鱘魚和草魚魚鰾酶溶性膠原蛋白的理化性質比較

楊子帆，張 科，劉 瑩，王 益，黃 文

（華中農業大學食品科學技術學院，湖北武漢 430070）

膠原蛋白是動物體內含量最豐富、分布最廣泛的結構蛋白，也是細胞外基質中主要組成成分之一。膠原蛋白廣泛存在于哺乳和水產動物的皮、骨等器官組織，由于膠原蛋白具有低免疫原性且生物相容性良好，被廣泛用于化妝品、食品和醫藥等領域[1]。目前膠原蛋白主要來源于哺乳動物的皮和跟腱組織，受人畜共患病以及宗教問題的影響，人們開始從魚類中提取膠原蛋白進行研究。近年來，魚類膠原蛋白理化性質和生物活性的相關研究日益增加，為魚類膠原蛋白的發展提供了科學依據[2]。

鱘魚是世界現有淡水魚中體型較大，壽命較長的魚類，隨著我國鱘魚養殖技術的成熟，鱘魚養殖的總量每年呈增長趨勢[3]。鱘魚加工過程中會產生大量副產物魚鰾，其膠原蛋白含量豐富，可以作為魚類膠原蛋白的來源。目前對鱘魚魚鰾膠原蛋白的研究中：蔣玉[4]從鱘魚魚鰾中提取膠原蛋白，通過大鼠飼喂實驗發現可以延緩大鼠皮膚自然衰老，具有良好的生物安全性；張曦[5]從鱘魚軟骨、皮、和魚鰾中得到膠原蛋白，發現魚鰾膠原蛋白有更好的原纖維形成能力。草魚魚鰾膠原蛋白是淡水魚鰾中研究較多且來源廣的蛋白[6?7]，而鱘魚魚鰾與常見淡水魚的魚鰾不同，為了探究鱘魚魚鰾膠原蛋白與常見淡水魚魚鰾膠原蛋白理化性質的差異，選取草魚魚鰾作為對比進行研究。膠原蛋白提取的方法有鹽法、酸法、酶法和熱水法，其中酶法提取膠原蛋白對膠原蛋白天然三螺旋結構影響最小且生物安全性高[8]。

故本研究以人工養殖的鱘魚魚鰾和草魚魚鰾為原料，測定兩種魚鰾的基本營養成分，通過酶法制備兩種魚鰾酶溶性膠原蛋白（PSC），對兩種魚鰾PSC理化性質比較分析，探究鱘魚魚鰾PSC與普通淡水魚草魚魚鰾PSC的差異性，為鱘魚魚鰾在食品和生物材料領域發展應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鱘魚魚鰾 嫦娥創新（武漢）生物科技有限公司；草魚魚鰾 華中農業大學中百超市；異丙醇、氫氧化鈉、氯化鈉、冰乙酸、鹽酸 國藥集團化學試劑有限公司（分析純）；胃蛋白酶（1:3000）、L-羥脯氨酸 索萊寶科技有限公司。

LGJ-10真空冷凍干燥機 北京松源華興科技發展有限公司；DYY-8C型電泳儀 北京六一儀器廠；MicroDSCIII微量熱儀 法國SETARAM公司；UV-1800紫外可見分光光度計 日本島津公司；NEXUS-470傅里葉紅外光譜儀 美國Nicolet公司；J-1500圓二色譜儀、L-8900氨基酸自動分析儀日本日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 兩種魚鰾基本營養成分的測定 水分含量根據GB 5009.3-2016中的直接干燥法測定；灰分根據GB 5009.4-2016測定；蛋白質含量的測定根據GB 5009.5-2016中的凱氏定氮法測定；脂肪含量的測定根據GB 5009.6-2016中的索氏抽提法測定；總糖含量根據GB/T 9695.31-2008中的分光光度法測定；羥脯氨酸（Hyp）含量根據氯胺T比色法測定[9]。

