黃金茶揮發油提取工藝優化、成分分析及抗氧化研究

萬 敏，姚于飛，付王威，吳睿婷，游慧婷，景 智，李文娟,

（1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌 330047；2.江西中醫藥大學附屬醫院，江西南昌 330006；3.南昌大學口腔醫學院，江西南昌 330006）

山臘梅常見于安徽、江蘇、江西、福建和貴州等地，是江西省上饒市婺源縣山區特色資源[1]。山蠟梅的嫩葉，可經加工制作而成的功能性綠茶，因資源珍稀、功效奇特，被譽為“綠葉黃金”，命名為黃金茶。黃金茶為不發酵茶，通過揉捻等工藝制得，民間一直將其作為清涼解暑，健胃消食，治腹脹痛，止咳除煩的“藥食同源”的天然食材，經常飲用對身體具有一定的防護作用，現代臨床實驗證實，黃金茶具有良好的止咳平喘、免疫調節、促進消化、減少體脂等作用[2]。黃金茶的活性成分繁復，主要含有揮發油、多糖、生物堿、黃酮、香豆素、鯊肌醇、東莨菪苷、異嗪皮啶等物質。黃金茶香味濃郁，揮發油含量高，被認為是黃金茶中的主要活性成分[3]。目前有關茶飲品的活性功能研究中，抗氧化能力是體現其功效的重要指標[4]。大量研究已證實，有效清除自由基，抑制活性氧的形成的作用，是綠茶多種活性功能的物質基礎[5]。然而國內外對黃金茶揮發油的抗氧化活性研究未見報道。

目前，揮發油的提取方法研究較多，如水蒸氣蒸餾法[6]、同時蒸餾萃取法[7]、超臨界流體萃取[8]、固相微萃取技術[9]等。常規提取黃金茶揮發油的方法主要集中在水蒸氣蒸餾法，此方法設備要求不高，操作簡單，但得率較低[10?11]。同時蒸餾萃取法優點是實驗簡單，操作方便，溶劑用量較少，安全環保，缺點是試驗所需溫度較高，揮發油部分成分易揮發，且揮發油組分復雜，當蒸餾溫度過高時，樣品會發生水解、氧化或熱分解現象[12]。超臨界流體萃取法是比較新穎和熱門的提取方法，提取得率較高，但設備要求也較高，生產會比較受到限制[13?14]。微波輔助水蒸氣蒸餾法被定義為從植物中提取揮發油的一種替代方法，微波輔助萃取具有諸多優點，選擇性高、溶劑消耗量少等，且易于操作，適用面較廣[15?16]，但微波輔助水蒸氣蒸餾法提取黃金茶揮發油相關研究未見文獻報道用。

因此，本文主要研究在微波輔助水蒸氣蒸餾法提取過程中微波時間、料液比和水蒸氣蒸餾時間對黃金茶揮發油得率的影響，從而選出提取黃金茶揮發油最佳工藝。并且，本實驗在金茶揮發油提取工藝優化的基礎上，應用GC-MS對黃金茶揮發油的化學成分進行分析同時，進一步研究黃金茶揮發油的抗氧化作用，旨在為黃金茶的綜合利用提供新的技術支撐和理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃金茶 由江西省婺源婺源縣龍塢山蠟梅專業合作社于2019年6月采摘山臘梅嫩葉，并制備而成；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT） 購于美國Sigma公司；正己烷、無水硫酸鈉、無水乙醇、鐵氰化鉀、磷酸鹽緩沖液、三氯乙酸、三氯化鐵、乙二胺四乙酸二鈉、硫酸亞鐵、氯化鈉、菲啰嗪 均為國產分析純，購于西隴化工股份有限公司。

