基于網絡藥理學的補陽還五湯治療阿爾茲海默癥的作用機制研究

薛慧 安麗鳳 曲巖 陳巧云 楊柳 崔劭瑜 沃佳美雪 張麗宏 劉斌

摘要 目的：運用網絡藥理學的研究方法，初步探討補陽還五湯治療阿爾茲海默癥（AD）的作用機制。方法：借助中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）、OMIM、DrugBank、TTD數據庫檢索和收集AD的相關靶點;利用TCMSP和TCM@TAIWAN數據庫檢索和篩選補陽還五湯組方藥物的活性成分，并通過PharmMapper服務器預測化合物潛在作用靶點;通過與收集的AD靶點比對獲得活性成分作用的AD靶點，并利用STRING數據庫和Cytoscape軟件構建和分析AD靶點的PPI網絡圖和“組方藥物-活性成分-AD靶點”網絡圖;分別通過DAVID系統、KOBAS 3.0數據庫對AD靶點進行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。結果：從補陽還五湯中篩選出92個活性成分，其中來自赤芍的芍藥內酯苷、4-乙基芍藥苷、4-氧-甲基-芍藥苷可能是重要的多效活性成分;活性成分經靶點預測和比對后確定33個抗AD靶點，其中CASP3、MAPK14、BCHE、BACE1可能是抗AD的關鍵靶點。活性成分通過作用上述AD靶點調控MAPK、PI3K/AKT、Rap1、Ras等信號通路，影響蛋白水解、蛋白磷酸化、雌激素應答等生物過程，抑制Aβ的生成，降低神經元炎癥反應和神經細胞凋亡，減弱膽堿酯酶活性，進而達到治療AD的目的。結論：通過網絡藥理學方法研究補陽還五湯治療AD的活性成分和作用機制，揭示了補陽還五湯在治療AD方面具有多成分、多靶點、多途徑的優點，為補陽還五湯的后期實驗提供新思路。

關鍵詞 補陽還五湯;阿爾茲海默癥;網絡藥理學;活性成分;靶點;通路

Abstract Objective：To explore the mechanism of Buyang Huanwu Decoction in the treatment of Alzheimer′s Disease（AD） with the method of network pharmacology.Methods：We retrieved and collected AD targets with the help of TCMSP，OMIM，DrugBank and TTD databases.Searched and screened the active compounds in Buyang Huanwu Decoction through the TCMSP and TCM@TAIWAN databases，and predicted potential targets of compounds through the PharmMapper server.Obtained the AD targets that interact with Buyang Huanwu Decoction by comparing with the collected AD targets.Constructing and analyzing the protein-protein interaction network of targets of Buyang Huanwu Decoction against AD and the network of “herbs-active compounds-AD targets” with STRING database and Cytoscape software separately.GO functional annotation and KEGG pathway enrichment analysis were performed on AD targets through DAVID system and KOBAS 3.0 database.Results：A total of 92 active compounds were screened from Buyang Huanwu Decoction，among which paeoniflorin，4-ethylpaeoniflorin and 4-O-methyl-paeoniflorin from the Radix Paeoniae Rubra may be the important multiple activity ingredients.After targets prediction and comparison，33 AD targets were determined，among which CASP3，MAPK14，BCHE and BACE1 may be the key targets of Buyang Huanwu Decoction against AD.The AD targets were affected by active components to regulate proteolysis，protein phosphorylation，estrogen response and other biological processes，to inhibit the production of Aβ，decrease neuronal inflammation and apoptosis of nerve cells，and reduce the activity of cholinesterase by participating in MAPK，PI3K/AKT，Rap1，Ras and other signaling pathways，to achieve the purpose of treating AD.Conclusion：Research on the active ingredients and mechanism of Buyang Huanwu Decoction in the treatment of AD through network pharmacology methods，revealing that Buyang Huanwu Decoction has the advantages of multiple components，multiple targets and multiple pathways in the treatment of AD，which provides a new idea for the later experiment of Buyang Huanwu Decoction.

