（g/kg），C'為樣品處理液檢測濃度（μg/mL），10 為比色管定容體積（mL），m 為代用茶的質量數（g），V1為比色用處理液體積（mL），V2處理液定容體積（mL），F 為處理液稀釋倍數，1 000、100 為單位換算系數。

1.2.2 液相色譜黃酮單體成分檢測方法參照文獻中的方法[26]，準確稱取顯齒蛇葡萄葉代用茶粉末樣品約0.5 g 至50 mL 比色管中，準確加入70%甲醇水溶液15 mL 旋渦混勻，再準確加入70%甲醇水溶液15 mL 沿壁洗凈，稱重記數，置于50℃超聲儀中超聲提取30 min，取出冷卻至室溫再次稱重，并用純甲醇補至超聲提取前的重量（即衡重或衡定體積），超聲提取液用蒸餾水進行1 ∶10 稀釋，稀釋液混勻過0.45 μm 濾膜，待上機檢測二氫楊梅素含量。標準溶液Ⅰ用70%甲醇稀釋成濃度為0、62、155、310、465、620 μg/mL 標曲系列待上機檢測，由二氫楊梅素濃度和峰面積制作標準曲線及計算方程。液相色譜檢測條件：色譜柱C18（4.6×250 mm，5 μm）或等效柱；標曲系列進樣量20 μL；樣品進樣量10 μL；檢測柱溫35℃；檢測時間約41 min；流動相A 為0.1%磷酸水溶液，流動相B 為乙腈，按1～12 min 流動相A 為85%、12～30 min 流 動 相A 為85%～70%、30～41 min流動相A 為85%進行梯度洗脫；全波長檢測，分別在290 nm 和350 nm 波長處分析二氫楊梅素和楊梅苷的含量。二氫楊梅素含量計算公式C=（C'×V×F）/（1 000×100×m），式中C 二氫楊梅素含量（g/kg）；C '為樣品處理液中二氫楊梅素濃度（μg/mL）；V 為70%甲醇提取液體積數（mL）；F 為稀釋倍數；m 為樣品稱樣量（g）；1 000、100 為單位換算系數。

2 結果與分析

2.1 顯色劑的選擇驗證

食品中總黃酮檢測分光光度計法常用顯色劑有三氯化鋁-醋酸鉀和硝酸鋁-亞硝酸鈉-氫氧化鈉等方法，本試驗通過3 種不同濃度樣品提取液不加顯色劑、加三氯化鋁顯色劑和加硝酸鋁顯色劑進行光譜掃描。科研樣品2020KY094 按1.2.1 方法進行提取和稀釋，分別吸取樣品提取稀釋液0.5、1.0、2.0 mL置于9 支10 mL 比色管中，共3 組9 管，其中第一組3 管加蒸餾水定容（即不加顯色劑）；第二組3 管按1.2.1 方法加入三氯化鋁顯色劑；第三組3 管分別加入蒸餾水約至4 mL，再加入100 g/L 硝酸鋁水溶液0.4 mL 輕搖放置6 min，再加入50 g/L 亞硝酸鈉水溶液0.4 mL 輕搖放置6 min；再加入40 g/L 氫氧化鈉水溶液4 mL，加水定容搖勻放置15 min，將3 組9 管溶液在200～600 nm 進行光譜掃描，光譜掃描比較圖見圖1～圖3。

圖1 不同濃度樣品提取液不加顯色劑光譜掃描比較

由圖1 可見，不同濃度樣品提取液不加顯色劑光譜掃描圖在約294 nm 處有最大吸收峰，峰形較明顯突出，但約340 nm 處有平緩拖尾峰，在約250～380 nm 間吸收峰波長跨度較大，且吸收峰對稱性較差；由圖2 可見，不同濃度樣品提取液加入三氯化鋁顯色劑光譜掃描圖在294 nm 處有最大唯一吸收峰，峰形對稱無拖尾峰，圖2 和圖1 大體相近，但圖2 吸收峰唯一更明顯；由圖3 可見，不同濃度樣品提取液加入硝酸鋁顯色劑后光譜掃描圖變化較大，并無成形吸收峰，故不宜選擇硝酸鋁顯色劑。由此，論證顯齒蛇葡萄葉代用茶的總黃酮檢測顯色劑用三氯化鋁-醋酸鉀，而不可用硝酸鋁，檢測波長選擇294 nm。

圖2 不同濃度樣品提取液加三氯化鋁顯色劑光譜掃描比較

圖3 不同濃度樣品提取液加硝酸鋁顯色劑光譜掃描比較

2.2 光譜掃描驗證試驗

2.2.1 樣品提取液光譜掃描圖科研樣品2020KY094按1.2.1 方法進行提取和稀釋，各吸取樣品稀釋液1 mL 分別置于2 支10 mL 比色管中，其中1 支比色管按1.2.1 顯色方法進行顯色反應，放置15 min 后進行光譜掃描；另1 支比色管用蒸餾水定容搖勻，放置15 min 后進行光譜掃描。同濃度樣品提取液加顯色劑與不加顯色劑光譜掃描比較圖見圖4。

