基于多元統計分析的曹妃甸區24份鹽地堿蓬成分指標綜合評價

孟 然，張曉東，楊雅華，王秀萍，薛志忠

（河北省農林科學院濱海農業研究所，唐山市植物耐鹽研究重點實驗室，河北唐山 063200）

土壤鹽漬化是農業發展面臨的重要問題之一，會導致土壤質地粘重、透氣性不良，表層積鹽重、上層高礦化度地下水積累多、心底土鹽分含量高，全鹽含量常在0.4%～1.8%，pH常在7～8之間[1?2]。唐山市地處渤海之濱，南部沿海擁有近1100 km2的灘涂及鹽堿地，而曹妃甸區是唐山市境內鹽堿地程度較高、鹽漬化區域較集中的濱海地區，全區境內80%的土地為鹽堿土壤，在我國鹽堿地中具有代表性。

鹽地堿蓬（Suaeda salsa(L.)Pall.）俗名黃須菜，為藜科堿蓬屬一年生草本鹽生植物，對鹽堿地區的土壤、氣候等環境條件具有很強的適應性，是鹽堿地的典型指示植物[3]，在曹妃甸區野生資源豐富。鹽地堿蓬幼芽莖葉鮮嫩可食用，富含維生素、蛋白質、氨基酸等營養物質，其中維生素尤以抗壞血酸含量最為突出，最高可達到86.00 mg/100 g[4]，與蔬菜中含量較高的辣椒幾乎相當；蛋白質與膳食纖維含量共同占干物質總量的30%以上[5]；氨基酸含量豐富，種類齊全，必需氨基酸構成合理[6]，是一種極具營養價值的野菜，被譽為“菜中靈芝”[7]。此外，還含黃酮類、萜類、多酚類、多糖類物質等[8]，具有降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗氧化、免疫調節的作用[9?11]。

亞硝酸鹽超標已經成為影響食品安全的重要原因之一，由于生長環境的特殊性，鹽地堿蓬等野菜中亞硝酸鹽含量為一項重要監測指標。現有文獻多記載山東鹽城、東營及山西汾河灘地區堿蓬亞硝酸鹽情況，不同地區堿蓬亞硝酸鹽含量存在較大差異，部分亞硝酸鹽含量超過了聯合國糧食農業組織/世界衛生組織規定和中國食品安全國家標準[12]，而關于河北地區唐山一帶堿蓬鮮有報道。隨著對鹽地堿蓬作為優質的蔬菜、經濟作物和具有醫療保健價值屬性的充分認識，堿蓬資源的開發引起人們的重視，但缺少對于唐山曹妃甸地區鹽地堿蓬成分指標評價較為系統的研究。

據此，本研究以曹妃甸內不同區域的鹽地堿蓬為研究對象，對其水分、抗壞血酸、蛋白質、氨基酸、總黃酮、亞硝酸鹽含量進行檢測，利用相關性分析、主成分分析以及聚類分析方法，對鹽地堿蓬成分指標進行綜合評價，擬篩選出綜合評價不同地區鹽地堿蓬品質的指標，并探究了土壤鹽分、速效養分與品質之間的關系，以期為曹妃甸區鹽地堿蓬質量評價提供可靠的分析方法與參考依據，也為進一步加工發展與綜合利用提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣本 采集于唐山市曹妃甸區不同采樣點，共24份材料于2020年6月統一采集，經河北省農林科學院王秀萍研究員鑒定為藜科堿蓬屬鹽地堿蓬（Suaeda salsa）；蘆丁標準品（貨號：R189033，純度95%） 阿拉丁公司；磷酸、甲醇 色譜純，Fisher Chemical公司；無水乙醇、草酸、抗壞血酸、碳酸氫鈉、2,6-二氯酚靛酚等 分析純，天津市恒興化學試劑制造有限公司；氨基酸含量檢測試劑盒（貨號：BC1570）、亞硝酸鹽含量測定試劑盒（貨號：BC1490）、雙縮脲法蛋白質含量檢測試劑盒（貨號：BC3180）北京Solaibio科技有限公司；純凈水 屈臣氏。