1.2.2 兩種魚鰾酶溶性膠原蛋白的制備 以下操作均在4 ℃下進行，因為原材料差異，采用不同的方法對兩種魚鰾進行膠原蛋白提取前的預處理。

1.2.2.1 鱘魚魚鰾的預處理 將從鱘魚魚鰾內膜剝下來的內層浸泡于4 mol/L的NaCl溶液中24 h（料液比為1:20）[4]。用勻漿機以5000 r/min勻漿5 min。將其置于磁力攪拌器上輕微攪拌24 h，以脫除雜蛋白，每8 h換一次液。然后用蒸餾水漂洗3次，將其浸泡于10%的異丙醇中脫脂24 h（料液比為1:20），用蒸餾水漂洗3次。下一步進行酶溶性膠原蛋白提取。

1.2.2.2 草魚魚鰾的預處理 先將草魚魚鰾剪成大小為0.5 cm×0.5 cm的片段，將剪好的草魚魚鰾在0.1 mol/L 的NaOH中輕微攪拌24 h（料液比為1:20），以脫除雜蛋白[5?6]。然后用蒸餾水將魚鰾漂洗至中性，將其浸泡于10%的異丙醇中脫脂24 h（料液比為1:20），用蒸餾水漂洗3次。下一步進行酶溶性膠原蛋白的提取。

1.2.2.3 兩種魚鰾酶溶性膠原蛋白（PSC）的提取、純化及膠原蛋白得率計算 將預處理好的鱘魚魚鰾和草魚魚鰾用含有胃蛋白酶（1:3000）的乙酸溶液（0.5 mol/L）緩慢攪拌48 h，胃蛋白酶的添加量為各魚鰾干重的2%，料液比為1:100，于10000 r/min離心10 min后收集上清液，用2 mol/L的NaOH調節上清液的pH至7.5[4?7]。向上清液中多次緩慢攪拌加入提前碾磨好的NaCl粉末直至NaCl濃度達到2.5 mol/L為止，攪拌2 h，靜置12 h，于10000 r/min離心10 min后，收集沉淀，用0.5 mol/L乙酸（料液比1:30）緩慢攪拌至沉淀溶解。將其裝入截留分子量為14 kDa的透析袋中[10]（盡量避免帶入氣泡），分別用0.1 mol/L乙酸、0.05 mol/L乙酸與蒸餾水各透析2天，最后用真空冷凍干燥機干燥得到兩種魚鰾PSC，按照下式計算膠原蛋白得率。

1.2.3 SDS-PAGE分析 參考LaemmLi[11]對兩種魚鰾PSC進行電泳分析。濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為8%。用預冷的蒸餾水在4 ℃下攪拌溶解，使其濃度達到2.5 mg/mL，與上樣緩沖液混合（膠原蛋白溶液:上樣緩沖液=4:1），煮沸3 min，10000 r/min離心5 min，取10 μL上清液上樣，Marker上樣量為5 μL。跑濃縮膠電壓為80 V，時間約為0.5 h。待條帶進入分離膠后，電壓調至120 V，時間約為1.5 h。采用考馬斯亮藍R250溶液進行染色，用50%甲醇與6.8%醋酸溶解R250，振蕩染色4 h。用5%甲醇與7.5%醋酸脫色至無背景色，然后用凝膠成像系統拍攝并分析各條帶的分子質量，商業明膠作為對照組。

1.2.4 氨基酸組成分析 取凍干后的兩種魚鰾PSC各100 mg，取5 mL的6 mol/L HCl，110 ℃下水解24 h[10]。將溶液注入氨基酸自動分析儀，與標準氨基酸對比，氨基酸含量記為每1000個殘基對應的氨基酸殘基個數。

1.2.5 紫外光譜分析 稱取適量的兩種魚鰾PSC，用預冷的蒸餾水在4 ℃下攪拌溶解，使膠原蛋白濃度達到1 mg/mL。用紫外分光光度計對膠原蛋白溶液進行190～400 nm波長掃描[12]。

1.2.6 紅外光譜分析 參考Pal等[13]方法，稱取1～2 mg的兩種魚鰾PSC樣品加入200 mg左右干燥后的KBr中，在瑪瑙研缽中按一個方向碾細，取適量放入擦拭干凈的模具，置于真空壓片機中關閉放氣閥并加壓至20 MPa持續1～2 min，將制備好樣品的壓片放入樣品室中，用傅里葉紅外分析儀進行400～4000 cm?1掃描，并以單純的KBr壓片掃描作為背景。

