特殊醫(yī)學(xué)用途嬰幼兒配方食品中3-氯丙醇酯及縮水甘油酯的測定

趙麗敏，黃云霞，孟志娟，牛立沙，張亞麗，王 藤，邸鵬月，張冬生，孫文毅

（河北省食品檢驗(yàn)研究院，河北省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050200）

氯丙醇脂肪酸酯是近幾年食品安全檢測的重要關(guān)注對象，其中3-氯丙醇酯（3-chloropropanol esters，3-MCPDE）的污染情況和檢出率尤為突出[1]。當(dāng)3-MCPDE被攝入體內(nèi)會分解為3-氯-1,2-丙二醇（3-chloro-1,2-propanediol，3-MCPD），3-MCPD具有致癌、遺傳毒性等危害[2-3]。縮水甘油酯（glycidol esters，GE）是縮水甘油和游離脂肪酸的酯化產(chǎn)物，主要存在于棕櫚油及嬰兒配方乳粉等食品中。GE的代謝產(chǎn)物縮水甘油具有基因危害[4]。3-MCPD和GE分別被國際癌癥組織歸為2B級和2A級致癌物[5-6]。

3-MCPDE污染主要來自食用植物油，其中棕櫚油含量相對較高，由于棕櫚油等精煉植物油在嬰幼兒配方乳粉中的廣泛使用，導(dǎo)致嬰幼兒配方乳粉和特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒食品也存在一定程度的3-MCPDE和GE污染[7-9]。特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品指針對1 歲以下患有特殊紊亂、疾病或醫(yī)療狀況等特殊醫(yī)學(xué)狀況嬰兒的營養(yǎng)需求而設(shè)計(jì)制成的粉狀或液態(tài)配方食品。

歐盟委員會（EU）2018/290法規(guī)修訂歐盟委員會實(shí)施條例（EU）No 1881/2006，規(guī)定從2019年7月1日起，嬰幼兒配方乳粉、較大嬰兒配方乳粉和嬰幼兒特殊醫(yī)用食品（粉狀）中GE的最高限量從75 μg/kg改為50 μg/kg。2021年，國家食品安全抽檢新增了嬰幼兒特殊醫(yī)學(xué)用途食品（粉狀）和食用油中GE的檢測。特殊醫(yī)學(xué)用途嬰幼兒配方食品是非母乳喂養(yǎng)嬰兒的主要營養(yǎng)素?cái)z入來源，因此建立特殊醫(yī)學(xué)用途嬰幼兒配方食品（粉狀）中3-MCPDE和GE的檢測方法對于開展風(fēng)險(xiǎn)評估及標(biāo)準(zhǔn)制定具有重要意義。

目前有關(guān)特殊醫(yī)學(xué)用途嬰幼兒配方食品中3-MCPDE和GE同時(shí)測定的間接檢測方法較少，本研究以特殊醫(yī)學(xué)用途嬰幼兒配方食品為研究對象，建立一種同時(shí)測定3-MCPDE和GE含量的間接檢測法，針對樣品提取、酯交換水解2 個樣品前處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)合同位素稀釋技術(shù)，提高檢測方法的準(zhǔn)確度和精密度，為特殊醫(yī)學(xué)用途嬰幼兒配方食品中3-MCPDE和GE檢測方法的完善、相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定及限量提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3 種特殊醫(yī)學(xué)用途嬰幼兒配方食品，分別為乳蛋白深度水解配方、氨基酸配方和乳蛋白部分水解配方。

甲醇、丙酮、冰乙酸、乙酸乙酯、正己烷、異辛烷、叔丁基甲醚（均為色譜純） 美國Supelco公司；甲醇鈉（分析純） 上海麥克林生化試劑有限公司；無水硫酸鈉（分析純） 天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；氯化鈉（分析純） 天津大茂化學(xué)試劑公司；苯基硼酸（phenylboronic acid，PBA）（分析純） 美國Alfa Aesar公司；3-MCPD棕櫚酸雙酯、棕櫚酸GE（質(zhì)量濃度1 000 μg/mL）、d5-3-MCPD棕櫚酸單酯（純度均大于98%） 加拿大多倫多TRC公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TQ8040氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀、Rtx-5MS石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 日本島津公司；3K15高速冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司；N-EVAP-24氮吹儀美國Organomation公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取適量3-MCPD棕櫚酸雙酯和d5-3-MCPD棕櫚酸單酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（精確到0.001 g），用叔丁基甲醚-乙酸乙酯溶液（8∶2，V/V）溶解并定容至10 mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度分別為1 000 μg/mL和100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

分別準(zhǔn)確吸取5.314 mL 3-MCPD棕櫚酸雙酯和2.827 mL GE標(biāo)準(zhǔn)儲備液于100 mL容量瓶中，用叔丁基甲醚-乙酸乙酯溶液（8∶2，V/V）定容至刻度，分別配制成質(zhì)量濃度為10.0 μg/mL（均以對應(yīng)的氯丙醇計(jì)）的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，4 ℃貯存。