AP124W電子天平 島津公司；JT-1027HTD機械超聲波清洗機 深圳市潔拓超聲波清洗設備有限公司；D-37520 osterode臺式高速冷凍離心機 德國Biofagestratos公司；TU-1810紫外可見分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋 上海力辰邦儀器科技有限公司；SCIENTZ-48組織研磨機 寧波新芝生物科技股份有限公司；1200型高效液相色譜儀 Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的采集方法 為避免工廠污染的影響，選取曹妃甸區內鹽地堿蓬生長密集區，從不同區域的野外鹽堿荒地隨機進行鹽地堿蓬采樣，共獲得24份樣本，分別來自于唐山市曹妃甸區一場、二場、七場、十一場、柳贊鎮、南堡區、大學城、工業區，具體采樣地的地理坐標及采收日期見表1。

表1 鹽地堿蓬采樣地點及時間Table 1 Sampling location and time of Suaeda salsa

選擇生長狀態良好、無機械損傷綠色表型的鹽地堿蓬植株，將樣本裝入牛皮紙袋，編號，每個樣點采集樣本3份。將每一份鹽地堿蓬樣本分成兩部分，一部分留用鮮樣待測，一部分用流動水洗去表面泥沙，再用蒸餾水沖洗3～4次，于60 ℃烘干12 h后粉碎過0.15 mm孔徑篩，粉末備用。

在所取植株近根處采用取土器垂直取20 cm深度的耕層土壤，每個樣點采集樣本3份，混勻后用四分法留取1 kg土樣，裝袋帶回，經60 ℃烘干12 h后過1 mm和0.25 mm孔徑篩備用。

1.2.2 不同區域鹽地堿蓬品質指標測定

1.2.2.1 基本營養成分的測定 水分、抗環血酸、蛋白質、氨基酸含量采用鮮樣測定，水分含量的測定參照GB5009.3—2010食品中水分的測定-直接干燥法[13]。抗環血酸含量的測定參照GB 5009.86-2016《食品安全國家標準-抗壞血酸的測定》[14]。

蛋白質含量測定采用試劑盒法，蛋白質（mg/g 鮮重）=C標準管/（A標準管?A空白管）×（A測定管?A空白管）×V樣總/W。其中，C標準管：5 mg/mL；A標準管：標準管的吸光值；A空白管：空白管的吸光值；V樣總：樣本總體積，1 mL；W：樣本質量，g。

氨基酸含量測定采用試劑盒法，氨基酸含量（μmol/g 質量）=[C標準管×V標準管×△A測定管/△A標準管]×（V樣總/V樣）/W。其中，C標準管：標準品濃度，10 μmol/mL；V標準管：反應體系中加入標準品體積，0.05 mL；V樣總：樣本總體積，1 mL；V樣：反應體系中加入樣本體積，0.05 mL；W：樣本質量，g。

1.2.2.2 總黃酮含量的測定 采用超聲波輔助甲醇提取法提取鹽地堿蓬總黃酮[15]，取一定質量堿蓬莖葉粉末，采用纖維素酶與果膠酶于60 ℃水浴復合酶解30 min，用70%甲醇溶液調整至料液比1:100，于60 ℃超聲120 min，轉速8000 r/min離心15 min后取上清液。利用一次性注射器和0.45 μm針頭式過濾器將最終提取液注入至進樣瓶中備用，待進樣檢測。參考郭麗霞等[16]的高效液相色譜法，以蘆丁標準品制作標準曲線，以峰面積定量，通過回歸方程對樣品中的總黃酮進行定量分析。回歸方程為y=15467x+1.9（R2=0.997），其中y是總峰面積，x是樣品中總黃酮濃度（以蘆丁計），mg/mL。

HPLC條件：色譜柱：Dikma C18柱（4.6 mm×250 nm，5 μm）；流動相：A（體積分數0.2%的磷酸水溶液）：B（甲醇）＝50:50；檢測波長：350 nm；柱溫：30 ℃；流速：1 mL/min；進樣量：10 μL。流動相均經真空泵過濾除雜和超聲清洗機脫氣。

1.2.2.3 亞硝酸鹽含量的測定 亞硝酸鹽含量使用鮮樣測定，測定方法采用試劑盒法，亞硝酸鹽含量（μmol/g 鮮重）=0.12×[(A樣品?A空白）/（A標準?A空白）]/W。其中，A樣品：測定管的吸光值；A空白：空白管的吸光值；A標準：標準管的吸光值；W：樣本質量，g。

