MTHFR、GSTP1和GSTM1基因多態(tài)性與Ⅲ期結(jié)腸癌術(shù)后輔助化療敏感性及療效的關(guān)系研究*

趙 帥，魏從真，金素麗，孫靜娜，郭 英，劉佳佳△

河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院：1.檢驗(yàn)中心；2.腫瘤科，河北石家莊 050031

化療是結(jié)腸癌的重要治療手段，以奧沙利鉑為基礎(chǔ)的XELOX化療方案在結(jié)腸癌的化療，尤其是術(shù)后化療中占據(jù)著重要地位[1]。既往研究表明，單核苷酸多態(tài)性是影響機(jī)體藥物代謝酶活性和DNA修復(fù)酶活性的重要因素，不僅影響化療藥物的體內(nèi)代謝，同時(shí)還影響個(gè)體化療效果[2-3]。亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是氟尿嘧啶類藥物在體內(nèi)代謝的關(guān)鍵酶，谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶P1(GSTP1)和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶M1(GSTM1)都是Ⅱ相毒物代謝酶GST家族的重要成員，參與機(jī)體DNA修復(fù)及毒物代謝，在多種腫瘤的遺傳易感性及化療敏感性中多有報(bào)道[4-5]。本文主要探討Ⅲ期結(jié)腸癌患者外周血MTHFR、GSTP1和GSTM1基因單核苷酸多態(tài)性與患者術(shù)后輔助化療敏感性及臨床療效的相關(guān)性，以期為臨床提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年8月至2016年7月于本院就診行結(jié)腸癌切除的Ⅲ期結(jié)腸癌患者65例作為研究對象，患者年齡24～73歲，平均(56.32±4.21)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)病理檢查確診為Ⅲ期結(jié)腸癌；(2)入組前未行放化療干預(yù)或局部治療；(3)患者初始體力狀況評價(jià)ECOG評分≤2分；(4)無心、肝、肺、腎等重要臟器功能損害；(5)未合并其他惡性腫瘤。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)妊娠、哺乳期女性或近期有生育計(jì)劃者；(2)對氟尿嘧啶過敏或代謝障礙者；(3)對鉑類衍生物過敏或代謝障礙者；(4)長期接受全身類固醇激素治療者；(5)合并腸梗阻或腸不完全梗阻者；(6)合并嚴(yán)重心血管疾病、呼吸道疾病或其他消化道疾病者；(7)合并未控制的嚴(yán)重感染者。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書，并在入組后接受結(jié)腸癌術(shù)后XELOX方案輔助化療。患者一般資料見表1。

表1 65例Ⅲ期結(jié)腸癌患者一般資料[n(%)]

1.2方法

1.2.1化療方案 所有患者均采用XELOX方案進(jìn)行術(shù)后輔助化療[6]。奧沙利鉑130 mg/m2第1天靜脈滴注；卡培他濱850 mg/m2第1～14天口服，2次/天，3周為1個(gè)周期。根據(jù)患者實(shí)際情況，給予術(shù)后輔助化療6～8個(gè)周期的干預(yù)，最少接受6個(gè)周期術(shù)后輔助化療。出現(xiàn)不能耐受的不良反應(yīng)應(yīng)立即終止治療，同時(shí)根據(jù)患者血液檢測結(jié)果及時(shí)進(jìn)行藥物劑量的調(diào)整。

1.2.2基因分型檢測 所有患者均在化療前取空腹靜脈血2 mL，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，室溫靜置30 min,-80 ℃保存。采用TIANamp Genomic DNA Kit全血基因組DNA提取試劑盒，參照使用說明進(jìn)行全血基因組DNA提取。采用紫外分光光度(A260/A280)確定DNA純度。采用PCR對MTHFR-rs1801131、GSTP1-rs1695、GSTM1基因位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增，按照生產(chǎn)廠家提供的操作手冊，依次進(jìn)行：(1)95 ℃，10 min使酶活化；(2)95 ℃，15 s使DNA變性；(3)60 ℃，60 s使引物和探針退火及延伸，共55個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增后產(chǎn)物使用ABI3370XL DNA測序儀通過 Sanger法對MTHFR-rs1801131、GSTP1-rs1695、GSTM1基因位點(diǎn)進(jìn)行等位基因分析,藍(lán)色和紅色為兩種不同的純合子，綠色為雜合子，黑色為陰性對照。結(jié)果的判讀采用雙盲法，分別由兩位實(shí)驗(yàn)人員同時(shí)進(jìn)行，對基因型不一致的標(biāo)本重新進(jìn)行檢測，對因質(zhì)量或者其他問題不能分型者，予以剔除。

