環(huán)狀RNA在眼科疾病中的研究進展

束 煉，陳曉曉，孫興懷,3

0引言

環(huán)狀RNA(circular RNA, circRNA)屬于非編碼RNA家族(non-coding RNA，ncRNA)，是一類具有共價閉合的連續(xù)環(huán)結構的內源性RNA，一般認為它是通過前體RNA的反向剪接反應形成的，即內含子下游5’剪接位點以相反的順序與上游3’剪接位點連接形成環(huán)狀，并在反向剪接的外顯子之間形成3’，5’-磷酸二酯鍵[1]。近十年來全基因組檢測等深度測序技術不斷發(fā)展，RNA干擾(RNA interference，RNAi)、RNA免疫沉淀芯片(RNA immunoprecipitation chip，RIP)分析以及質粒或腺病毒轉染等功能學檢測及驗證手段愈發(fā)成熟，為研究ncRNA提供了很好的技術支持，circRNA也逐漸進入研究熱潮。circRNA的主要作用機制主要包括：(1)通過“海綿樣”吸附下游靶基因miRNA的結合位點，起競爭性內源性RNA(competitive endogenous RNA，ceRNA)的作用，從而阻止miRNA和信使RNA(messenger RNA，mRNA)之間的相互作用，間接調節(jié)下游靶基因的表達水平，這也是circRNA在目前研究中最廣泛和關鍵的作用[2]；(2)競爭性結合蛋白質并影響其活性；(3)作為蛋白質復合體的腳手架，并在親本基因轉錄中發(fā)揮調節(jié)作用等。已有研究證明，circRNA 可以參與多種生物學功能的調控，如細胞凋亡、細胞增殖、血管生成和轉移調控等，其在腫瘤性疾病、血管性疾病、炎癥性疾病以及神經系統疾病的發(fā)生發(fā)展中均發(fā)揮著重要作用[3]。

在眼科疾病中circRNA的相關研究也已陸續(xù)展開[4]，本文就circRNA在青光眼、視網膜疾病(如糖尿病性視網膜病變等)、晶狀體疾病(如年齡相關性白內障等)、眼表及眼眶疾病(如翼狀胬肉、甲狀腺相關眼病等)和葡萄膜疾病(如葡萄膜黑色素瘤)等眼科疾病中的基礎研究和臨床發(fā)現進行綜述。

1青光眼

青光眼是一種神經退行性疾病，其特征是進行性視網膜神經節(jié)細胞(retinal ganglion cells，RGCs)凋亡、視盤損傷及視功能損害，常伴隨病理性眼壓升高，發(fā)病機制較為復雜。Wang等[5]發(fā)現在慢性高眼壓誘導的青光眼小鼠模型的視網膜以及原發(fā)性開角型青光眼患者的房水中均可檢測到cZRANB1表達的顯著上升。進一步的實驗證實cZRANB1可充當miRNA海綿，通過cZRANB1/miR-217/RUNX2調控網絡直接調控視網膜神經膠質細胞—Müller細胞功能，從而間接調控RGCs功能。由此顯示cZRANB1可通過調節(jié)視網膜反應性神經膠質活化和影響RGCs的活性，進而參與青光眼引起的視網膜神經退行性改變。該團隊還發(fā)現cZNF609也具有相似的作用機制[6]，由此提出對這些circRNA進行表達干預可能成為治療青光眼引起的視神經退行性改變的有效策略。

2視網膜疾病

2.1缺血性視網膜病變缺血性視網膜病變的基本病理特征是血管閉塞伴隨視網膜新生血管生成，代表性疾病如早產兒視網膜病變(retinopathy of prematurity，ROP)和糖尿病性視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)等。

