重組蔗糖磷酸化酶表達培養基的優化及化學試劑對酶活的影響

張 蕙，周曉梅，張 彪，孫 曉，李文杰, ，李拖平

（1.吉林師范大學博達學院食品科學與工程學院，吉林四平 136000；2.沈陽農業大學食品學院，遼寧沈陽 110866；3.吉林師范大學生命科學學院，吉林四平 136000；4.沈陽市婦嬰醫院，遼寧沈陽 110011）

蔗糖磷酸化酶（EC2.4.1.7，Sucrose phosphorylase，SPase）屬于糖基水解酶第13家族，是催化轉移葡萄糖苷鍵的特異性酶，能催化蔗糖發生磷酸解作用，生成1-磷酸葡萄糖（glucose-1-phosphate, Glc1P）和D-果糖以及其逆反應[1?2]。由于該催化特性，SPase長期以來一直用于生產Glc1P。此外，SPase結構穩定，具有廣泛的底物特異性，在食品、藥品、化妝品等領域上均有廣泛的應用,如可催化半乳糖、鼠李糖、果糖等物質合成不同的低聚糖；修飾和改造含有醇羥基、酚羥基及羧基的化合物；或可以將曲酸糖苷化、催化氫醌合成熊果苷等[3?5]；也可以用于合成某些不穩定物質的衍生物，如將葡糖基轉移到抗壞血酸上，使其穩定性和水溶性得到提升[6]。

SPase主要存在于乳酸菌和雙歧桿菌中，有利于其能量代謝[7]。Kagan等[8]首次從Leuconostoc mesenteroides中發現SPase后，研究人員相繼從不同的微生物中發現了該酶,如Pseudomonas saccharophila[9?10]、Stococcus mutans[11]、Bifidobacterium adolescentis[12]等。但通過野生菌株發酵獲得的SPase產率較低，難以滿足大規模的工業化生產。所以，采用基因工程技術構建重組SPase工程菌，實現該酶的高效表達是一條合理且有利的途徑。常用于構建重組SPase工程菌的菌株有大腸桿菌和枯草芽孢桿菌，如E. coliRosetta（DE3）、E. coliBL21、B.subtilisWS11等[13?14]。

目前，國內外對于重組SPase工程菌的研究大多是工程菌的構建、應用、固定化、酶學性質分析和表達條件的優化等[15?20]，但幾乎沒有對重組SPase表達培養基成分優化的研究。同時，化學試劑對SPase的影響直接關乎到該酶的貯存和使用，而這方面的研究也少之又少。因此，本文對來源于雙歧桿菌的SPase基因的重組菌株E. coliBL21/pET30-SPase表達培養基的成分進行了優化，研究了不同的培養基成分對SPase表達的影響，并探究了常見化學試劑和金屬離子化合物對該酶活性的影響，以期為SPase的高效生產提供理論與技術的支撐條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

重組菌E. coliBL21/pET30-SPase 由本實驗室保存。其中，SPase基因克隆自Bifidobacterium longumJCM 1217（AB303838），與載體pET-30連接，轉化至大腸桿菌BL21中[21]；蛋白分子量Marker 北京索萊寶科技有限公司；卡那霉素、異丙基硫代-β-D-半 乳 糖 苷（isopropylthio-β-D-galactoside，IPTG）、BCA蛋白濃度測定試劑盒 北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；葡萄糖磷酸變位酶（phosphoglucomutase，PGM，100 U/mg）、6-磷酸葡萄糖脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PDH，150 U/mg）、1,6-二磷酸葡萄糖（Glucose-1,6-diphosphate，Glc 1,6-bP） 上海瑞永生物科技有限公司；其他試劑 均為國產分析純；LB培養基 按文獻配制[5]。