1.3化療敏感性評價(jià) 化療敏感性評價(jià)采用實(shí)體腫瘤的療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)1.1(RECIST1.1)版[7]，分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病進(jìn)展(PD)和疾病穩(wěn)定(SD)，以CR+PR記為化療敏感，以PD+SD記為化療不敏感。

1.4臨床療效評價(jià) 回顧性分析患者的隨訪資料，以無病生存時(shí)間作為臨床療效評估的主要指標(biāo)，無病生存時(shí)間指手術(shù)當(dāng)日至腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或因腫瘤死亡的時(shí)間，5年隨訪期尚未復(fù)發(fā)或非腫瘤引起的死亡病例作為截尾數(shù)據(jù)處理。以總生存期為臨床療效評估的次要指標(biāo)，總生存期以病理檢查確診為Ⅲ期結(jié)腸癌至腫瘤引起的死亡或隨訪期滿的時(shí)間。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)資料采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理、分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，采用χ2檢驗(yàn)和Fisher確切概率法分析不同單核苷酸多態(tài)性與患者一般資料的關(guān)系，采用Kaplan-Meier法計(jì)算生存率。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1基因多態(tài)性分布情況 65例Ⅲ期結(jié)腸癌術(shù)后輔助化療患者的MTHFR-rs1801131、GSTP1-rs1695、GSTM1基因型位點(diǎn)分布頻率均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。其中MTHFR-rs1801131基因型分布頻率為AA型占81.54%(53/65)，AC型占12.31%(8/65)，CC型占6.15%(4/65)；GSTP1-rs1695基因型分布頻率為AA型占64.62%(42/65)，AG型占27.69%(18/65)，GC型占7.69%(5/65)；GSTM1基因型分布頻率為GSTM1基因缺失型占52.31%(34/65)，GSTM1基因未缺失型占47.69%(31/65)。

2.2基因型與化療敏感性的關(guān)系 化療敏感性數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，攜帶MTHFR-rs1801131 AA、AC/CC基因型Ⅲ期結(jié)腸癌患者的化療敏感率分別為22.64%、33.33%，與AA基因型患者化療敏感率比較，攜帶C等位基因患者的化療敏感率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。攜帶GSTP1-rs1695 AA、AG/GG基因型Ⅲ期結(jié)腸癌患者的化療敏感率分別為16.77%、43.48%，與AA基因型患者化療敏感率比較，攜帶G等位基因患者的化療敏感率明顯較高(P<0.05)，其中攜帶G等位基因腺癌患者的化療敏感率明顯高于腺鱗癌和未分化癌患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。GSTM1基因缺失型、GSTM1基因未缺失型Ⅲ期結(jié)腸癌患者的化療敏感率分別為14.71%、45.16%，與GSTM1基因缺失型患者化療敏感率比較，GSTM1基因未缺失型患者的化療敏感率明顯較高(P<0.05)。其中GSTM1基因未缺失型的腺癌患者化療敏感率也明顯高于腺鱗癌和未分化癌患者，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 基因型與化療敏感性的關(guān)系

續(xù)表2 基因型與化療敏感性的關(guān)系

2.3基因型與化療療效的關(guān)系 化療臨床療效結(jié)果顯示，攜帶MTHFR-rs1801131 AA、AC/CC基因型Ⅲ期結(jié)腸癌患者的中位無病生存時(shí)間分別為25.4、6.4個(gè)月，中位總生存期分別為45.2、14.4個(gè)月，與AA基因型患者中位無病生存時(shí)間和中位總生存期比較，攜帶C等位基因患者的中位無病生存時(shí)間和中位總生存期明顯較短(P<0.05)。攜帶GSTP1-rs1695 AA、AG/GG基因型Ⅲ期結(jié)腸癌患者的中位無病生存時(shí)間分別為25.2、15.2個(gè)月，中位總生存期分別為38.6、30.2個(gè)月，與AA基因型患者中位無病生存時(shí)間和中位總生存期比較，攜帶G等位基因患者的中位無病生存時(shí)間和中位總生存期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。GSTM1基因缺失型、GSTM1基因未缺失型Ⅲ期結(jié)腸癌患者的中位無病生存時(shí)間分別為25.8、14.6個(gè)月，中位總生存期分別為37.5、33.6個(gè)月，組間中位無病生存時(shí)間和中位總生存期比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。不同病理類型結(jié)腸癌患者中位無病生存時(shí)間和中位總生存期比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 基因型與化療療效的關(guān)系