Keywords Buyang Huanwu Decoction; Alzheimer′s disease; Network pharmacology; Active components; Targets; Pathway

中圖分類號：R285文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.11.009

阿爾茲海默病（Alzheimer Disease，AD）是一種記憶能力逐漸衰退的中樞神經系統退行性疾病，發病過程復雜，受多因素共同作用、相互影響、綜合調控，具體病機尚未明確[1]。目前AD的臨床治療多以Tacrine、Memantine及Donepezil等西藥為主，由于作用靶點單一，易產生耐藥性和不良反應，治療效果并不理想。

補陽還五湯出自清代名醫王清任的《醫林改錯》，由生黃芪、當歸尾、赤芍、川芎、地龍、桃仁、紅花組成，兼具補氣、活血、通絡之功效，現代臨床醫學主要用于腦血管類疾病[2]。目前，越來越多的基礎研究和臨床研究發現補陽還五湯可有效提高學習記憶能力，改善認知行為功能[3-8]。但補陽還五湯藥效物質組成復雜，其抗AD的潛在作用靶點及途徑仍需深入挖掘，并進一步證明其藥理作用機制。

網絡藥理學是基于系統生物學理論建立起來的藥物研發新模式。通過借助各類生物信息數據庫，建立“疾病-基因-靶點-藥物”相互作用網絡，采用專業軟件和算法分析，從整體角度探究藥物與疾病的關系。其整體性、系統性的特點為揭示中藥復雜藥效成分協同作用機制提供了新策略[9]。因此本研究以補陽還五湯中具有抗AD作用的活性成分為研究對象，應用網絡藥理學的優勢建立研究方法，通過構建“組方藥物-活性成分-靶點-通路”之間的關系，探究該方多成分、多靶點、多途徑治療AD的作用機制，為補陽還五湯的后續研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所使用的數據庫及平臺信息如下：中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），在線人類孟德爾遺傳數據庫（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，https：//www.omim.org），DrugBank數據庫（http：//www.drugbank.ca/），治療靶標數據庫（Therapeutic Target Database，TTD，https：//db.idrblab.org/ttd/），中醫藥資料庫@Taiwan（Traditional Chinese Medicine Database@Taiwan，TCM@TAIWAN，http：//tcm.cmu.edu.tw/zh-tw/review.php），UniProt數據庫（http：//www.uniprot.org），SwissADME平臺（http：//www.swissadme.ch/index.php#top），PharmMapper服務器（http：//lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/index.php），STRING在線數據庫（http：//string-db.org/），DAVID生物分子功能注釋系統（The Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery，DAVID，https：//david.ncifcrf.gov/summary.jsp），KOBAS 3.0數據庫（http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/index.php）。

1.2 AD相關靶點的收集

分別登陸TCMSP、OMIM、DrugBank、TTD數據庫，以“Alzheimer Disease”為關鍵詞篩選和收集AD相關靶點。利用UniProt數據庫的UniProtKB功能將收集到的靶點校正為官方名稱（Official GeneSymbol）。

1.3 補陽還五湯活性成分篩選

利用TCMSP數據庫分別對補陽還五湯中的黃芪、當歸、赤芍、川芎、桃仁、紅花6味藥材進行化學成分檢索，并以口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18作為活性成分的篩選條件。另外借助TCM@TAIWAN數據庫檢索地龍化學成分，并利用SwissADME進行藥物動力學分析。對于符合篩選條件的化合物通過上述數據庫下載其*.mol格式分子結構式。

1.4 補陽還五湯活性成分抗AD作用靶點的預測

登陸PharmMapper服務器，上傳活性成分*.mol文件，設置返回靶點數為100，提交進行反向靶點預測。將預測靶點與1.2篩選出的AD靶點進行比對取交集，進而得到補陽還五湯活性成分抗AD作用靶點。

1.5 構建補陽還五湯抗AD作用靶點的蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡圖

通過STRING在線數據庫對1.4補陽還五湯抗AD作用靶點進行PPI網絡的構建和分析。

1.6 構建補陽還五湯“組方藥物-活性成分-AD靶點”網絡圖

應用網絡可視化軟件Cytoscape 3.7.1中的Merge功能，將1.3補陽還五湯“組方藥物-活性成分”和1.4“活性成分-AD靶點”預測結果合并，構建“組方藥物-活性成分-AD靶點”網絡圖，并通過軟件的network analysis功能計算網絡參數，分析相互關系。