METTLER TOLEDO AL104電子天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司；Anke TGL-16G-A高速臺式冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠；M1-L201B型微波爐 美的制冷家電集團；SKM型數顯恒溫電熱套 山東鄄城華魯電熱儀器有限公司；UT6紫外可見分光光度計 屹譜儀器制造（上海）有限公司；Milli-Q plus超純水儀 購于美國Millipore公司；7890A-5975C GC-M聯用儀 安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃金茶揮發油的制備 稱取40 g黃金茶樣品，超純水浸泡后微波處理，待冷卻后應用于水蒸氣蒸餾法提取，分別以微波時間（5、10、15、20和25 min）、料液比（1:20、1:25、1:30、1:35和1:40 g/mL）和水蒸氣蒸餾時間（2、3、4、5和6 h）的3個因素進行試驗，考察單因素對微波輔助水蒸氣蒸餾法提取黃金茶揮發油的影響。提取過程中保持微沸狀態，收集餾出液，加入無水硫酸鈉進行干燥，得到黃金茶揮發油，計算得率。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 微波時間對黃金茶揮發油得率的影響 稱取40 g黃金茶樣品，在超純水中用料液比1:30 g/mL浸泡，分別以微波時間（5、10、15、20和25 min）對樣品進行微波處理，待冷卻后采用水蒸氣蒸餾法提取4 h，考察微波時間對微波輔助水蒸氣蒸餾法提取黃金茶揮發油的影響。

1.2.2.2 料液比對黃金茶揮發油得率的影響 稱取40 g黃金茶樣品，在超純水中用料液比（1:20、1:25、1:30、1:35和1:40 g/mL）浸泡，微波處理10 min，待冷卻后采用水蒸氣蒸餾法提取4 h，考察料液比對微波輔助水蒸氣蒸餾法提取黃金茶揮發油的影響。

1.2.2.3 水蒸氣蒸餾時間對黃金茶揮發油得率的影響 稱取40 g黃金茶樣品，在超純水中用料液比1:30 g/mL浸泡，微波處理10 min，待冷卻后采用水蒸氣蒸餾法提取2、3、4、5和6 h，考察水蒸氣蒸餾時間對微波輔助水蒸氣蒸餾法提取黃金茶揮發油的影響。

1.2.3 正交試驗 在單因素實驗結果的基礎上，采用L9（34）正交試驗來確定微波輔助水蒸氣蒸餾法提取黃金茶揮發油的最佳生產工藝，試驗因素為微波時間、料液比和水蒸氣蒸餾時間。試驗設計如表1所示。正交試驗完成后進行驗證試驗，分別稱取黃金茶3份，根據優化提取工藝驗證，計算其揮發油得率，取三次平均值與正交試驗結果比較，得到的揮發油在0～4 ℃下保存備用。

表1 正交試驗因素與水平設計Table 1 Orthogonal experimental factors and levels

1.2.4 黃金茶揮發油得率的計算

式中，m1：黃金茶揮發油重量，g；m0：黃金茶重量，g；W，黃金茶揮發油得率，%。

1.2.5 GC-MS分析黃金茶揮發油組成

1.2.5.1 樣品的前處理 精密量取最優工藝條件下制備的黃金茶揮發油7.5 μL，加入1.5 mL正己烷，并用無水硫酸鈉除水，5000 r/min離心10 min，取上清液得到待測溶液，通過0.22 μm有機濾膜過濾后直接進樣分析。

1.2.5.2 色譜條件 HP-5 MS毛細管色譜柱（250 μm×30 m, 0.25 μm），載氣為高純氮氣，柱流量為1.0 mL·min?1，進樣量為1 μL，分流進樣，分流比20:1，進樣口溫度280 ℃，升溫程序：柱溫70 ℃，保持2 min，10 ℃·min?1的速率升至100 ℃，隨后以2 ℃·min?1的速率升至123 ℃并保持3 min，再以5 ℃·min?1的速率升至160 ℃，10 ℃·min?1的速率升至220 ℃，2 ℃·min?1的速率升至230 ℃并保持5 min。