3 討 論

結(jié)腸癌發(fā)病率位于我國消化道腫瘤發(fā)病率的第2位，僅次于胃癌，其在所有腫瘤中的發(fā)病率和病死率也居高不下，是全球發(fā)病率較高的惡性腫瘤[8]。單純手術(shù)切除治療結(jié)腸癌的療效及預(yù)后不甚理想，有超過半數(shù)患者術(shù)后會(huì)不同程度復(fù)發(fā)。因此，目前結(jié)腸癌的臨床治療仍提倡以手術(shù)為主的綜合治療，術(shù)后化療是結(jié)腸癌，尤其是Ⅲ期及以上結(jié)腸癌治療的重要方法。全身輔助化療的主要目的是在結(jié)腸癌術(shù)后進(jìn)一步清除體內(nèi)的微轉(zhuǎn)移病灶，降低腫瘤復(fù)發(fā)率，延長患者的生存時(shí)間，提高治愈率[9]。盡管術(shù)后輔助化療能在一定程度上為結(jié)腸癌患者的治療提供幫助，但由于個(gè)體差異，部分患者對化療藥物存在耐藥表現(xiàn)，仍會(huì)導(dǎo)致輔助化療的失敗。因此，對化療藥物耐藥的分子生物機(jī)制進(jìn)行研究，尋找新的靶點(diǎn)，增強(qiáng)人體對化療藥物的敏感性顯得尤為重要。隨著藥物基因組學(xué)的不斷發(fā)展，人們對藥物代謝相關(guān)酶基因多態(tài)性在用藥指導(dǎo)中作用的認(rèn)識也不斷深入，并提出在大多數(shù)情況下對藥物起清除作用的代謝酶及轉(zhuǎn)運(yùn)體遺傳性的差異，可能是導(dǎo)致腫瘤患者對抗癌藥物的療效出現(xiàn)個(gè)體差異的原因。基于此，筆者推測藥物代謝酶及藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的多態(tài)性可能會(huì)影響腫瘤患者化療的敏感性和臨床療效。

5-氟尿嘧啶(5-FU)是治療惡性腫瘤最常用的化療藥物之一，在體內(nèi)可經(jīng)酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)化為活性代謝產(chǎn)物5-氟尿嘧啶脫氧核苷，并在5,10-亞甲基四氫葉酸的作用下，與胸苷酸合酶結(jié)合，形成影響胸苷酸合酶和5-氟尿嘧啶脫氧核苷作用的復(fù)合物，發(fā)揮抑制DNA合成和細(xì)胞生長的作用，并可最終影響癌細(xì)胞的活性，是眾多化療方案中的最基礎(chǔ)藥物[10]。MTHFR是5-FU在機(jī)體內(nèi)代謝的關(guān)鍵作用酶之一，MTHFR-rs1801133是其最常見的基因突變位點(diǎn)，被認(rèn)為與MTHFR的活性密切相關(guān)，可直接影響機(jī)體葉酸的積聚，從而影響5-FU的利用率[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，MTHFR-rs1801133基因突變是結(jié)直腸癌切除術(shù)后輔助化療預(yù)后差的獨(dú)立預(yù)測因素，與化療療效息息相關(guān)[12]。谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶屬二相代謝酶，參與機(jī)體非常重要的細(xì)胞防御反應(yīng)，作為谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶家族的重要成員，GSTP1和GSTM1均參與包括鉑類藥物在內(nèi)的多種化療藥物的毒物代謝反應(yīng)[13]。GSTP1在體內(nèi)主要發(fā)揮DNA修復(fù)和化療藥物毒物代謝調(diào)節(jié)的作用，當(dāng)GSTP1中A突變?yōu)镚時(shí)，可引起密碼子編碼異亮氨酸的改變，從而影響對DNA損傷的修復(fù)效率，并引起鉑類化療藥物代謝率降低等一系列改變[14-15]。因此，有學(xué)者認(rèn)為，GSTP1的野生型突變與消化道、血液系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)不良反應(yīng)等化療不良反應(yīng)相關(guān)。GSTM1是體內(nèi)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的亞型之一，主要在化療藥物的解毒及調(diào)節(jié)能力上發(fā)揮作用，主要有GST1a、GST1b、GSTMl 3個(gè)等位基因，與機(jī)體的腫瘤易感性增加具有明顯關(guān)系。近年來，不斷有學(xué)者報(bào)道，攜帶GSTM1缺失基因型個(gè)體的結(jié)腸癌患病率增加，但也有部分研究持對立觀點(diǎn)[16-17]。本研究主要選擇MTHFR、GSTP1和GSTM1基因這3個(gè)在文獻(xiàn)報(bào)道中存在爭議的指標(biāo)進(jìn)行基因多態(tài)性分析，以Ⅲ期結(jié)腸癌患者為觀察對象，主要關(guān)注Ⅲ期結(jié)腸癌患者術(shù)后輔助化療敏感性及療效與MTHFR、GSTP1和GSTM1基因單核苷酸多態(tài)性的關(guān)系。