1.7 靶點功能及通路注釋分析

分別登陸DAVID平臺和KOBAS 3.0數據庫，對1.4獲取的AD靶點進行基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析（選擇BP、CC、MF）及京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。

2 結果

2.1 AD相關靶點篩選結果

通過檢索OMIM、TCMSP、TTD和DrugBank 4個數據庫，分別獲得134、30、30和6個AD靶點。將所有靶點進行匯總，最終整理出140個非重復AD靶點。

2.2 補陽還五湯活性成分和抗AD作用靶點篩選結果

通過TCMSP檢索的6味組方藥物中符合篩選條件的化合物數量分別為：黃芪20個、當歸2個、赤芍29個、川芎7個、桃仁23個、紅花22個。利用TCM@TAIWAN檢索出的地龍化學成分Xanthinin其ADME預測結果為：Lipinski′s Rule：Suitable，Lead like Rule：Suitable，CMC-like rule：Qualified，MDDR-like Rule：Midstructure，WDI-like Rule：In 90% Cutoff，Human Intestinal Absorption（HIA，%）：96.91，可作為候選化合物。將所有活性成分匯總去重后最終得到92個，其中90個活性成分通過PharmMapper數據庫成功預測出潛在作用靶點，靶點涉及373個種類，與收集的AD靶點比對后確定其中33種為AD靶點。補陽還五湯活性成分個數及抗AD作用靶點。見表1。

2.3 補陽還五湯抗AD作用靶點的PPI網絡圖解析

通過STRING在線數據庫構建的補陽還五湯抗AD作用靶點的PPI網絡圖。見圖1。33個靶點中有28個相互連接，形成62種相互作用關系。其中與細胞凋亡密切相關的CASP3靶點最為活躍，可能是補陽還五湯防治AD的潛在核心靶點。

2.4 補陽還五湯“組方藥物-活性成分-AD靶點”網絡圖解析

可視化構建的補陽還五湯“組方藥物-活性成分-AD靶點”網絡圖包含130個節點（Node），即7個組方藥物，90個活性成分和33個AD靶點。見圖2。組方藥物與活性成分間有102條邊（Edge），藥物的平均節點分支數（Average Number of Neighbors）為14。活性成分與AD靶點間有1 087條邊，二者的平均節點分支數分別為12和32。化合物中來自赤芍的芍藥內酯苷（MOL007004）、4-乙基芍藥苷（MOL007008）、4-氧-甲基-芍藥苷（MOL007012）度值（degree）最高為16，它們可能是補陽還五湯重要的多效活性成分。AD靶點中MAPK14、BCHE、

BACE1度值位列前三，分別為87、79、77，它們可能是補陽還五湯抗AD的關鍵靶點。該結果表明補陽還五湯化學成分復雜，同一化合物可作用多個AD靶點，而同一個AD靶點又會受到多個化合物影響。

2.5 靶點GO富集分析及KEGG通路富集分析結果

通過DAVID系統對補陽還五湯作用的33個AD靶點進行GO功能注釋，共得到102個反饋條目。根據P值（P<0.01）確定41個GO功能注釋結果。其中生物學過程有24個，涵蓋蛋白水解、蛋白磷酸化、雌激素應答、缺氧應答等方面;分子功能結果有9個，主要包括各類酪氨酸激酶活性、內肽酶活性、酶結合等活性;細胞組成結果有8個，包括胞外、膜筏、細胞外泌體、細胞表面等。見圖3。

經KEGG富集分析后共得到137條信號途徑，取P值最小的前20個條目（P<0.01）進行繪圖分析。見圖4。其中包含1條AD通路;5條細胞信號通路（MAPK信號通路、PI3K/AKT信號通路、Rap1信號通路、Ras信號通路、催乳素信號通路）;5條生物系統相關功能通路（EGFR酪氨酸激酶抑制劑抗性、溶酶體、多巴胺能神經突觸、黏著連接、補體和凝血級聯）;5條癌癥通路（癌癥通路、癌癥蛋白聚糖、癌癥轉錄調控失調、癌癥中心碳代謝、胃癌）、4條其他疾病通路（可卡因成癮、肌萎縮型脊髓側索硬化癥、幽門螺桿菌感染中的上皮細胞信號轉導、百日咳）。