已有多項研究表明，與無眼底病變的糖尿病患者相比，circRNA在DR患者的血清或玻璃體液中存在差異表達[7-9]，并且可能參與調控血管內皮細胞、周細胞、視網膜色素上皮細胞等多種細胞的生物學功能。Zhang等[10]研究發(fā)現，Circ_0005015(CircBase ID：cHAS2)在DR患者的血漿、玻璃體液和血管纖維膜中表達上調。功能學實驗證明，Circ_0005015可充當miR-519d-3p海綿，導致基質金屬蛋白酶(MMP-2)等基因表達增加，進而調節(jié)內皮細胞的增殖、遷移和成管來促進視網膜新生血管生成，進而誘導DR的產生。在Zhu等[11]和Liu等[12]的研究中,circDNMT3B/miR-20b-5p及cZNF609/miR-615-5p/MEF2A網絡也同樣可調控視網膜內皮細胞功能改變和血管生成進而參與DR的形成。Jiang等[9]研究發(fā)現，cZNF532可通過充當miR-29a-3p海綿并誘導賴氨酰氧化酶樣蛋白2(LOXL2)和細胞周期蛋白依賴性激酶5(CDK5)等基因表達來調節(jié)周細胞生物功能，參與調控DR中的視網膜周細胞變性和血管功能障礙。而Sun等[13]的研究顯示，hsa_circ_0041795(CircBase ID：cC17)在視網膜色素上皮細胞中表達明顯上調，該circRNA對下游炎癥相關因子(如TNF-α，IL-1β和IL-6等)的表達調控可能在DR中發(fā)揮重要作用。

Zhou等[14]在高氧誘導的視網膜病變鼠模型中鑒定出共236種差異表達的circRNA和14種差異表達的miRNA，同時通過逆轉錄-定量PCR驗證了其中9個差異表達的circRNA，為ROP發(fā)生機制的研究提供了方向指導。

2.2年齡相關性黃斑變性年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration，ARMD)是發(fā)達國家老年人致盲的主要原因[15]，脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)是其重要的病理表現和突出特征。CNV可導致視網膜水腫、滲出、出血和視網膜功能障礙，直接導致視力下降[16]，但CNV的形成機制認識尚未完全統一。在Liu等[17]的研究 中，CNV小鼠模型的視網膜色素上皮細胞-脈絡膜-鞏膜復合物中的100個circRNA與對照組相比有顯著改變。另有研究表明激光誘導的CNV小鼠的脈絡膜和內皮細胞中的cZBTB44在缺氧應激時明顯上調[18]，后續(xù)實驗證實cZBTB44與其靶點miR-578相互作用，調控下游血管內皮生長因子VEGFA/VCAM1基因的表達，影響血管內皮細胞的增殖并參與CNV的發(fā)生發(fā)展，而在ARMD患者的房水中檢測到cZBTB44表達的顯著上調也印證了這一機制。該研究提示cZBTB44調控網絡是參與CNV相關的ARMD形成的潛在發(fā)病機制。

2.3增殖性玻璃體視網膜病變增殖性玻璃體視網膜病變(proliferative vitreoretinopathy，PVR)是指在孔源性視網膜脫離或視網膜復位手術后，由于視網膜色素上皮細胞及神經膠質細胞的增生和收縮又造成視網膜脫離的病變[19]，可能與細胞和膜的遷移增殖、胞外膠原蛋白生成以及視網膜前膜(epiretinal membrane，ERM)形成有關[20]。Yao等[21]鑒定出91個在PVR患者的ERM中差異表達的circRNA，其中上調最為顯著的circ_0043144(CircBase ID：cCCL3)在PVR-ERM患者的玻璃體樣本和血清樣本中檢測出了同等變化。隨后功能實驗測定表明，circ_0043144通過調控下游趨化因子CCL2、CXCL8和內皮生長因子VEGFA等基因表達從而調控視網膜色素上皮細胞的增殖，遷移和分泌能力，顯示出circ_0043144參與PVR形成的可能機制，但該研究未對中間調控介質miRNA相關靶點作進一步探究。

2.4視網膜母細胞瘤視網膜母細胞瘤(retinoblastoma，RB)是最常見的兒童眼內惡性腫瘤[22]，發(fā)病機制復雜，涉及染色質結構變異、蛋白質磷酸化和細胞周期調節(jié)等多種機制[23-24]。有研究報道，與正常視網膜相比RB組織樣本中circRNA的豐度和表達均顯著降低，進一步的生物信息學分析顯示這些差異表達的circRNA其宿主基因主要參與染色質修飾和磷酸化[25]。其中circ_0093996(CircBase ID：cTET1)/miR-183/PDCD4調控網絡可能參與RB的形成。還有報道顯示circ_0000527(CircBase ID：cFAM158A)可通過發(fā)揮海綿作用，吸附miR-646從而間接調節(jié)BCL-2蛋白基因來促進RB的增殖、侵襲和轉移[26]。Xing等[27]研究發(fā)現，RB組織和細胞中的circRNA的下調表達程度與RB患者的腫瘤大小及晚期(國際眼內視網膜母細胞瘤分級，international intraocular retinoblastoma classification，IIRC)分級有關，其中hsa_circ_0001649可以作為RB患者整體生存的獨立預后指標。Zhao等[28]研究發(fā)現，circ-0075804(CircBase ID：cE2F2)可以通過與HNRNPK結合來提高E2F3的穩(wěn)定性來促進RB的增殖。這些研究都顯示出circRNA可能通過各種復雜機制實現參與RB的發(fā)生發(fā)展。