筆者選取了2015年8月至2016年7月于本院行結(jié)腸癌切除術(shù)并在術(shù)后接受XELOX方案化療的Ⅲ期結(jié)腸癌患者65例作為臨床研究對象，對所有患者進(jìn)行放療前血樣采集，發(fā)現(xiàn)65例患者的MTHFR-rs1801131、GSTP1-rs1695、GSTM1基因型位點(diǎn)分布頻率均符合Hardy-Weinberg平衡定律，提示數(shù)據(jù)具有良好的群體代表性。研究結(jié)果顯示，MTHFR-rs1801131基因型分布頻率為AA 81.54%，AC 12.31%，CC 6.15%；GSTP1-rs1695基因型分布頻率為AA 64.62%，AG 27.69%，GC 7.69%；GSTM1基因型分布頻率為GSTM1基因缺失型 52.31%，GSTM1基因未缺失型47.69%。在完成基因型分布頻率檢測的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)行了隨訪資料的回顧性分析，以及不同基因型分布頻率與患者化療敏感性和化療療效的關(guān)系分析。結(jié)果顯示，攜帶MTHFR-rs1801131 AA基因型Ⅲ期結(jié)腸癌患者的化療敏感率與攜帶AC/CC基因型患者比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；但攜帶GSTP1-rs1695 AA基因型患者的化療敏感率則明顯低于攜帶AG/GG基因型患者(P<0.05)，GSTM1基因缺失型患者化療敏感率也明顯低于GSTM1基因未缺失型患者(P<0.05)。這提示MTHFR-rs1801131基因多態(tài)性與Ⅲ期結(jié)腸癌患者的化療敏感率無關(guān)(P>0.05)，GSTP1-rs1695攜帶G等位基因及GSTM1基因未缺失型患者的化療敏感率更高(P<0.05)。進(jìn)一步分析患者的病理類型發(fā)現(xiàn)，攜帶G等位基因的腺癌患者或GSTM1基因未缺失型腺癌患者的化療敏感率明顯高于腺鱗癌和未分化癌患者(P<0.05)。

本研究中的臨床療效分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，攜帶MTHFR-rs1801131 AA基因型患者的中位無病生存時(shí)間和中位總生存期明顯優(yōu)于攜帶C等位基因患者(P<0.05)，而攜帶GSTP1-rs1695 AA、AG/GG基因型Ⅲ期結(jié)腸癌患者的中位無病生存時(shí)間和中位總生存期比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；GSTM1基因缺失型與GSTM1基因未缺失型Ⅲ期結(jié)腸癌患者的中位無病生存時(shí)間和中位總生存期比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這提示MTHFR-rs1801131 基因型突變與化療療效具有相關(guān)關(guān)系，但GSTP1-rs1695與GSTM1基因突變則不影響患者的化療效果。

綜上所述，MTHFR-rs1801131基因突變可影響Ⅲ期結(jié)腸癌患者術(shù)后輔助化療的療效，攜帶C等位基因患者的中位無病生存時(shí)間和中位總生存期明顯較短；GSTP1-rs1695和GSTM1基因型突變則與Ⅲ期結(jié)腸癌患者術(shù)后輔助化療敏感性有關(guān)，GSTP1-rs1695攜帶G等位基因及GSTM1基因未缺失型患者的化療敏感率明顯較高。