葡萄籽原花青素提取物對大鼠脂肪沉積及脂質代謝的影響

顧艾鑫 張 童 王天虎 吳 澤 單安山 李建平

(東北農業大學動物科學技術學院，哈爾濱 150030)

原花青素是一種富含酚羥基的多酚，廣泛存在于各種谷物、豆類種子和蔬菜水果的核、皮或種籽中，對提高血脂、調節脂類代謝、抗氧化等有明顯的促進作用[1-2]，在植物飼料添加劑開發方面具有廣闊的前景。葡萄籽原花青素提取物(grape seed procyanidin extract, GSPE)主要由(+)兒茶素和(-)表兒茶素的二聚體或三聚體組成，因其原花青素含量較高而成為原花青素的主要來源[3-4]。原花青素具有改善畜禽肉品質的潛在作用[5]。張楠等[6]發現在玉米-豆粕型飼糧中添加GSPE可顯著降低育成豬背最長肌內的肌苷酸含量，提高豬肉鮮味。楊文軍等[7]報道，飼糧中添加40 mg/kg體重的GSPE可有效提高羔羊屠宰性能，改善羊肉品質。李德鵬等[8]觀察到GSPE能通過抑制脂質合成，減少綿羊前脂肪細胞脂質沉積。Pascual-Serrano等[9]發現服用GSPE的肥胖大鼠白色脂肪組織(WAT)中脂肪細胞變小，高血脂癥也有所緩解。畜禽體脂沉積是影響畜禽產品品質的因素之一，伴隨著人們對飲食健康的逐漸重視，肉類制品中的脂肪含量也隨之成為消費者關注的焦點[10]。目前的研究表明，GSPE可以顯著抑制動物的脂肪沉積并改善脂質代謝。盡管GSPE對畜禽肉品質的影響已有初步研究，但關于其在脂肪沉積和脂質代謝機制方面的研究尚不完善。脂質代謝系統可以通過無翅型MMTV整合位點家族3a(Wnt3a)/β-連環蛋白(β-catenin)途徑來調節脂肪細胞中脂質代謝基因的表達，進而調控脂質代謝和脂肪沉積[11]。因此，本研究以肥胖模型大鼠為研究對象，探討GSPE能否降低肥胖鼠體脂沉積、脂肪肝、緩解高血脂并探究Wnt3a/β-catenin信號通路是否在其中發揮作用，為通過營養手段調控畜產品質量提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

雌性SD大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司；基礎飼糧(大小鼠生長繁殖飼料Q/CYKAF 002—2018)和高脂飼糧由北京科奧協力飼料有限公司提供；GSPE由天津尖峰天然產物研究開發有限公司提供，原花青素含量≥95%；cDNA反轉錄試劑盒(RR047A)和染料法熒光定量試劑盒(RR420B)由大連TaKaRa公司提供；Wnt3a酶聯免疫試劑盒和β-catenin酶聯免疫試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司；二辛可寧酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(P0010S)購自上海碧云天生物科技有限公司。

1.2 試驗儀器

微量移液器[賽默飛世爾科技(中國)有限公司/中國艾本德]；多功能酶標儀(澳大利亞Tecen Austria GmbH)；7500熒光定量PCR儀(美國ABI)；高速低溫離心機(德國Sigma)；手持式組織勻漿機(北京大龍興創實驗儀器有限公司)等。

1.3 試驗設計

1.3.1 試驗飼糧

基礎飼糧組成參見商品飼糧說明；高脂飼糧組成為15.00%豬油、12.00%全脂乳粉、13.00%蛋黃粉、1.00%膽固醇和59.00%基礎飼糧。基礎飼糧及高脂飼糧營養水平見表1。