圖4 同濃度樣品提取液加顯色劑與不加顯色劑光譜掃描比較

分別吸取樣品稀釋液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 按1.2.1 方法進行顯色反應，放置15 min 后進行光譜掃描。不同濃度樣品提取液加顯色劑光譜掃描比較見圖5。

圖5 不同濃度樣品提取液加顯色劑光譜掃描比較

由圖1 和圖4 可見，樣品不加顯色劑其光譜圖在294 nm 左右有最大吸收峰，但在340 nm 左右有平緩不明顯吸收峰，且2 個吸收峰之間峰形相連；由圖2、圖4 和圖5 可見，樣品加顯色劑后光譜圖在294 nm有唯一最大吸收峰且前后無其他吸收峰，峰形對稱完美，樣品濃度與其吸收峰Abs 值大小成一定正比例關系。由此論證顯齒蛇葡萄葉代用茶的總黃酮檢測波長選擇294 nm，顯色劑用三氯化鋁-醋酸鉀。

2.2.2 二氫楊梅素標準溶液光譜掃描準確吸取標準溶液Ⅱ各1.0 mL 分別置于2 支10 mL 比色管中，其中一支比色管按1.2.1 標曲系列顯色方法進行顯色反應，放置15 min 后進行光譜掃描；另一支比色管用蒸餾水定容搖勻，放置15 min 后掃描，同濃度二氫楊梅素標準溶液加顯色劑與不加顯色劑光譜掃描比較見圖6。準確吸取標準溶液Ⅱ0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL（濃度分別為3.1、6.2、12.4、18.6、24.8 μg/mL），按1.2.1 將標準曲線系列進行顯色反應，放置15 min 后進行光譜掃描，不同濃度二氫楊梅素加顯色劑光譜掃描比較見圖7。

圖6 同濃度二氫楊梅素標準溶液加顯色劑與不加顯色劑光譜掃描比較

圖7 不同濃度二氫楊梅素標準溶液加顯色劑光譜掃描比較

由圖6 和圖7 可見，二氫楊梅素標液不加顯色劑在294 nm 左右有最大吸收峰，但在340 nm 左右有平緩不明顯吸收峰，且兩個吸收峰之間峰形相連，而二氫楊梅素標液加顯色劑在294 nm 有唯一最大吸收峰且前后無其他吸收峰，峰形對稱完美，二氫楊梅素標準曲線系列濃度與其吸收峰Abs 值大小成一定正比例關系。比較圖1、圖4 和圖6 光譜圖較相似，再比較圖2、圖5 和圖7 光譜圖很相似，說明顯齒蛇葡萄葉代用茶的總黃酮主要單體成分為二氫楊梅素。由此論證顯齒蛇葡萄葉代用茶的總黃酮檢測波長選擇294 nm，顯色劑用三氯化鋁-醋酸鉀，定性定量以二氫楊梅素計。

2.2.3 蘆丁標準溶液光譜掃描準確吸取標準溶液Ⅳ各1.0 mL 分別置于2 支10 mL 比色管中，其中一支比色管按1.2.1 顯色方法進行顯色反應，放置15 min后掃描；另一支比色管用蒸餾水定容搖勻，放置15 min 后掃描。同濃度蘆丁標準溶液加顯色劑與不加顯色劑光譜掃描比較見圖8。

圖8 同濃度蘆丁標準溶液加顯色劑與不加顯色劑光譜掃描比較

準確吸取標準溶液Ⅳ0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL（濃度分別為6.2、12.4、24.8、37.2、49.6 μg/mL），按1.2.1 將標準系列進行顯色反應，放置15 min 后進行光譜掃描，不同濃度蘆丁標準溶液加顯色劑光譜掃描比較見圖9。

圖9 不同濃度蘆丁標準溶液加顯色劑光譜掃描比較

由圖8 可見，未加顯色劑的蘆丁標準溶液在約258 nm 和363.5 nm 波長處有吸收峰，且兩峰間峰形相連；加入顯色劑的蘆丁標準溶液在269.5 nm 和409.5 nm 有較明顯吸收峰，且兩峰間峰形相連；同濃度蘆丁標準溶液加與不加顯色劑光譜圖峰形相似，蘆丁標液加入顯色劑后吸收峰延后。由圖9 可見，蘆丁濃度與其吸收峰Abs 值大小成一定正比例關系。由圖1、圖2、圖4 和圖5 可見，顯齒蛇葡萄葉代用茶中不含或含極少量的蘆丁。由此反向論證顯齒蛇葡萄葉代用茶的總黃酮檢測定性定量不宜以蘆丁計。