HNY-21恒溫培養振蕩器 天津市歐諾儀器儀表有限公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫療器械廠；TGL-16M高速冷凍離心機上海盧湘儀離心機儀器有限公司；SLPe超聲波細胞粉碎機 廣州中善儀器儀表有限公司；T6紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組菌E. coliBL21/pET30-SPase的表達從LB固體平板上挑取單菌落接種于3 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培養基中，37 ℃，180 r/min震蕩培養過夜。按1%接種量接種于50 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培養基中，繼續震蕩培養至OD600=0.5～0.6時，加入終濃度為0.5 mmol/L IPTG，在30 ℃條件下振蕩培養20 h[22]。

1.2.2 SPase粗酶液的制備及純化 將目的菌培養液離心（4 ℃、10000 r/min、10 min），收集菌體，用50 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.0）洗滌兩次沉淀。然后，超聲破碎細胞（超聲3 s、間歇5 s、共3 min，功率100 W），4 ℃、15000 r/min離心30 min得到粗酶液（上清液）。使用Ni-NTA柱以含60 mmol/L咪唑的磷酸緩沖液（20 mmol/L，pH7.0）對粗酶液進行洗脫純化得到目標蛋白。

1.2.3 SPase的酶活性測定 將150 μL酶液和150 μL蔗糖溶液（10 mmol蔗糖、50 mmol/L磷酸緩沖液，pH7.0）在30 ℃反應30 min后，立即煮沸滅活10 min。加入300 μL反應液在30 ℃中反應30 min，然后在340 nm處測定吸光度值。反應液為2.5 U/mL PGM、2 U/mL G6PDH、20 μmol/L Glc 1,6-bP、2 mmol/L NADP+、10 mmol/L MgCl2、50 mmol/L MOPS緩沖液（pH7.0）[23?24]。采用標準曲線法，按照標準曲線公式y=2.1387x（R2=0.9992）計算酶與底物反應過程中生產的Glc1P。

酶活性定義為：在30 ℃、pH7.0條件下，以蔗糖為底物，每分鐘產生1 μmol的Glc1P所需的酶量為1個酶活力單位（U）。

總酶活（U）為50 mL培養基中的總酶活。

1.2.4 蛋白含量測定及SDS-PAGE分析 以牛血清蛋白（BSA）為標準品，使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質含量。SDS-PAGE采用12%濃縮膠和5%分離膠進行電泳，用考馬斯亮藍R-250染色。總蛋白（mg）為50 mL培養基中蛋白的總量。

1.2.5 培養基成分的篩選 以50 mL LB培養基為基礎，并作為空白對照，將不同的碳源、氮源、穩定劑、金屬離子分別加入到LB培養基中，按1.2.1方法培養。以總蛋白和總酶活為評價指標，考察其對SPase表達的影響。根據參考文獻[25?27]確定實驗方案如下：在考察碳源對SPase表達的影響時，分別向LB培養基中添加的碳源為0.5%葡萄糖、0.5%可溶性淀粉、0.5%蔗糖和0.5%丙三醇；在考察氮源對SPase表達的影響時，分別向LB培養基中添加的氮源為0.5%NaNO3、0.5%NH4Cl、0.5%（NH4）2SO4和0.5%尿素；在考察穩定劑對SPase表達的影響時，分別向LB培養基中添加的穩定劑為0.1%BSA、0.1%精氨酸、0.1%維生素C和0.1%FeCl2；在考察金屬離子對SPase表達的影響時，分別向LB培養基中添加的金屬離子為0.1%KH2PO4、0.1%MgSO4、0.1%CuSO4和0.1%ZnCl2。

1.2.6 正交試驗優化 在單因素實驗的基礎上，選擇對重組SPase的表達有顯著性提高的因素，并根據現有的相關研究中較優的因素水平[25?27]確定正交試驗的因素水平（表1）。以淀粉、K+和Mg2+為變量因子，以總酶活為評價指標，進行三因素三水平的正交試驗，研究三種培養基成分的協調作用對SPase表達的影響。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal experiment