1.2.3 不同區域鹽地堿蓬土壤成分測定 參照《土壤農化分析》[17]及《土壤學實驗指導》[18]的方法，采用堿解擴散法、碳酸氫鈉法和醋酸銨法分別測定土壤速效氮、速效磷和速效鉀含量。

1.3 數據處理

遵循平行重復原則，所有試驗均重復3次，數據以平均值±標準差表示。采用SPSS 23.0統計軟件進行描述性分析，分析各指標的均值、極值、標準差和變異系數，并進行單因素ANOVA方差分析，運用Duncan檢驗法對成分指標、土壤鹽分及速效養分含量分別進行顯著性評價；采用雙變量Pearson相關分析法對成分指標之間、與土壤鹽分及速效養分之間的相關性進行分析；同樣采用SPSS對品質指標進行主成分分析，以特征值大于1為標準，以每個主成分分別對應的方差貢獻率占累積方差貢獻率的比例作為權重[19]，構建堿蓬品質的評價函數；采用組間平均數聯結法，根據平方歐式距離，對不同區域鹽地堿蓬進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 不同區域鹽地堿蓬成分指標分析

為探究鹽地堿蓬成分指標的產地差異，測定了不同區域樣本中的水分、氨基酸、蛋白質、抗壞血酸、亞硝酸鹽以及黃酮含量（表2），不同區域鹽地堿蓬的成分指標之間變異系數不同，說明成分指標之間呈現不同的差異性，亞硝酸鹽含量差異最大，水分含量差異最小。南堡區水分、蛋白質及亞硝酸鹽含量均為最高值，其中南堡區、工業區鹽地堿蓬中蛋白質含量分別為16.315和14.825 mg/g，顯著高于其他區域（P＜0.05），二場鹽地堿蓬蛋白質含量最低，為4.999 mg/g，較其他組差異顯著（P＜0.05）；二場、工業區鹽地堿蓬抗壞血酸含量分別為4.565和4.034 mg/100 g，顯著高于其他區域（P＜0.05），且二者具顯著差異（P＜0.05），從報道的文獻來看，鹽地堿蓬抗壞血酸含量從0.55到86.00 mg/100g不等[4,20]，本研究中抗壞血酸含量與文獻中試驗結果有所差異，其原因可能是采樣時間、采樣部位或采樣地點不同從而展現出不同的規律；南堡區鹽地堿蓬中亞硝酸鹽含量為5.885 μg/g，顯著高于其他區域（P＜0.05），根據國家食品安全標準（GB 2762—2017），蔬菜及其加工制品中亞硝酸鹽含量應該在20 mg/kg[12]范圍以內，所有采集區域樣本均未超標。不同區域鹽地堿蓬中水分、氨基酸、黃酮含量無顯著差異（P＞0.05）。

表2 不同區域鹽地堿蓬成分指標分析（n=3）Table 2 Analysis of component indexes of Suaeda salsa from different regions (n=3)

2.2 不同區域土壤鹽分及速效養分含量分析

如表3所示，土壤速效氮含量變異系數最大，為65.328%，說明不同區域土壤速效氮含量差異大。其中柳贊鎮土壤的速效氮含量達到54.250 mg/kg，顯著高于其他區域（P＜0.05）；南堡區土壤鹽分量最高，達2.360%，除柳贊鎮以外，較其他區域差異顯著（P＜0.05）；此外，南堡區速效鉀含量也具有最高值，為408.051 mg/kg，顯著高于其他區域（P＜0.05），七場土壤速效鉀含量顯著低于其他區域（P＜0.05）；二場土壤中速效磷含量最高，除一場、柳贊鎮以外，較其他區域差異顯著（P＜0.05）。

表3 不同區域土壤鹽分及速效養分含量分析(n=3)Table 3 Analysis of soil salt content and available nutrient content in different regions (n=3)

2.3 鹽地堿蓬成分指標與土壤鹽分及速效養分相關性分析

相關性分析結果如表4所示，蛋白質含量與土壤鹽分呈極顯著正相關（P＜0.01），與土壤速效鉀含量呈極顯著正相關（P＜0.01），表明土壤鹽分及速效鉀的變化顯著影響蛋白質的變化，進而影響鹽地堿蓬的營養品質。有研究表明，在一定范圍內，隨土壤鹽分的增加，翅堿蓬葉片中可溶性蛋白的含量整體呈上升趨勢[21]，與本試驗結果一致。有學者認為，在一定濃度鹽脅迫處理下，堿蓬植物為了自我保護和抗鹽，細胞中蛋白質合成代謝增強，參與滲透調節[22]。而鉀能提高植物光合作用效率，促進碳水化合物的形成、轉運和貯藏，促進氮的吸收，加速蛋白質的合成[23]。