2.2.4 樣品、二氫楊梅素和蘆丁光譜掃描通過以上2.2.1～2.2.3 試驗，再次分析比較樣品、二氫楊梅素和蘆丁加顯色劑與不加顯色劑光譜掃描圖，見圖10、圖11 和圖12。

圖10 樣品和二氫楊梅素標準溶液不加顯色劑光譜掃描比較

圖11 樣品和二氫楊梅素標準溶液加顯色劑光譜掃描比較

由圖10～圖12 可見，樣品和二氫楊梅素標準溶液不加顯色劑在294 nm 有明顯吸收峰，340 nm 波長處有不明顯吸收峰，且兩峰間峰形相連；樣品和二氫楊梅素標準溶液加入顯色劑在294 nm 波長有唯一明顯最大吸收峰；蘆丁標準溶液加入顯色劑在269.5 nm和409.5 nm 有吸收峰，且兩峰間峰形相連；由圖10～圖12 更直觀更科學可見，顯齒蛇葡萄葉代用茶中幾乎不含或含極少量的蘆丁，反之主要黃酮單體成分是二氫楊梅素。由此，科學論證顯齒蛇葡萄葉代用茶中總黃酮檢測應以二氫楊梅素計而不宜以蘆丁計，檢測波長為294 nm，顯色劑用三氯化鋁-醋酸鉀。

圖12 樣品、二氫楊梅素標準溶液和蘆丁標準溶液加顯色劑光譜掃描比較

2.3 液相色譜法驗證

顯齒蛇葡萄葉代用茶特征指標檢測研究，主要檢測其黃酮單體成分：二氫楊梅素、楊梅苷和楊梅素。同時也對顯齒蛇葡萄葉代用茶是否含有蘆丁及含楊梅苷（因兩者出峰時間相近）的情況進行驗證。科研樣品2020KY094 按1.2.2 方法進行樣品前處理。液相色譜法驗證試驗圖譜有楊梅苷和蘆丁標液液相色譜圖、楊梅苷和蘆丁標液液相光譜圖、樣品液相色譜圖、樣品加楊梅苷標液液相色譜圖以及樣品加蘆丁標液液相色譜圖，見圖13～圖19。

圖13 楊梅苷標液液相色譜圖

圖19 樣品加蘆丁標液液相色譜圖

圖14 蘆丁標液液相色譜圖

圖15 楊梅苷液相光譜圖

圖16 蘆丁液相光譜圖

圖17 樣品液相色譜圖

圖18 樣品加楊梅苷標液液相色譜圖

通過以上驗證試驗，得出結論：顯齒蛇葡萄葉代用茶中總黃酮以二氫楊梅素計，用三氯化鋁-醋酸鉀顯色反應，在294 nm 波長有唯一明顯最大吸收峰，且二氫楊梅素濃度與吸光度值成正比例關系，符合朗伯比耳定律[16]。

2.4 莓茶或藤茶樣品檢測

湖南省市場監督管理局科技項目（2020KJJH72）部分科研樣品，按1.2.1 和1.2.2 檢測方法進行總黃酮和二氫楊梅素指標檢測，檢測結果見表1。

表1 莓茶或藤茶樣品檢測結果

由表1 得出，顯齒蛇葡萄葉代用茶總黃酮（以二氫楊梅素計）和黃酮單體物質二氫楊梅素含量非常高，總黃酮（以二氫楊梅素計）高達300～400 g/kg，是自然界植物中真正“黃酮之王”；二氫楊梅素含量達200～300 g/kg，是顯齒蛇葡萄葉代用茶中黃酮單體含量最高的物質，其中，二氫楊梅素含量占總黃酮約70%～80%。顯齒蛇葡萄葉為二氫楊梅素深加工首選原材料。

3 結 論

通過顯色劑選擇、分光光度計光譜掃描、液相光譜、液相色譜和樣品加標等驗證試驗，表明顯齒蛇葡萄葉代用茶（即莓茶或藤茶）中總黃酮單體成分主要是二氫楊梅素，其中二氫楊梅素含量占總黃酮約70%～80%，且幾乎不含或極少含蘆丁，結論顯齒蛇葡萄葉代用茶（即莓茶或藤茶）中總黃酮以二氫楊梅素計，不宜以蘆丁計，用三氯化鋁-醋酸鉀顯色反應，在294 nm 波長處檢測。通過分析檢測莓茶或藤茶中總黃酮（以二氫楊梅素計）含量高達300～400 g/kg，其中二氫楊梅素含量高達200～300 g/kg，二氫楊梅素含量占總黃酮約70%～80%，為自然界黃酮含量極高的植物之一，植物界真正的“黃酮之王”，同時顯齒蛇葡萄葉可作為二氫楊梅素深加工提純最佳原材料。