表1 基礎飼糧及高脂飼糧營養水平

1.3.2 大鼠分組及樣品采集

52只5～7周齡(體重170～220 g)雌性SD大鼠被單籠飼養在環境溫度為(21±4) ℃、室內濕度為(60±5)%、通風良好、持續12 h明/12 h暗循環照明周期的動物房中，試驗期間大鼠隨意攝入食物和水。適應性飼養1周后，將大鼠隨機分成2組：對照組(n=22)和高脂組(n=30)，分別飼喂基礎飼糧和高脂飼糧，每周記錄采食量并稱量體重1次。飼養8周后，從對照組中選出20只體重相近的大鼠隨機分成2組(n=10)，分別為Ⅰ組和Ⅱ組；同時，淘汰高脂組中增重較低的肥胖抵抗型大鼠，以體重大于正常組的平均體重±1.96倍標準差為建模成功標準，將體重符合建模要求的20只肥胖敏感型大鼠隨機分為2組(n=10)，分別為Ⅲ組和Ⅳ組。用生理鹽水溶解GSPE，Ⅰ組和Ⅲ組大鼠用生理鹽水灌胃，Ⅱ組和Ⅳ組大鼠均按500 mg/kg體重劑量用GSPE溶液灌胃。GSPE干預5周，每周日記錄大鼠采食量及體重1次，試驗期間大鼠均被單籠飼養。在處死大鼠前，禁食12 h，處死當日稱量大鼠終體重及采食量后，用無水乙醚麻醉大鼠并進行眼球取血，2 400 r/min離心1 min后分離血清，保存于-80 ℃冰箱。迅速剖取WAT、肝臟、脾臟、腎臟、腿肌稱量后保存于液氮中，后轉移到-80 ℃冰箱保存。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 臟器重量

試驗結束后，將剖取的WAT、肝臟、脾臟、腎臟、腿肌用生理鹽水沖洗干凈，電子天平準確稱重。

1.4.2 血清生化指標

使用南京建城生物工程研究所的試劑盒測定血清中高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)及葡萄糖(Glu)含量。

1.4.3 WAT中Wnt3a和β-catenin含量

使用無水乙醇將大鼠WAT在4 ℃低溫勻漿后離心取上清液，使用BCA試劑盒檢測上清液蛋白濃度，根據吸光度(OD)值使用酶聯免疫試劑盒檢測WAT中Wnt3a和β-catenin含量。

1.4.4 WAT中脂肪合成相關基因表達量

用TRIZOL試劑分離WAT中的總RNA，對RNA樣品進行提純，并在-80 ℃冷凍直至進行分析。根據制造商的說明，使用Prime Script RT試劑盒，在去除基因組污染后通過逆轉錄5 μL總RNA合成cDNA。靶基因的引物序列根據已發表的GenBank設計，由上海生工生物工程有限公司合成(表2)。本研究中，β-肌動蛋白(β-actin)被用來標準化目的基因的表達。瞬時離心樣品，并在實時熒光定量PCR設備上以匹配的程序進行40個循環：95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s。所有PCR反應每個樣品均進行3個平行，并且通過2-ΔΔCt法計算過氧化物酶體增殖劑激活受體γ(PPARγ)和脂肪酸合成酶(FAS)基因相對表達量。

表2 脂肪沉積相關基因引物序列

1.5 數據統計分析

采用SAS 9.2軟件處理數據，試驗前期建造大鼠肥胖模型時采用獨立樣本t檢驗對試驗數據進行兩兩比較；試驗結束后，對試驗數據進行多因素方差分析。數據以平均值±標準差的形式表示，當P<0.05時為差異顯著，當0.05