表4 鹽地堿蓬成分指標與土壤鹽分及速效養分的相關性分析Table 4 Correlation analysis of component indexes with content of soil salt and quick-acting nutrientsof Suaeda salsa

亞硝酸鹽與土壤鹽分呈顯著正相關（P＜0.05），與土壤速效鉀含量呈顯著正相關（P＜0.05），由此可知，一定程度的鹽脅迫促進了鹽地堿蓬中蛋白質和亞硝酸鹽含量的增加，與表2、表3結果相對應，表明土壤鹽分及速效鉀的變化同樣顯著影響亞硝酸鹽含量，進而影響鹽地堿蓬的安全品質。

總黃酮含量與土壤鹽分呈極顯著負相關（P＜0.01），表明土壤鹽分的變化顯著影響總黃酮含量的變化。黃酮類物質屬于次生代謝產物，在中等鹽度脅迫下，有助于植物體內次生代謝產物積累[24]。但本研究結果顯示土壤鹽分阻礙了黃酮含量的積累，盡管不同植物中，報道結果并不一致，這可能與不同植物黃酮含量差異及對環境響應不同造成的，尚需更多研究數據支持。

2.4 鹽地堿蓬成分指標之間的相關性分析

鹽地堿蓬成分指標間存在相互依存和制約的關系，多樣本兩指標之間系數絕對值越大，則這兩指標之間的聯系越緊密[25]。由表5可知，抗壞血酸與水分含量呈極顯著負相關（P＜0.01），與蛋白質呈顯著負相關（P＜0.05），表明抗壞血酸的變化顯著影響水分及蛋白質的變化，進而影響鹽地堿蓬的營養品質；黃酮含量與亞硝酸鹽含量則呈顯著負相關（P＜0.05），表明亞硝酸鹽含量的變化影響了黃酮含量，進而影響鹽地堿蓬的功效品質；其他指標間相關性不顯著（P＞0.05）。綜上所述，鹽地堿蓬6個品質指標相互間具有一定的相關性，但是所統計的原始數據反映的信息存在重疊。由此進一步采取主成分分析法對6項品質指標簡化，提高鹽地堿蓬品質評價的分析效率，同時有利于提高統計信息的準確性。

表5 鹽地堿蓬成分指標之間的相關性分析Table 5 Correlation analysis of component indexes of Suaeda salsa

2.5 鹽地堿蓬成分指標的主成分分析及綜合評價

對來自24份鹽地堿蓬樣本中的成分指標含量進行主成分分析，得出主成分的特征值、貢獻率、主成分載荷矩陣及特征向量矩陣等。由表6可知，共提取到兩個特征值大于1的主成分，貢獻率分別為54.427%和25.292%，累積貢獻率為79.719%，表明這兩個主成分可以基本反映本試驗測定的所有成分指標的信息。各主成分特征值、對原始性狀載荷及對表型的貢獻率如表6所示。

表6 總方差解釋Table 6 Explanation of total variance

載荷值反映了各品質指標對主成分矩陣中的權重，數值絕對值的大小反映了原始變量對于因子影響的強度，正負反映了方向[26]。圖1、表7顯示了主成分分析載荷值的分布，水分、抗壞血酸、亞硝酸鹽和黃酮在第一主成分上有較高載荷，說明第一主成分主要反映了這些元素的信息，其中水分、亞硝酸鹽在第一主成分上呈正向分布，載荷值分別為0.821和0.794，抗壞血酸和黃酮呈負向分布，載荷值分別為?0.781和?0.866。可見，負向作用大于正向作用。且抗壞血酸含量與水分、蛋白質，黃酮與亞硝酸鹽均呈顯著相關性（表5），故選擇抗壞血酸和黃酮為第一主成分的代表指標。氨基酸、蛋白質在第二主成分上有較高載荷，其中氨基酸呈正向分布，載荷值為0.801，蛋白質呈負向分布，載荷值?0.610。可見，正向作用大于負向作用，故選擇氨基酸作為第二主成分的代表指標。最終確定抗壞血酸、黃酮和氨基酸作為不同區域鹽地堿蓬品質評價的核心指標。