準(zhǔn)確吸取3.202 mL d5-3-MCPDE于10 mL容量瓶中，用叔丁基甲醚-乙酸乙酯溶液（8∶2，V/V）定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為10.0 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液（以對應(yīng)的氯丙醇計(jì)），于4 ℃貯存。

用適量的叔丁基甲醚-乙酸乙酯溶液（8∶2，V/V）將各標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋（每個標(biāo)準(zhǔn)品需要2 份，作為A、B組）配制成質(zhì)量濃度分別為0.005、0.050、0.200、0.500、1.000、2.000 μg/mL的混合系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，其中內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為1.00 μg/mL。

1.3.2 樣品前處理

稱取2.0 g樣品于50 mL離心管中（每個樣品需制備A、B對照組），加入2 mL 65 ℃溫水混勻，加入50 μL d5-3-MCPDE標(biāo)準(zhǔn)工作液；混勻后加入5 mL叔丁基甲醚-乙酸乙酯混合溶液（8∶2，V/V），超聲20 min，9 500 r/min離心5 min，收集上清液；重復(fù)提取2 次并將上清液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，45 ℃氮吹至體積約為2 mL；加入0.5 mL 0.5 mol/L甲醇鈉-甲醇溶液，混勻并反應(yīng)5 min后，向A、B組分別加入3 mL含體積分?jǐn)?shù)4%乙酸的20 g/100 mL NaCl溶液、3 mL含體積分?jǐn)?shù)4%乙酸的20 g/100 mL Na2SO4溶液，終止水解反應(yīng)；充分渦旋后再加入3 mL正己烷進(jìn)行脫脂，待分層后，棄去上清液，重復(fù)脫脂2 次；待測液中加入200 μL PBA，充分振蕩；70 ℃衍生20 min后，加入5 mL乙酸乙酯提取2 次；45 ℃下氮吹至干，用1 mL異辛烷復(fù)溶，過有機(jī)膜，待分析。

將系列標(biāo)準(zhǔn)混合工作液與2 mL乳粉上清液同時(shí)進(jìn)行水解、衍生化反應(yīng)。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)條件

色譜條件：載氣：高純氦氣（純度99.999%）；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度280 ℃；升溫程序：85 ℃保持1 min，以6 ℃/min速率升溫至150 ℃，再以12 ℃/min速率升溫至180 ℃，最后以25 ℃/min升溫至290 ℃，保持7 min；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量1 μL。

質(zhì)譜條件：電離源：電子轟擊離子源；電離電壓70 eV；離子源溫度280 ℃；傳輸線溫度280 ℃；碰撞氣：高純氦氣（純度99.999%）；溶劑延遲時(shí)間4 min；采用選擇離子掃描方式。

3-MCPD衍生化合物質(zhì)譜測定條件：m/z196、147*、91、146；d5-3-MCPD衍生化合物質(zhì)譜測定條件：m/z201*、150、93、149。其中帶*的為定量離子。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用TQ8040氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀GCMSsolution Version 4.30軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

樣品提取是準(zhǔn)確檢測特殊醫(yī)學(xué)用途嬰幼兒配方食品中3-MCPDE和GE的前提。本研究對比正己烷[9-10]和叔丁基甲醚-乙酸乙酯混合溶液（8∶2，V/V）[11-12]2 種提取溶劑的提取效果，分別考察3-MCPDE的回收率和提取溶液的狀態(tài)。

由表1可知，正己烷提取效果較差，3-MCPDE回收率僅34.1%，且正己烷與樣品經(jīng)超聲之后乳化嚴(yán)重，尤其是乳蛋白部分水解配方樣品乳化嚴(yán)重，提取上清液僅5 mL。叔丁基甲醚-乙酸乙酯混合溶液提取后樣品均勻，乳化不明顯，3-MCPDE回收率可達(dá)98.6%，因此，選擇叔丁基甲醚-乙酸乙酯混合溶液為提取溶劑。

表1 提取溶劑對3-MCPDE的提取效果Table 1 Extraction efficiencies of 3-MCPDE with different solvents

2.2 酯水解條件的優(yōu)化

氯丙醇酯的酯交換水解反應(yīng)液主要采用甲醇鈉-甲醇溶液[13-15]和硫酸甲醇溶液[16-17]。Miyazaki等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在含有氯離子的酸性溶液中，GE易轉(zhuǎn)化成3-MCPD，引起定量結(jié)果偏高。所以本研究用甲醇鈉-甲醇溶液作為堿水解液，并對堿水解溶液的水解時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。以3-MCPDE的回收率為指標(biāo)，考察0.5、1.0 mol/L甲醇鈉-甲醇溶液分別在水解1、3、5、7、9 min時(shí)的回收率。