1.2.7 圓二光譜分析 稱取適量的兩種魚鰾PSC樣品，用預冷的蒸餾水在4 ℃下攪拌溶解，使膠原蛋白濃度達到0.5 mg/mL。常溫下在190～260 nm波長范圍內掃描，掃描速率為20 nm/min，間隔0.1 nm[14]。

1.2.8 熱變性溫度測定 將兩種魚鰾PSC與蒸餾水按1:40混合，充分溶脹24 h（4 ℃）。于8000 r/min離心3 min以脫除氣泡，取適量膠原蛋白溶液加入微量熱儀測定其熱變性溫度（Td）[15]。升溫速率為0.5 ℃/min，溫度范圍在10～60 ℃。

1.3 數據處理

采用SPSS軟件進行統計學分析，每個指標測三次平行，統計結果以±s表示。

2 結果與分析

2.1 兩種魚鰾基本營養成分比較和膠原蛋白得率分析

表1 為兩種魚鰾的基本營養成分和膠原蛋白得率的結果。從表1可見鱘魚魚鰾的水分含量顯著低于草魚魚鰾（P＜0.05）；為了減少誤差，除了水分，其它成分以干基計，兩種魚鰾蛋白質含量都較高；鱘魚魚鰾粗脂肪的含量為5.31%，顯著高于草魚魚鰾3.51%（P＜0.05）；兩種魚鰾灰分、總糖的含量差異不顯著（P＞0.05）。兩種魚鰾在干基下蛋白質含量沒有顯著性差異（P＞0.05），但是鱘魚魚鰾中羥脯氨酸的含量顯著高于草魚魚鰾（P＜0.05）；同時鱘魚魚鰾PSC得率80.63%顯著高于草魚魚鰾PSC得率49.85%（P＜0.05）。在動物體內羥脯氨酸是膠原蛋白的特征氨基酸，可以測定羥脯氨酸，乘以轉換系數11.1來估算兩種魚鰾膠原蛋白的含量[16]。汪安利等[17]研究發現魚鰾的基本營養成分因種屬的不同而有所差異，不同種屬的干魚鰾營養成分中蛋白質含量最高，脂肪含量偏低。這兩種魚鰾的營養成分組成符合這一結論。

表1 鱘魚、草魚魚鰾基本營養成分及膠原蛋白得率（除水分均以干基計）Table 1 The basic nutrients of sturgeon and grass carp swim bladder and the yield of collagen (except for water, all on dry basis)

2.2 SDS-PAGE分析結果

圖1 為兩種魚鰾PSC和明膠的電泳條帶，可見兩種魚鰾PSC的電泳條帶與明膠的電泳條帶差別非常大，兩種魚鰾PSC都含有兩條遷移率不同的α鏈（α1和α2）及它們的二聚體β鏈和三聚體γ鏈，兩種魚鰾PSC的α1鏈含量均比α2含量高，且α鏈的相對分子質量都在120～150 kDa之間，β鏈和γ鏈的相對分子質量也在200 kDa以上。這些特征與報道的I型膠原蛋白電泳條帶一致[18]。從電泳圖中也可以看出兩種PSC的差異，草魚魚鰾PSC的α鏈的相對分子質量要高于鱘魚魚鰾PSC，同時草魚魚鰾PSC的二聚體β鏈含量也比鱘魚魚鰾PSC的含量要高。

圖1 兩種魚鰾PSC和明膠的電泳圖譜Fig.1 SDS-PAGE electrophoretic patterns of two kinds of swim bladder PSC and gelatin

2.3 氨基酸組成分析結果

表2 為兩種魚鰾PSC氨基酸組成。從表2可見，兩種魚鰾PSC的氨基酸組成中的天冬氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、甘氨酸、纈氨酸含量沒有顯著性差異（P＞0.05），鱘魚魚鰾PSC中的絲氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、組氨酸和精氨酸的含量顯著高于草魚魚鰾PSC（P＜0.05），草魚魚鰾PSC中的丙氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸的含量顯著高于鱘魚魚鰾PSC（P＜0.05）。