圖1 主成分分析荷載圖Fig.1 load diagram of PCA results

表7 主成分載荷矩陣Table 7 Principal component loading matrix

為了消除不同單位及數據量綱的影響，對品質指標原始數據進行標準化處理，采用F1和F2兩個新變量來代替原來的6個變量，得出以下主成分表達式：

其中，F1和F2為2個主成分，X1～X6為6個品質指標含量經標準化后的數據。

以每個主成分分別對應的方差貢獻率占累積方差貢獻率的比例作為權重，計算綜合評價得分F綜。

根據綜合評價模型計算不同區域鹽地堿蓬的得分并進行排序，如表8所示，總得分越高表明該地區鹽地堿蓬的綜合品質越好，8個區域鹽地堿蓬中，排名前三的樣本編號依次為S6、S1、S3，說明南堡區、一場及七場的鹽地堿蓬品質表現好，但南堡區鹽地堿蓬樣本檢測出亞硝酸鹽含量超過國家標準（小于4 mg/kg）[12]，S2即二場鹽地堿蓬主成分綜合得分最低，品質表現最差。

表8 主成分綜合得分和排序Table 8 Comprehensive scores and ranking of principal components

2.6 鹽地堿蓬成分指標的聚類分析

鹽地堿蓬各成分指標數據較為離散，不易直觀地進行相近程度的比較。聚類分析可同時對大量性狀進行綜合考察[27]。利用系統聚類法對不同區域鹽地堿蓬進行聚類分析，構建樹系圖（圖2），將樣本劃為不同類群進行評價。由圖可知，在平方歐式距離15處可將24份樣本分為三類：第一類為S1、S3、S5、S6，第二類為S4、S7、S8，第三類為S2。從總體數據來看，不同地區樣品間具有一定差異，其中S2與其他樣品差異較大，距離為 25 時就可以歸為不同的類型；在距離為1時所有樣本完全分離，說明雖然24份堿蓬樣本來自于不同區域，但仍有較強相似性。結合主成分分析綜合得分和排名可知，第一類的品質為優，第二類的品質為一般，第三類的品質為差，即一場、七場、柳贊鎮和南堡區的鹽地堿蓬品質較好，二場的鹽地堿蓬品質最差，聚類分析結果與主成分分析結果基本一致，表明聚類分析和主成分分析均可用來分析鹽地堿蓬的成分指標，綜合評價不同區域鹽地堿蓬品質優劣。研究結果與劉丙花[27]和李躍紅[28]等采用兩種方法分別對不同品種藍莓品質分析和不同產地紅心獼猴桃品質的評判結果一致。

圖2 不同地區鹽地堿蓬的聚類分析圖Fig.2 Cluster analysis diagram of Suaeda salsa from different producing areas

3 結論

不同區域鹽地堿蓬品質存在明顯差異，亞硝酸鹽含量差異最大，水分含量差異最小。采用主成分分析對8個區域鹽地堿蓬6個品質性狀進行主成分分析研究，提取前2個主成分，累積貢獻率達到79.72%，篩選出抗壞血酸、黃酮和氨基酸含量3個核心指標。結合系統聚類結果可知，南堡區、一場及七場的鹽地堿蓬品質較好，二場的鹽地堿蓬品質最差，綜合運用主成分分析和聚類分析方法可以簡化鹽地堿蓬成分評價指標，有助于優良品質特性的鹽地堿蓬的評價與篩選。結合土壤鹽分和速效養分結果分析，表明土壤鹽分、速效鉀含量高，能夠顯著提升鹽地堿蓬蛋白質和亞硝酸鹽含量，但抑制了總黃酮含量的積累，建議鹽地堿蓬栽培發展中著重關注土壤鹽分和速效養分含量。本試驗對于人工質控栽培鹽地堿蓬提供依據，可為鹽地堿蓬的質量評價提供可靠的分析方法與參考依據，為進一步的綜合開發利用和產業發展提供數據支持。但鹽地堿蓬品質差異還可能與多糖、脂質、膳食纖維含量或者其他無機離子等因素有關，在后續的研究中需要加入更多的評價指標，以期更好地為鹽地堿蓬品質篩選提供理論指導。