由圖1可知，采用1.0 mol/L甲醇鈉-甲醇溶液時(shí)，水解液不夠均勻，有微量沉淀，并且因溶液堿性較強(qiáng)，反應(yīng)迅速，須嚴(yán)格控制反應(yīng)時(shí)間。0.5 mol/L甲醇鈉-甲醇作為堿水解液，隨水解反應(yīng)時(shí)間延長，回收率增加，水解7 min時(shí)回收率最高。胡守江[19]、黃翠莉[20]等研究發(fā)現(xiàn)，在堿性環(huán)境中，堿水解反應(yīng)時(shí)間過長會造成氯丙醇的降解，因此在保障堿水解反應(yīng)充分的前提下，應(yīng)盡量縮短堿水解反應(yīng)時(shí)間[21]。本研究選用甲醇鈉-甲醇溶液濃度為0.5 mol/L，水解時(shí)間為7 min，不僅水解效率高，而且適合日常檢驗(yàn)中多批次樣品的同時(shí)處理。

圖1 甲醇鈉-甲醇溶液濃度和水解時(shí)間對3-MCPDE回收率的影響Fig. 1 Influence of hydrolysis time on recovery of 3-MCPDE with sodium methoxide methanol solution of different concentrations as hydrolysate

2.3 水解終止液的選擇

酯交換水解過程中，氯離子存在時(shí)GE會轉(zhuǎn)化成3-MCPD[18]，不含氯離子時(shí)，GE無法轉(zhuǎn)化為3-MCPD。每個樣品做A、B組，A組在水解反應(yīng)終點(diǎn)添加含氯的終止反應(yīng)液（含體積分?jǐn)?shù)4%乙酸的20 g/100 mL NaCl溶液），B組在水解反應(yīng)終點(diǎn)添加不含氯的終止反應(yīng)液（含體積分?jǐn)?shù)4%乙酸的20 g/100 mL Na2SO4溶液），衍生化由A組測得3-MCPDE與GE的總量，由B組測得3-MCPDE的實(shí)際含量，利用差減法得到GE含量。

針對B組終止液，通過空白樣品添加了3-MCPDE，比較2 種不含氯的水解終止液（含體積分?jǐn)?shù)4%乙酸的20 g/100 mL Na2SO4溶液和含體積分?jǐn)?shù)4%乙酸的20 g/100 mL NaCl溶液）的效果，結(jié)果表明，使用含體積分?jǐn)?shù)4%乙酸的20 g/100 mL Na2SO4溶液時(shí)3-MCPD回收率較高，因此選擇含體積分?jǐn)?shù)4%乙酸的20 g/100 mL Na2SO4溶液作為水解終止液。

2.4 衍生化試劑的選擇

常用的衍生化試劑有N-七氟丁酰基咪唑（N-heptafluorobutyrylimidazole，HFBI）[22]、PBA、七氟丁酸酐（heptafluorobutyric anhydride，HFBA）、三氟乙酸酐（trifluoroacetic anhydride，TFAA）等。HFBI性質(zhì)活潑，容易揮發(fā)結(jié)塊，且容易與水反應(yīng)，衍生過程中必須保證充分干燥[23]；HFBA和TFAA性質(zhì)活潑，容易衍生，但是副產(chǎn)物復(fù)雜，影響定量結(jié)果[24]。相比之下，PBA性質(zhì)較穩(wěn)定，可在水溶液中進(jìn)行，衍生后的化合物電負(fù)性顯著增強(qiáng)，檢測靈敏度較高。因此選用PBA作為衍生化試劑。

2.5 方法的檢出限、定量限和線性范圍

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液與樣品同時(shí)進(jìn)行水解、衍生化等前處理，線性范圍為0.005～2.000 μg/mL，A、B對照組標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為y=0.868 1x＋8.154 7×10－2（R2=0.999 4）、y=0.770 6x＋0.276 9（R2=0.999 2），線性良好，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.999 0。以3 倍信噪比考察方法的檢出限，得到檢出限為5 μg/kg，10 倍信噪比考察方法的定量限，得到定量限為25 μg/kg。

2.6 方法的精密度和回收率

以3 種常見的特殊醫(yī)學(xué)用途嬰幼兒配方食品：乳蛋白深度水解配方、氨基酸配方和乳蛋白部分水解配方為基質(zhì)，分別添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使加標(biāo)水平分別為25、125、250 μg/kg，考察方法的回收率，每個添加水平做6 個平行。

由表2可知，3 種特殊醫(yī)學(xué)用途嬰幼兒配方食品中3-MCPDE和GE回收率為88.5%～104.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差低于15%。表明該方法精密度高，重復(fù)性好。

表2 3 種特殊醫(yī)學(xué)用途嬰幼兒配方食品中3-MCPDE和GE的回收率及精密度（n=6）Table 2 Recoveries and precision of 3-MCPDE and GE spiked in three types of infant formula for special medical purposes (n = 6)

3 結(jié) 論

基于改進(jìn)的樣品前處理方法，結(jié)合氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立特殊醫(yī)學(xué)用途嬰幼兒配方食品中3-MCPDE和GE的間接檢測方法。該方法操作簡單、快速、成本低、結(jié)果準(zhǔn)確，能滿足日常特殊醫(yī)學(xué)用途嬰幼兒配方食品中3-MCPDE和GE的檢測，為特殊醫(yī)學(xué)用途嬰幼兒配方食品中3-MCPDE和GE限量標(biāo)準(zhǔn)的制定及風(fēng)險(xiǎn)評估提供了參考。