1.2.5.3 質譜條件 接口溫度280 ℃，電子轟擊（EI）能量70 eV，離子源溫度230 ℃，MS回級桿溫度150 ℃溶劑延遲7 min，全掃描，質荷比20～500 amu。結合NIST數據庫并查閱文獻對揮發油組分進行鑒定，采用峰面積歸一化法計算各組分的相對百分含量。

1.2.6 黃金茶揮發油抗氧化活性測定

1.2.6.1 對DPPH自由基的清除作用 參考尹術華等[17]和Nuengchamnong等[18]，現 配 濃 度 為2×10?4mol/L的DPPH自由基溶液，取最優工藝條件下制備的黃金茶揮發油和BHT分別用無水乙醇稀釋為10.00、20.00、40.00、60.00、80.00和100.00 mg/mL待測液，分別取0.05 mL樣品溶液加入2 mL EP管中，然后加入0.2 mL DPPH自由基溶液，再加入0.05 mL乙醇渦旋混勻，避光30 min，517 nm測定吸光度值A，記為A2；對照組將0.2 mL DPPH自由基溶液更換為0.2 mL乙醇進行試驗，517 nm測定吸光度值A，記為A1；空白組將0.05 mL黃金茶揮發油更換為0.05 mL乙醇進行試驗，517 nm測定吸光度值A，記為A0。

根據公式計算清除率I（%）：

1.2.6.2 還原力的測定 參考Zhao等[19]和吳楊洋等[20]，測定前將最優工藝條件下制備的黃金茶揮發油、BHT分別用無水乙醇稀釋成10.0、20.0、30.0、40.0和50.0 mg/mL濃度的待測液。把0.75 mL的1%的鐵氰化鉀溶液、0.75 mL的0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.6）和0.75 mL的待測液相互混合，在向其中加入0.75 mL的10%的三氯乙酸，在4 ℃的條件下離心10 min（3000 r/min）。離心后取1.5 mL上清液，加入1.5 mL的蒸餾水和0.1%的三氯化鐵溶液，完全混勻后，在室溫下靜置反應10 min。然后在700 nm處測定其吸光度，記錄吸光度值為A，用蒸餾水做空白調零。

1.2.6.3 金屬離子螯合能力 參考劉瓊等[21]實驗，最優工藝條件下制備的黃金茶揮發油用無水乙醇稀釋成5.0、10.0、20.0、30.0和40.0 mg/mL 濃度的黃金茶揮發油待測液，乙二胺四乙酸二鈉（C10H14N2O8Na2）用超純水稀釋成5.0、10.0、20.0、30.0和40.0 mg/mL濃度的乙二胺四乙酸二鈉待測液，分別配好實驗使用試劑，50 μmol/L的FeSO4溶液、0.15 mol/L的NaCl溶液和300 μmol/L的菲啰嗪。分別取0.2 mL待測液加入4 mL EP管中，依次加入0.2 mL FeSO4溶液、1.4 mL NaCl溶液和0.2 mL菲啰嗪，混勻，靜置10 min，562 nm處測定吸光值A2；對照組將0.2 mL待測液更換為0.2 mL超純水進行試驗，562 nm處測定吸光值A0；空白組將0.2 mL菲啰嗪更換為0.2 mL NaCl溶液進行試驗，562 nm處測定吸光值A1。

根據公式計算樣品對金屬鐵離子的螯合活性I（%）：

1.3 數據處理

采用Excel、SPSS 22.0軟件處理和分析微波輔助水蒸氣蒸餾法提取黃金茶揮發油實驗中所得數據，并作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 微波時間的確定 由圖1可知，隨著微波時間的增加，黃金茶揮發油得率有所增加，但幅度不大。當微波時間超過10 min之后，黃金茶揮發油得率緩慢降低，微波時間為25 min時，得率快速下降。這可能是因為微波對黃金茶茶葉細胞破壞其細胞膜的作用，微波處理時間越長，細胞被破壞的程度就越大，被釋放到環境中的活性化合物也越多，從而揮發油得率增加。但當處理黃金茶揮發油的微波時間超過10 min之后，由于內部過熱，極性水導致植物體內的壓力梯度增加細胞被劇烈破壞，細胞壁破裂，從而油更容易被釋放到周圍溶液當中去，從而降低了黃金茶揮發油得率[22]。因此最佳微波時間為10 min。