3 討論

AD是以進行性記憶力衰退、認知行為障礙及其他精神癥狀為臨床表現的神經退行性疾病，病理特點為腦皮質萎縮、神經元丟失、老年斑、神經元纖維纏結[1]。現代醫學對AD的病機尚無統一認識，涉及膽堿能缺失、Aβ沉積、Tau蛋白過度磷酸化、氧化應激和自由基損傷等諸多學說[1]。長期以來臨床治療AD多以干預單一靶點的西藥為主，但收效欠佳。因此探尋AD發病機制、研發抗AD安全有效藥物成為全球醫藥領域面臨的重要挑戰。中醫學認為AD屬于“呆病、健忘、虛勞、善忘”等范疇，利用中藥復方多成分、多靶點、多通路綜合調控的優勢，辨證與辨病相結合，在防治AD方面有潛在應用價值。

補陽還五湯為氣虛血瘀病癥的代表方，由生黃芪、當歸尾、赤芍、川芎、地龍、桃仁、紅花七味藥組成。黃芪補氣，當歸尾活血，其他藥物輔以化瘀、通絡的作用[2]。黃芪作為君藥已在現代藥理學研究中證實了其在治療AD方面的潛在價值[10-12]。本研究通過網絡藥理學的方法篩選出的黃芪活性成分也被證實具有抗AD的作用。如槲皮素（MOL000098）、刺芒柄花素（MOL000392）和毛蕊異黃酮（MOL000417）可以抑制Aβ產生，增加細胞內谷胱甘肽濃度，降低活性氧（ROS）水平，抑制炎癥反應和氧化應激誘導的神經細胞凋亡，保護神經細胞，增加細胞活力，進而改善認知功能，提供學習記憶力[13-15]。當歸作為臣藥，雖然本次只篩選出β-谷固醇（MOL000358）、豆甾醇（MOL000449）2個生物堿類化合物，但二者均可通過作用于膜筏來調控AD過程。β-谷固醇可保持膜膽固醇穩態，阻止高膽固醇誘導的Aβ釋放;增強對氧化應激和脂質過氧化的抵抗力[16]。豆甾醇可降低β-分泌酶的活性，并防止其內化到胞吞區室參與β-淀粉樣蛋白前體蛋白（APP）分解;減少與APP裂解相關的脂筏中膽固醇和早老素的分布[17]。上述2種活性成分同樣存在于赤芍中。赤芍也是補陽還五湯中活性成分最多的組方藥物，其中芍藥內酯苷、乙基芍藥苷、4-氧-甲基-芍藥苷具有多效活性。如芍藥內酯苷可降低Aβ引起的毒性作用和ROS水平，維持細胞內Ca2+水平[18];當與芍藥苷配伍后可以防止神經元損傷和小膠質細胞異常激活，提高AD小鼠學習記憶功能[19]。此外，川芎、地龍、桃仁、紅花也可通過抗炎、抗凝血、抗氧化、調節細胞內外鈣離子等功能發揮抗AD的作用[20-23]。因此，七味中藥相互配伍構成的補陽還五湯復雜藥物體系，為該方多靶點、多途徑治療AD提供了物質基礎。

本研究運用網絡藥理學方法從分子層面對補陽還五湯的92個活性成分進行靶點預測和分析，確定33個AD治療靶點，篩選出CASP3、MAPK14、BCHE、BACE1可能是補陽還五湯防治AD的潛在核心靶點。CASP3即Caspase-3來自半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶（Cysteine-Containing Aspartate-Specific Proteases，Casepse）家族，激活其活性，可觸發下游的凋亡級聯反應，使細胞發生不可逆轉地凋亡[24]。在AD病程中，Caspases-3通過直接切割APP生成Aβ;特異性調節Tau磷酸化;選擇性切割早老素蛋白，促進APP裂解產生更多Aβ，導致神經元細胞的凋亡[25]。MAPK14屬于絲裂原激活的蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinases，MAPKs）家族，通過介導細胞內信號轉導調控多種細胞活動，如細胞增殖、分化、凋亡和轉化。MAPK信號通路在受到細胞內外信號分子刺激時被激活，通過調節神經元凋亡、β-和γ-分泌酶活性以及APP和Tau蛋白的磷酸化來促進AD的發病[26]。BCHE即丁酰膽堿酯酶（Butyrylcholinesterase）通過水解乙酰膽堿參與膽堿能神經傳遞。在AD病理過程中，基底前腦區的膽堿能神經元缺失，乙酰膽堿轉移酶和膽堿酯酶活力減弱，乙酰膽堿（ACh）的生成、釋放和攝取降低，致使學習能力和記憶功能減退[1]。BACE1即β分泌酶（Beta-secretase 1），其作用是切割APP形成Aβ的N端，以啟動Aβ生成，而抑制其活性可從根本上減少Aβ的產生[27]。因此，補陽還五湯通過調控CASP3、MAPK14、BCHE、BACE1等AD靶點，減少Aβ的生成，降低神經元炎癥反應，抑制神經細胞凋亡，下調膽堿酯酶活性來治療AD，該結果與目前補陽還五湯治療AD的相關研究結果一致[2]。