2 結果與分析

2.1 高脂飼糧誘導肥胖大鼠模型的建立

由表3可知，經過8周的飼喂，高脂組造模后體重顯著高于對照組(P<0.05)，肥胖大鼠模型建立成功。

表3 建模階段大鼠的體重變化

2.2 GSPE對肥胖大鼠臟器重量的影響

由表4可知，高脂飼糧顯著增加大鼠肝臟重量(P<0.05)，對WAT重量具有增加的趨勢(0.050.05)。此外，GSPE對肝臟重量有顯著的降低作用(P<0.05)，對脾臟、腎臟及WAT重量無顯著影響(P>0.05)。高脂飼糧與GSPE對肝臟重量的影響存在顯著交互作用(P<0.05)，對WAT重量的影響存在交互作用趨勢(0.050.05)。對肝臟和WAT重量進一步單因素方差分析，與Ⅰ組相比，Ⅲ組的肝臟及WAT重量顯著升高(P<0.05)，Ⅳ組肝臟重量顯著增加(P<0.05)，Ⅱ組肝臟及WAT重量無顯著差異(P>0.05)；與Ⅲ組相比，Ⅳ組的肝臟及WAT重量顯著降低(P<0.05)。

表4 GSPE對肥胖大鼠臟器重量的影響

2.3 GSPE對肥胖大鼠血清生化指標的影響

由表5可知，高脂飼糧顯著降低血清HDL-C含量(P<0.05)，顯著增加血清LDL-C含量(P<0.05)，并對血清Glu含量有增加的趨勢(0.050.05)。高脂飼糧與GSPE對血清HDL-C及LDL-C含量的影響存在顯著交互作用(P<0.05)，對血清Glu含量的影響不存在顯著交互作用(P>0.05)。對血清HDL-C和LDL-C含量進一步單因素方差分析，與Ⅰ組相比，Ⅲ組、Ⅳ組的血清HDL-C含量顯著降低(P<0.05)，Ⅱ組無顯著差異(P>0.05)；與Ⅲ組相比，Ⅳ組顯著升高(P<0.05)。與Ⅰ組相比，Ⅲ組、Ⅳ組的血清LDL-C含量顯著升高(P<0.05)，Ⅱ組無顯著差異(P>0.05)；與Ⅲ組相比，Ⅳ組顯著降低(P<0.05)。

表5 GSPE對肥胖大鼠血清生化指標的影響

2.4 GSPE對肥胖大鼠WAT中脂質代謝相關基因相對表達量的影響

由表6可知，高脂飼糧顯著上調WAT中PPARγ基因相對表達量(P<0.05)，對FAS基因相對表達量無顯著影響(P>0.05)。此外，GSPE顯著下調WAT中PPARγ基因相對表達量(P<0.05)，對FAS基因相對表達量有下調趨勢(0.050.05)；與Ⅲ組相比，Ⅳ組顯著降低(P<0.05)。

表6 GSPE對肥胖大鼠WAT中脂代謝基因相對表達量的影響

2.5 GSPE對肥胖大鼠WAT中Wnt3a和β-catenin含量的影響

由表7可知，高脂飼糧對WAT中Wnt3a及β-catenin含量均無顯著影響(P>0.05),而GSPE顯著降低WAT中Wnt3a及β-catenin含量(P<0.05)。此外，高脂飼糧與GSPE對WAT中Wnt3a及β-catenin含量的影響均存在顯著交互作用(P<0.05)。對Wnt3a及β-catenin含量進一步單因素方差分析，與Ⅰ組相比，Ⅲ組WAT中Wnt3a含量顯著升高(P<0.05)，Ⅱ組、Ⅳ組無顯著差異(P>0.05)；與Ⅲ組相比，Ⅳ組顯著降低(P<0.05)。與Ⅰ組相比，Ⅲ組WAT中β-catenin含量顯著升高(P<0.05)，Ⅳ組顯著降低(P<0.05)，Ⅱ組無顯著差異(P>0.05)；與Ⅲ組相比，Ⅳ組顯著降低(P<0.05)。