表2 兩種魚鰾PSC的氨基酸組成（殘基個數/1000個殘基）Table 2 Amino acid composition of two kinds of swim bladder PSC（AA/1000 AA）

李國英等[19]報道I型膠原蛋白氨基酸組成特點：甘氨酸的含量占30%左右，亞氨基酸（脯氨酸和羥脯氨酸）含量占20%左右，哺乳動物膠原蛋白中亞PSC紫外最大吸收峰的位置不同，但都在230 nm附近，符合I型膠原蛋白紫外光譜特征。氨基酸含量較高，通常高于魚類膠原蛋白，豬皮和牛皮膠原蛋白中亞氨基酸含量分別是22%和21.5%。鱘魚和草魚魚鰾PSC的甘氨酸的含量分別是34.9%和35.3%，亞氨基酸的含量分別是17.9%和19.5%。豬皮和牛皮膠原蛋白中亞氨基酸含量都高于兩種魚鰾PSC，與報道相符?？赡苁且驗榉N屬和生長環境的差異導致兩種魚鰾中提取的PSC的氨基酸組成中大部分氨基酸含量存在明顯差異，但兩種魚鰾PSC的氨基酸組成都符合I型膠原蛋白的特征。

2.4 紫外光譜分析結果

圖2 為兩種魚鰾PSC紫外光譜。其中鱘魚魚鰾PSC最大吸收峰為227 nm，草魚魚鰾PSC最大吸收峰為228 nm。據報道[20]，大多數蛋白質在波長280 nm附近有最大吸收峰，這主要是色氨酸殘基的吲哚環和酪氨酸殘基的酚基引起的，而I型膠原蛋白紫外最大吸收峰在230 nm左右。盡管兩種魚鰾

圖2 兩種魚鰾PSC的紫外光譜Fig.2 Ultraviolet spectra of two kinds of swim bladder PSC

2.5 紅外光譜分析結果

圖3 為兩種魚鰾PSC紅外光譜，可見兩種魚鰾PSC紅外光譜都具有I型膠原蛋白典型的五條紅外吸收酰胺帶，但每個酰胺帶的峰位不同。其中酰胺A帶歸屬于N-H伸縮振動，酰胺B歸屬于-CH2不對稱伸縮振動，酰胺I帶歸屬于C=O伸縮振動，酰胺II帶歸屬于N-H彎曲振動和C-N伸縮振動，酰胺III帶歸屬于N-H彎曲振動[21]。

圖3 兩種魚鰾PSC的紅外光譜Fig.3 Infrared spectra of two kinds of swim bladder PSC

根據Doyle理論[22]，酰胺A帶中當N-H的氫鍵鍵合程度比較高時，吸收波數就會藍移，振動頻率就會降低。草魚魚鰾PSC的酰胺A帶位置的波數要比鱘魚魚鰾PSC大，表明鱘魚魚鰾PSC分子間可能形成較廣泛的氫鍵鍵合。

Payne等[23]報道酰胺I帶和酰胺II帶兩個峰的振動頻率與膠原蛋白分子的有序度和交聯度呈正相關。圖中草魚魚鰾PSC兩個酰胺帶峰的振動頻率都稍高于鱘魚魚鰾PSC，表明草魚魚鰾PSC具有比鱘魚魚鰾PSC較高的有序度和交聯度。

總的來講，從紅外光譜中可以看出兩種魚鰾膠原蛋白二級結構相似但也存在一定差異，草魚魚鰾PSC中有較高的分子有序度和分子間交聯度，而鱘魚魚鰾PSC中擁有較多的氫鍵。

2.6 圓二光譜分析結果

圖4 為兩種魚鰾PSC和明膠的圓二光譜，兩種魚鰾PSC圓二光譜中負峰的吸收波長為200 nm，正峰的吸收波長為220 nm，而明膠沒有正峰。Sreerama等[24]報道膠原蛋白溶液的圓二光譜特征：在200 nm左右存在一強負吸收峰，在220 nm左右存在一弱正吸收峰。Feng等[25]報道，若膠原蛋白的圓二光譜中的正負吸收峰的強度比值的絕對值Rpn值小于1，即可判斷其存在三螺旋結構。兩種魚鰾PSC圓二光譜的正負吸收峰的位置與報道的膠原蛋白圓二光譜相符，其中鱘魚魚鰾PSC的Rpn=0.17，草魚魚鰾PSC的Rpn=0.16，兩者都小于1，圓二光譜特征說明這兩種不同來源的魚鰾PSC二級結構相似且都保持了較為完整的三螺旋結構。