補陽還五湯作用的AD靶點經GO富集分析后，明確這些靶點主要分布在胞外、膜筏、細胞表面等部位，具有酪氨酸激酶、內肽酶活性，與蛋白水解、蛋白磷酸化、雌激素應答和缺氧應答等生物過程密切相關。分布于大腦皮質、海馬、杏仁核和下丘腦中的雌激素受體，與突觸可塑性、學習記憶、認知和神經保護密切相關[28-29]。來自中藥的活性成分如毛蕊異黃酮、刺芒柄花素作為雌激素的替代物通過作用于雌激素受體發揮抗AD的作用[13-15]。AD病變過程中ROS表達逐漸升高，導致蛋白質被氧化修飾、多肽鏈折疊異常、DNA突變、糖類被氧化修飾等，促使Aβ和Tau蛋白積聚、神經元細胞凋亡、神經組織受損[1]。而具有抗氧化活性的物質如槲皮素、芍藥苷內酯可通過降低ROS水平，防止神經元受損[13，18]。

在KEGG生物途徑富集分析中，MAPK、Rap1、PI3K/AKT、Ras、催乳素信號通路被顯著富集，其中MAPK信號通路顯著度最高。而ERK、JNK/SAPK及p38MAPK是哺乳類細胞中并行的3條MAPKs信號通路[30]。補陽還五湯可通過調控p38MAPK/NF-κB通路抑制AD小鼠腦組織炎癥反應，減少神經細胞凋亡[4];還可調節內皮細胞p38MAPK、ERK1/2通路，減少細胞骨架的變化，阻止細胞通透性變大，防止內皮細胞損傷[31]。此外諸多用于治療AD的中藥方劑如地黃飲子、補益脾胃元氣方藥也被證實與MAPK信號通路有關[32-33]。PI3K/AKT信號通路也可通過經調節下游靶點，來有效抑制神經元細胞的凋亡，發揮腦保護作用。有研究表明，遠志散和益智治呆方通過調控PI3K/AKT/GSK-3β信號途徑，抑制Aβ引起的Tau蛋白磷酸化表達，弱化Aβ神經毒性，阻止神經元細胞凋亡，改善AD大鼠學習記憶能力[34-35]。補陽還五湯中的活性物質如阿魏酸、藁本內酯和芍藥苷還可通過PI3K/AKT信號通路下調炎癥介質的表達，保護神經細胞以治療AD[36-38]。

我們利用網絡藥理學的方法研究補陽還五湯治療AD的多成分、多靶點、多途徑的作用機制。發現補陽還五湯活性成分復雜，通過作用相應靶點來調控蛋白水解、蛋白磷酸化、雌激素應答、缺氧應答等生物過程，抑制Aβ的生成，降低神經元炎癥反應和神經細胞凋亡，減弱膽堿酯酶活性，進而達到治療AD患者的目的。其作用機制可能與MAPK、PI3K/AKT、Rap1、Ras信號通路有關。由于網絡藥理學本身的局限性，不能對補陽還五湯所有成分、作用靶點及通路進行更全面的分析，今后需要結合體內體外實驗進行更深入的挖掘以及驗證。

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（2020-10-30收稿 責任編輯：魏慶雙，徐穎）