表7 GSPE對大鼠WAT中Wnt3a和β-catenin含量的影響

3 討 論

3.1 GSPE對肥胖大鼠脂質代謝的影響

畜禽肉品質與脂質代謝密切相關[12]，因此對于脂質代謝及脂肪沉積方面的研究至關重要。據報道，飲食中攝入過量的脂肪酸和膽固醇會影響血液膽固醇代謝，表現為血清中LDL-C含量異常升高及HDL-C含量降低[13]。而研究表明GSPE干預會促進體內的降膽固醇作用[14]。本試驗結果表明，GSPE可顯著下調肥胖模型大鼠血清中的LDL-C含量并使HDL-C含量升高。據報道，脂肪沉積與血清中LDL-C含量升高有關[15]。本試驗中，采用GSPE干預可以顯著緩解高脂飼糧所致大鼠WAT重量的升高，這與前人研究結果[16]一致。本試驗同時發現，GSPE可顯著降低肥胖大鼠的肝臟重量并對其他器官重量無顯著影響。這表明GSPE可抑制脂肪沉積，降低肥胖大鼠患高血脂及脂肪肝的風險性。PPARγ途徑是調控脂肪細胞中的脂質沉積的重要途徑之一[17]。PPARγ是許多脂肪合成基因的關鍵轉錄調節因子，它通過激活脂肪形成程序并將脂肪酸存儲在脂滴中，從而在脂肪細胞增殖和分化過程中發揮重要作用，脂質累積的過程中往往伴隨著PPARγ基因過度表達[18-19]。FAS是一種多功能脂肪合成關鍵靶基因，通過抑制FAS基因表達可抑制脂肪酸的從頭合成[20]。此外，FAS還可以通過提高PPARγ轉錄活性來參與脂肪合成[21]。研究表明，PPARγ特異性缺失可能影響脂肪在肝臟組織中的形成機制，降低FAS基因表達水平，減少肝臟脂肪沉積[22]。Lu等[23]還在體內試驗中發現，GSPE可有效地抑制飼喂高脂飼糧的草魚肝臟內PPARγ的mRNA表達量。本試驗中觀察到GSPE干預后的肥胖大鼠WAT重量減少以及WAT中脂肪酸合成基因FAS和PPARγ的基因相對表達量下調。以上結果表明，GSPE可以通過下調WAT內脂肪合成基因表達至正常水平來降低體內WAT含量，與本試驗中GSPE降低WAT含量的結果一致。

3.2 GSPE對肥胖大鼠WAT中Wnt3a/β-catenin信號通路的影響

脂質積累過多是引起脂肪細胞功能障礙的主要原因之一[24]。Wnt3a是重要的分泌蛋白，已被證實在細胞發育增殖、脂質代謝等生理過程中有重要作用[25]。作為Wnt3a途徑中的主要細胞質效應子，β-catenin由細胞質轉位至細胞核是Wnt3a信號轉導的關鍵步驟[26]。Wnt3a可與其受體低密度脂蛋白(LDL)受體相關蛋白(LRP)5/6及卷曲蛋白(Fz)相結合，使β-catenin穩定，啟動Wnt3a/β-catenin信號通路[27]。研究表明，Wnt3a/β-catenin信號通路參與肥胖的合成，抑制Wnt3a的表達，阻斷Wnt3a/β-catenin信號通路可以促進脂肪細胞凋亡[26,28]。有報道稱，植物多酚可通過抑制Wnt3a/β-catenin信號通路抑制結腸癌細胞增殖分化[29]。Joven等[30]發現植物多酚可以調節肝臟中miRNA-103的表達量，而miRNA-103具有通過靶向抑制Wnt3a的表達來緩解脂肪沉積的功能[26]，因此植物多酚對脂肪形成的抑制作用可能與Wnt有關[31]。在本研究中，GSPE下調了WAT中Wnt3a及β-catenin的含量，這意味著GSPE可能通過抑制Wnt3a與LRP的結合，進而抑制Wnt3a/β-catenin信號通路而破壞大鼠脂肪細胞的增殖分化。由此可見，GSPE可能通過抑制Wnt3a/β-catenin信號通路來抑制大鼠脂肪細胞的增殖和分化。

4 結 論

GSPE能夠緩解肥胖大鼠脂肪肝、高血脂，抑制肥胖大鼠脂肪沉積，并對其他器官重量無顯著影響。Wnt3a/β-catenin信號通路可能參與了GSPE對肥胖大鼠脂肪形成的抑制作用。