3眼表及眼眶疾病

3.1角膜新生血管角膜本身無血管，但許多免疫性、創(chuàng)傷性或感染性的眼表疾病均可導致角膜新生血管形成。角膜新生血管可使角膜透明性降低，使視力下降甚至失明，但其形成機制尚未完全了解。Zhou 等[29]經研究發(fā)現，在小鼠誘導角膜新生血管模型中無血管角膜和血管化角膜間存在229個差異表達的circRNA。同時在存在血管化的人角膜中cZFP609的直系同源物顯著增加，而其下游cKifap3基因可以提升角膜內皮細胞的增殖、遷移和成管能力，提示circRNA-cKifap3可作為治療角膜新生血管的靶點。

3.2結膜黑色素瘤結膜黑色素瘤是一種罕見的高度惡性的眼部腫瘤，其發(fā)生發(fā)展機制仍不清楚。Shang等[30]發(fā)現，相較于臨近正常組織，結膜黑色素瘤組織中可鑒定出9300種差異circRNA，其中circMTUS1在結膜黑色素瘤中表達明顯上調。后續(xù)研究提示circMTUS1可能通過海綿樣吸附miR-622和miR-1208調節(jié)ErbB、MAPK等信號通路以發(fā)揮原癌基因的作用，促進結膜黑色素瘤的發(fā)展。因此提出circMTUS1可能是結膜黑色素瘤的新型生物標志物。

3.3翼狀胬肉翼狀胬肉是結膜的慢性炎癥性病變，是一種常見的眼表疾病，可能與異常細胞增殖、傷口愈合缺陷、基質異常重塑、血管生成和氧化應激等機制有關[31]。Li等[32]發(fā)現和正常結膜組織進行配對分析時翼狀胬肉組織中約有669個circRNA異常表達，其中circ_0085020(CircBase ID：cLAPTM4B)上調最為明顯。實驗證明對circ_0085020的沉默抑制了成纖維細胞和上皮細胞的增殖和遷移能力，同時促進了紫外線輻射誘導的翼狀胬肉成纖維細胞和上皮細胞的凋亡。進一步的生物信息學分析發(fā)現circ_0085020介導的調控網絡大部分集中在黏著斑信號通路中，由此推測胞質內circRNA介導的調控網絡可能通過調節(jié)細胞外基質重塑，進而調控翼狀胬肉的形成。

3.4甲狀腺相關眼病甲狀腺相關眼病(thyroid-associated ophthalmopathy，TAO)是Graves病患者的眼部表現，其眼外肌和眼眶脂肪或結締組織中可發(fā)現淋巴細胞的浸潤。TAO被認為是一種自身免疫性疾病，但其發(fā)病機制未被完全揭示。Wu等[33]在其研究中發(fā)現，與對照組的眼眶脂肪和結締組織相比，TAO患者差異表達了163個circRNA。其中circ_14940(CircBase ID：cEYA1)，circ_10135及circ_14936可能通過影響脂肪形成以及B細胞免疫激活等方式參與TAO的形成。

4晶狀體疾病

4.1年齡相關性白內障晶狀體蛋白質變性并發(fā)生混濁稱為白內障，以老年人居多。其特征是不溶性晶狀體蛋白的積累、細胞凋亡增加和晶狀體上皮細胞增殖分化改變等[34-35]，已成為現今非創(chuàng)傷性視力損害和失明第一大原因[35]。Liu等[36]通過RNA測序技術在人正常透明晶狀體囊和年齡相關性白內障晶狀體囊中鑒定出差異表達的101個circRNA，其中circ-HIPK3通過對miR-193a的海綿吸附作用影響下游晶狀體蛋白基因CRYAA的表達，由此揭示出circ-HIPK3在年齡相關性白內障的形成和發(fā)展中發(fā)揮的作用機制。