1.2.7 化學試劑對重組SPase酶活性的影響 依據參考文獻[28]的方法，向純化的重組SPase酶液中分別加入不同的化學試劑或金屬離子化合物，考察其對重組SPase酶活性的影響。分別加入0.1%的吐溫80、BSA、丙三醇、山梨醇、維生素C、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）；1%的吐溫80、BSA、丙三醇、山梨醇、維生素C、SDS；1 mmol/L的FeSO4、MgSO4、ZnCl2、CuSO4、MnSO4、CaCl2；10 mmol/L的FeSO4、MgSO4、ZnCl2、CuSO4、MnSO4、CaCl2。將對照組和實驗組在30 ℃下保溫1 h，測定其酶活。以未經試劑處理的酶液作為對照，酶活設定為100%，計算處理后的相對酶活。

1.3 數據處理

本文中的每組實驗均平行三次，采用Excel 2010軟件制圖，應用SPSS 18.0軟件進行正交試驗的方差分析和顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 碳源和氮源對重組SPase表達的影響

碳源和氮源是培養基的重要組成部分，是微生物生長代謝的能量來源和物質基礎，與目的蛋白的表達有著密切的聯系[29]。對培養基中碳源的研究結果如圖1a所示，向LB培養基中添加0.5%可溶性淀粉可顯著提高SPase的總酶活和總蛋白含量（P＜0.05），而蔗糖和丙三醇的添加雖然提高了蛋白的表達量，但其酶活性極顯著降低（P＜0.01），推測這可能是由重組蛋白的高水平表達易形成無活性的包涵體[30]。氮源對SPase表達的影響如圖1b所示，實驗所用的四種氮源中，NaNO3對目的蛋白表達無顯著的影響（P＞0.05），其余三種氮源均較為明顯的抑制了SPase蛋白的表達。并且，通過總蛋白含量和總酶活所表現的不同氮源和碳源對蛋白表達的影響與SDSPAGE分析結果（圖1c）相一致（目的蛋白的分子量為56.51 kDa）。

圖1 碳源和氮源對重組SPase表達的影響Fig.1 Effects of carbon and nitrogen sources on the expression of recombinant sucrose phosphorylase

2.2 穩定劑和金屬離子對重組SPase表達的影響

穩定劑除了可以影響酶的活性和穩定性以外，對微生物的生長也具有一定的影響效應[31]。如圖2a所示，四種穩定劑對重組SPase在大腸桿菌中的表達均起到了抑制作用，SDS-PAGE分析（圖2b）也顯示了同樣的結果。其中，維生素C和FeCl2極顯著（P＜0.01）抑制了蛋白的表達，這可能是由于維生素C和FeCl2抑制了大腸桿菌的生長，從而使菌密度和SPase的表達水平降低，導致總蛋白和總酶活較低。

圖2 穩定劑和金屬離子對重組SPase表達的影響Fig.2 Effects of stabilizers and metal ions on the expression of recombinant sucrose phosphorylase

金屬離子是微生物生長繁殖及產物合成中的重要輔助因子，作為其生理活性物質的組成或生理活動的調節物，對酶的活性具有一定的激活作用[32]。由圖2c可知，培養基中添加0.1% K+或Mg2+均提高了SPase的總酶活和總蛋白含量，促進了大腸桿菌的生長及SPase的表達。而Cu2+和Zn2+的添加則完全抑制了菌體的生長和SPase的表達。這可能是由于Cu2+和Zn2+的金屬毒性較強，當其與微生物接觸后，會破壞微生物的蛋白質結構，使微生物體內的一系列生化反應發生紊亂，從而導致了微生物的死亡[33]。同時SDS-PAGE的分析（圖2d）結果也支持了總酶活和總蛋白含量的測定結果，可明顯的看出K+或Mg2+處理的目標蛋白條帶較粗。