圖1 微波時間對黃金茶揮發油得率的影響Fig.1 Effects of microwave time on the yield of essential oil from Chimonanthus nitens Oliv

2.1.2 料液比的確定 從圖2可知，料液比越高，黃金茶揮發油得率越高，但料液比超過1:30時，黃金茶揮發油得率降低。這是因為料液比較低時，茶葉與水接觸面積較小，浸潤度較低，不利于揮發油釋放，導致得率較低，也容易發現結焦現象。隨著料液比的增加，更多的極性水進入黃金茶茶葉細胞，水在加熱時迅速升溫，加快細胞破裂使得揮發油能較多的被水蒸氣帶出，得率增加。但當料液比過高時，黃金茶揮發油在水中的溶解變大，導致部分油損失在水介質中，且液面過厚也會影響微波的吸收[22]。因此最佳料液比為1:30。

圖2 料液比對黃金茶揮發油得率的影響Fig.2 Effects of ratio of material to liquid on the yield of essential oil from Chimonanthus nitens Oliv

2.1.3 水蒸氣蒸餾時間的確定 由圖3可知，隨著水蒸氣蒸餾時間的增加，黃金茶揮發油得率增加。當水蒸氣蒸餾時間超過5 h之后，黃金茶揮發油得率降低。結合文獻報道[23]，推測隨著時間的增加，黃金茶揮發油不斷的隨著水蒸氣從黃金茶茶葉中分離出來，但過長的時間導致揮發油被破壞或除介質，使得黃金茶揮發油得率下降。因此，最佳水蒸氣蒸餾時間為5 h。

圖3 水蒸氣蒸餾時間對黃金茶揮發油得率的影響Fig.3 Effects of steam distillation time on the yield of essential oil from Chimonanthus nitens Oliv

2.2 正交試驗結果分析

以黃金茶揮發油得率為評價指標，每次試驗重復三次，取平均值。通過表2可知，微波時間對揮發油得率影響最大，其他依次是水蒸氣蒸餾時間、料液比，最佳工藝是A2B2C2，即微波時間10 min，料液比1:25 g/mL，水蒸氣蒸餾時間5 h。由表3可知，微波時間、水蒸氣蒸餾時間對試驗結果影響極顯著（P＜0.01），這與極差分析結果一致。根據優化提取工藝驗證，揮發油得率分別為1.7987%、1.7684%、1.7706%，平均值為1.7792%，高于正交試驗結果，重現性好，確定優化提取工藝為A2B2C2。

表2 正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal test

表3 正交試驗方差分析結果Table 3 Tests of Between-Subjects effects

2.3 GC-MS結果分析

對黃金茶揮發油進行GC-MS檢測分析，共分離出23個峰，并采用面積歸一化法計算黃金茶揮發油各組分相對含量，總離子流圖見圖4，黃金茶揮發油成分的GC-MS分析結果見表4。數據顯示，有21種成分被鑒定出，鑒定出的物質成分占總峰的93.27%，黃金茶揮發油主要以萜類化合物為主，是該揮發油香氣的主要成分。在鑒定出的化合物中，相對含量在1%以上的有15種，占被檢測物質總量的88.75%，其中（1-甲基-4-丙-1-烯-2-基環己基）乙酸酯的含量達到50.67%，其次是α-蒎烯（6.92%）、α-乙酸松油酯（5.77%）、環氧化蛇麻烯II（3.96%）、偽檸檬烯（3.21%）、右旋大根香葉烯（3.12%）等。