4.2代謝性白內障與非糖尿病患者相比，糖尿病患者白內障的發(fā)病年齡較早，并且發(fā)展速度更快，這可能與糖尿病性白內障晶狀體抗氧化能力受損，以及高血糖癥誘導晶狀體上皮細胞的異常增殖、凋亡和自噬相關[37]，但確切發(fā)病機制未知。Fan等[38]在糖尿病性白內障晶狀體組織和透明晶狀體組織中分析circRNA表達譜，并發(fā)現1063個circRNA顯著差異表達，其中circ-KMT2E的上調可能發(fā)揮結合miR-204-5p的海綿作用參與糖尿病性白內障的發(fā)病，但完整的調控通路仍需進一步的機制研究。

5葡萄膜疾病

葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma, UM)是成人最常見的原發(fā)性眼內惡性腫瘤，預后較差且可早期轉移[39]，嚴重威脅患者的視力乃至生命，發(fā)病機制復雜。Yang等[40]使用微陣列分析評估了UM組織和正常葡萄膜組織中的circRNA表達譜，共鑒定出50579個失調的circRNA。作者通過生物信息學分析發(fā)現其下游分子與WNT，PI3K/Akt，Hippo等20余條癌癥相關信號通路相關，并篩選出可能與UM發(fā)病機制相關circRNA-miRNA軸，但未進行更深入的研究。

6總結與展望

隨著深度測序等分子生物學技術的不斷發(fā)展以及對circRNA研究的不斷深入[41]， circRNA在眼科疾病中發(fā)揮的功能也不斷受到重視[4]。本文綜述了在青光眼、視網膜疾病、晶狀體疾病、眼表及眼眶疾病、葡萄膜疾病等眼科疾病的發(fā)生發(fā)展過程中circRNA發(fā)揮的重要作用。目前circRNA在眼科領域中的研究熱點主要集中在血管相關疾病(如視網膜新生血管、角膜新生血管等)或腫瘤相關疾病上，這與circRNA在既往研究中的功能發(fā)現相一致[42-44]，也反映出circRNA調控網絡及其功能機制的復雜性、廣泛性和多樣性。對包括眼科疾病在內的多種疾病的circRNA譜系分析，以及對circRNA生物學功能和潛在作用機制的進一步探索，依然會是當下基礎性研究的熱點內容。文章中參與相關疾病形成且研究較為深入的circRNA調控網絡及其作用機制匯總見表1。

表1 不同眼科疾病中circRNA的差異表達和分子機制

同時，在眼科疾病中circRNA的基礎性研究仍存在一定的不足:(1)不同眼科疾病中鑒定出的circRNA表達豐度，以及同一疾病下不同樣本之間鑒定出的circRNA種類差異均較大，這可能與不同的測序技術及來源組織有關，因此高穩(wěn)定性的測序技術以及縝密的功能學驗證依然是當下circRNA相關研究的基本要求[41]。(2)眼科領域中大多數機制研究僅基于circRNA的海綿效應及其與miRNA相互作用形成的調控網絡功能，但circRNA更多更復雜的調控機制還有待探索，才能夠避免在進行目標circRNA篩選時出現遺漏。(3)在多種研究中發(fā)現了差異表達，但未被現有circRNA數據庫收錄的新型circRNA，同時傳統富集分析和下游靶信號預測等分子生物學信息也存在一定滯后性，因此circRNA的相關數據庫也亟需更多的基礎性研究并加以更新。

circRNA在各種眼科疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，體現出circRNA在眼科疾病中的潛在臨床意義：(1)對circRNA-miRNA-mRNA調控網絡及其下游產物的研究為我們提供了諸多治療靶點，各項研究及體內外實驗都已證實靶向上調或下調這些關鍵介質，能夠很好地控制疾病發(fā)生發(fā)展的關鍵病理特征；(2)由于circRNA的穩(wěn)定性和特異動態(tài)表達[2]，其本身及下游產物可作為眼科疾病未來的生物標記物，為眼科疾病的診斷或預后指導新的方向。總之，真正將circRNA應用于臨床，還需要我們對circRNA在不同眼科疾病發(fā)生發(fā)展中的作用機制，以及對circRNA本身的生物學功能和特性進行更多更深層次的研究。