2.3 培養基最優組成的正交試驗結果

由表2、表3可知，在三個因素中對SPase表達影響的大小順序為C＞B＞A，即Mg2+的添加量對SPase表達的影響表現為極顯著（P＜0.01），K+和淀粉的添加量對SPase表達的影響表現為顯著（P＜0.05）。培養基的最優組合為A2B2C1，即淀粉的添加量為0.5%、K+的添加量為0.1%和Mg2+的添加量為0.05%。根據所得最優培養基組合進行驗證試驗，SPase的總酶活平均值達到1207.83 U，比該酶在單因素實驗的基礎培養基中表達的總酶活提高了3.6倍，其優化結果在SPase的工業化生產中具有較大的應用潛力。

表2 正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal test

表3 正交試驗的方差分析Table 3 Analysis of variance of orthogonal experimental results

2.4 化學試劑和金屬離子對重組SPase穩定性的影響

當某些化學試劑與酶混合后，有可能影響酶的分子結構，近而對酶的活性產生不同程度的影響[34]。從表4的結果可以看出，低濃度（0.1%）的吐溫80和高濃度（1%）的BSA對SPase的活性具有一定的提升作用，這是由于BSA具有穩定酶的作用，能有效地保護酶不被降解，從而促進了酶的活性。濃度為0.1%的BSA、丙三醇和山梨醇對酶活的影響不大；而0.1%的維生素C、SDS，1%的吐溫80、維生素C、SDS、丙三醇和山梨醇對酶活性有不同程度的抑制作用，這可能是由于其改變了酶的活性中心結構，導致了該酶的活性部分或全部喪失。其中，作為蛋白質變性劑的SDS抑制了90%以上的酶活性，因為SDS分子上的硫酸基團與蛋白質表面的氨基酸緊密結合，其分子上的烷基則與蛋白質的疏水部分緊密結合，從而使蛋白質變性失活。吐溫80屬于非離子型表面活性劑，在低濃度時與酶的疏水活性中心產生相互作用，有利于底物與酶的結合，從而促進酶的活性；在高濃度時吐溫80與酶的活性中心緊密結合，使底物無法進入到酶的活性中心，而無法催化其他化學反應，從而抑制了酶的活性[35]。

表4 化學試劑對重組SPase穩定性的影響Table 4 Effect of chemical reagents on stability of recombinant SPase

另一方面，金屬離子在酶的催化反應過程中也均有重要的作用，可使底物直接結合到酶的活性部位,或者通過可逆地改變金屬離子的氧化態從而調節氧化還原反應，或者通過靜電穩定及屏蔽負電荷等途徑參與酶的催化。國內外已有大量的研究表明，將金屬離子作為激活劑添加到在酶反應液中是一種改善酶活性或穩定性的行之有效的方法[36?38]。如表5所示，1 mmol/L的Fe2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+、Ca2+均可以影響到SPase的穩定性，經這些離子處理后的酶活均有不同程度的下降。而較高濃度（10 mmol/L）的Fe2+和Mg2+則對SPase的活性和穩定性表現出較好的促進作用。

表5 金屬離子對重組SPase穩定性的影響Table 5 Effect of metal ions on stability of recombinant SPase

3 結論

通過單因素實驗和正交試驗結果表明，雖然作為碳源的淀粉和無機離子K+和Mg2+對SPase的表達具有一定的促進作用，但三者的協同作用是重組SPase工程菌（E.coliBL21/pET30-SPase）高效表達SPase的優選條件，可以在很大程度上提高SPase的表達效率。其中，在LB培養基的基礎上添加0.5%淀粉、0.1% K+和0.05% Mg2+的組合，可提高到3.6倍的表達效率。與現有的重組SPase表達優化研究相比，該優化方式提高目的蛋白表達的水平較高，在SPase的工業化生產上具有一定的實際應用價值。另外，通過一些適當濃度的表面活性劑如吐溫80，或一些金屬離子如Fe2+和Mg2+可以對重組SPase的活性起到一定的促進作用，對該酶的高效利用提供了理論依據，也為日后進一步研究該酶的性質奠定了基礎。但本試驗也存在不足之處，在粗酶液的制備過程中存在影響酶活的操作，如細胞破碎。因此，在日后的科研工作中，將對此類操作步驟進行優化，以期進一步提高該酶的活性。