圖4 兩種魚鰾PSC和明膠的圓二光譜Fig.4 Circular dichroic spectra of two kinds of swim bladder PSC and gelatin

2.7 熱變性溫度測定結果

圖5 是兩種魚鰾PSC的DSC結果，可見草魚魚鰾PSC的變性溫度為36.01 ℃，高于鱘魚魚鰾PSC的熱變性溫度為29.26 ℃（P＜0.05）。

圖5 兩種魚鰾PSC的DSC結果Fig.5 DSC results of two kinds of fish bladder PSC

膠原蛋白的熱穩定性是重要的理化性質指標[26]。研究報道魚類膠原蛋白的熱穩定性與魚類的生活環境和溫度有關，通常冷水魚低于溫水魚[27?28]。Kimura等[29]研究阿拉斯加狹鱈魚魚鰾膠原蛋白的變性溫度為18.4 ℃，因為屬于冷水魚，所以它的熱穩定性較差。其中鱘魚的生長適宜溫度在20～25 ℃，草魚的生長適宜溫度在27～32 ℃[30]，可判斷其熱穩定性可能與其生存環境溫度相關。同時膠原蛋白的熱穩定性和氨基酸組成有一定的聯系，但不同的學者有不同的結論。Ikoma等[31]研究表明亞氨基酸中存在著吡啶環狀結構，這一結構對膠原蛋白三螺旋結構的穩定性起重要作用，所以膠原蛋白的熱變性溫度與亞氨基酸的含量存在正相關性。而Nagai等[32]研究表明羥脯氨酸中的羥基結構有助于形成內的氫鍵鍵合，可以提高三螺旋結構的穩定性，故脯氨酸的羥基化程度與膠原蛋白的熱變性溫度存在正相關性。氨基酸組成分析中鱘魚魚鰾PSC的亞氨基酸含量是17.9%，脯氨酸的羥基化程度是57.5%，草魚魚鰾PSC中亞氨基酸含量是19.5%，脯氨酸的羥基化程度是49.6%。造成鱘魚魚鰾PSC和草魚魚鰾PSC熱穩定差異的原因更接近Ikoma的理論，即亞氨基酸的含量偏低導致鱘魚魚鰾PSC的變性溫度低于草魚魚鰾PSC的變性溫度。

綜合分析,兩種魚生長的環境溫度以及兩種魚鰾PSC中亞氨基酸含量可能是造成兩種魚鰾PSC熱穩定性具有顯著性差異的原因。

3 結論

鱘魚魚鰾基本營養成分中的粗脂肪和羥脯氨酸含量均顯著高于草魚魚鰾（P＜0.05）；鱘魚魚鰾PSC得率80.63%顯著高于草魚魚鰾PSC得率49.85%（P＜0.05）；兩種魚鰾PSC都屬于I型膠原蛋白；兩種魚鰾PSC具有相似的二級結構；鱘魚魚鰾PSC的α鏈相對分子質量和二聚體β鏈的含量都低于草魚魚鰾PSC；氨基酸組成中鱘魚魚鰾PSC中的絲氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、組氨酸和精氨酸的含量顯著高于草魚魚鰾PSC（P＜0.05），草魚魚鰾PSC中的丙氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸的含量顯著高于鱘魚魚鰾PSC（P＜0.05）；鱘魚魚鰾PSC的變性溫度29.26 ℃顯著低于草魚魚鰾PSC變性溫度36.01 ℃（P＜0.05）。從鱘魚魚鰾和草魚魚鰾中所得到的PSC雖都屬于I型膠原蛋白，但草魚魚鰾PSC有更好的熱穩定性，鱘魚魚鰾PSC有更高的得率。