圖4 黃金茶揮發油的總離子流色譜圖Fig.4 Total ion flow chromatography of Chimonanthus nitens Oliv essential oil

表4 黃金茶揮發油成分的GC-MS分析結果Table 4 GC-MS analysis of essential oil from Chimonanthus nitens Oliv

目前黃金茶揮發油組分的相關檢測研究未見報道。徐年軍等[10]報道了山臘梅葉中揮發油成分分析，與本實驗獲得的黃金茶揮發油的組分對比發現主要成分相似，但也有一定的差異，主要體現在成分（1-甲基-4-丙-1-烯-2-基環己基）乙酸酯的不同，黃金茶中該乙酸酯含量為50.67%。與山臘梅相比，黃金茶揮發油成分的差異因素，可能與黃金茶的制備或揮發油的提取過程有關：原材料山臘梅葉中醇類物質在熱環境下氧化合成為酯類物質，但確切的因素需要實驗進一步研究。

2.4 黃金茶揮發油抗氧化活性測定

2.4.1 黃金茶揮發油對DPPH自由基的清除作用DPPH自由基的還原能力能使深紫色溶液被中變成無色或淺黃色，這可以作為評價抗氧化的方法[24?25]。結果表明，在各濃度梯度中黃金茶揮發油呈現出一定的劑量效應關系，如圖5所示，其清除DPPH自由基能力隨著濃度的升高而增大，黃金茶揮發油的IC50為81.60 mg/mL，當濃度達到100 mg/mL時，清除作用達到56.13%，而2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）的清除率達到95.42%，與BHT相比較，黃金茶揮發油對DPPH自由基的清除作用低于BHT的抗氧化作用。以上結果顯示，黃金茶揮發油具有一定DPPH自由基的清除作用。

圖5 DPPH自由基清除作用Fig.5 DPPH free radical scavenging effect

2.4.2 黃金茶揮發油對還原力的測定 實驗結果如圖6所示，黃金茶揮發油在10 mg/mL時與陽性對照組還原力最為接近，當濃度繼續增大時，還原力處于緩慢上升的趨勢，黃金茶揮發油濃度在40～50 mg/mL時還原力呈現快速上升趨勢，但相比較于BHT，黃金茶揮發油對鐵離子的還原能力較弱。以上結果表明黃金茶揮發油具有較強的還原力。

圖6 還原力的測定Fig.6 Reduction force determination

2.4.3 黃金茶揮發油對金屬離子螯合能力的測定 如圖7所示，黃金茶揮發油對金屬離子螯合能力的IC50為17.16 mg/mL，且黃金茶揮發油對亞鐵離子螯合能力隨呈現劑量依賴性，當濃度達到40 mg/mL時，金屬離子螯合能力達到81.06%，此時，EDTA的金屬離子螯合能力達到93.94%，與EDTA相比，黃金茶揮發油的金屬離子螯合能力較低。以上結果可知黃金茶揮發油具有的螯合亞鐵離子能力。

圖7 金屬離子螯合能力Fig.7 Chelating ability of metal ions

3 結論

通過單因素實驗和正交試驗確認微波輔助水蒸氣蒸餾法提取黃金茶揮發油的最優工藝為微波時間10 min，料液比1:25 g/mL，水蒸氣蒸餾時間5 h，此條件下黃金茶揮發油得率為1.7792%。通過GCMS分析可知黃金茶揮發油中含有21種化學成分，其主要成分是為酯類化合物和萜類化合物。從抗氧化實驗可以看出黃金茶揮發油對DPPH自由基清除能力、還原力和金屬離子螯合能力都呈現出抗氧化作用。以上結論說明，黃金茶揮發油是一種具有抗氧化作用的有待開發的天然活性物質，但由于黃金茶揮發油的組成成分豐富，其抗氧化機理及清除自由基活性成分分析仍需進一步研究。