響應面法優化軟棗獼猴桃枝條總三萜提取工藝及其體外抗炎活性分析

孫宏萊，時得友，李麗麗，夏 俊，扎依湄科N.V.，斯克里普琴科N.V.，劉德江,

（1.佳木斯大學生命科學學院，黑龍江佳木斯 154007；2.中-烏農林技術開發與應用國際合作聯合實驗室，黑龍江佳木斯 154007；3.烏克蘭國家科學院M.M.格里什科國家植物園，烏克蘭基輔 01014）

軟棗獼猴桃（Actinidia arguta（Sieb.et Zucc.）Planch.ex Miq.）是獼猴桃科獼猴桃屬的多年生大型落葉藤本植物，其果實表皮無毛，口感細膩，富含多種氨基酸等生物活性物質[1]。該植物主要分布于我國東北三省、華北、西北各省區，在國外如俄羅斯、日本等也有分布[2]。查閱國內外文獻可知軟棗獼猴桃擁有多種藥理活性成分[3?4]，總三萜是軟棗獼猴桃中的主要藥理活性成分之一，具有抗腫瘤[5?10]、抗氧化[11]、抗炎[12?13]和降血糖[14]等藥理作用，其中抗腫瘤活性最強[5?10]。

該研究以佳木斯大學農林實驗實習基地修剪下來的軟棗獼猴桃枝條為原料，通過超聲提取法提取總三萜，以乙醇濃度、液料比、提取時間、超聲功率4因素設計了四因素三水平共29個實驗點優化總三萜提取工藝。此外，非固醇消炎藥因其解熱鎮痛的作用而在臨床上廣泛用于治療炎癥，但食用會對胃腸道和腎臟造成損傷，因此，尋找天然物質代替非固醇消炎藥已成為研究的熱點問題[15?16]。本研究后續以抑制透明質酸酶活性、牛血清白蛋白變性程度為因素，進而考察所制得總三萜的體外抗炎活性能力，旨在為軟棗獼猴桃資源的進一步研究和工業生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

軟棗獼猴桃枝條 采于佳木斯大學農林實驗實習基地（46°46′58″N, 130°21′6″E）；齊墩果酸標準品成都普思生物科技股份有限公司；牛血清白蛋白、透明質酸鈉、透明質酸酶（500 U）、雙氯芬酸鈉、Ehrlich試劑 上海源葉生物科技有限公司；乙酰丙酮 麥克林；無水氯化鈣 天津市凱通化學試劑有限公司；5%香草醛-冰乙酸 現配現用；高氯酸、無水乙醇、石油醚 均為分析純；試驗所用蒸餾水 均為實驗室自制。

UV-8000紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；101-1A電熱鼓風干燥箱、DZ-2BCIV真空干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；JFSD-70實驗室粉碎磨 上海嘉定糧油儀器有限公司；YCHH0301電動振篩機 宜昌市夷陵區華恒設備制造廠；800Y全能小鋼磨 永康市鉑歐五金制品有限公司；FA2004電子天平 上海浦春計量儀器有限公司；DK-98-II電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；R-1001N旋轉蒸發儀 鄭州長城科工貿有限公司；SHZ-III型循環水真空泵 上海亞榮生化儀器廠；KQ-500DE型數控超聲波清洗 昆山市超聲儀器有限公司；L-550臺式低速離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；SJIA-5FE真空冷凍干燥機寧波市雙嘉儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗材料的處理 用清水將軟棗獼猴桃枝條洗凈，于電熱鼓風干燥箱內烘干，將烘干后的軟棗獼猴桃枝條粉碎后過50目電動振篩機，得到的粉末塑封保存。

1.2.2 軟棗獼猴桃枝條總三萜的提取 準確稱取3.00 g干燥至恒重的軟棗獼猴桃枝條粉末于錐形瓶中，按一定液料比加入乙醇溶液，連續超聲提取，離心（4000 r/min，10 min），抽濾，濾液減壓濃縮至一定體積，加入10～15倍體積的石油醚于1000 mL分液漏斗中萃取脫脂，重復萃取3次，冷凍干燥得粗總三萜粉末。稱取適量的凍干粉末，加入一定的乙醇溶液于容量瓶中定容，配成樣品，備用。

1.2.3 齊墩果酸標準曲線的建立 準確稱取真空干燥至恒重的齊墩果酸標準品2 mg于10 mL容量瓶中，加入無水乙醇定容后搖勻，得濃度為0.2 mg/mL齊墩果酸標準溶液。精密移取齊墩果酸標準溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分別置于10 mL的具塞試管中，于60 ℃恒溫水浴鍋中揮干，流水冷卻，分別加入新配制的5%香草醛-冰乙酸試液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，立即振蕩混勻，于60 ℃水浴鍋加熱15～20 min，流水冷卻10 min，加入5 mL冰乙酸，搖勻后于紫外可見分光光度計中進行全波長掃描，確定548 nm處為最大吸收波長，于此波長下測定吸光度值，以齊墩果酸質量（mg）為橫坐標，吸光度值為縱坐標，建立標準曲線。按下式計算總三萜的提取量：

式中：N為總三萜提取量（mg/g）；m為樣品中總三萜質量（mg）；A為稀釋倍數（1000）；M為軟棗獼猴桃枝條粉末干重（g）。

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 乙醇濃度對總三萜提取量的影響 稱取5份3.00 g軟棗獼猴桃枝條粉末，分別加入濃度為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液90 mL。設置超聲溫度60 ℃，提取時間40 min，超聲功率300 W，考察乙醇濃度對AABTT提取量的影響。

1.2.4.2 液料比對總三萜提取量的影響 稱取5份3.00 g軟棗獼猴桃枝條粉末，分別加入30、60、90、120、150 mL 60%乙醇溶液，液料比分別為10:1、20:1、30:1、40:1、50:1。設置超聲溫度60 ℃，提取時間40 min，超聲功率300 W，考察液料比對AABTT提取量的影響。

1.2.4.3 超聲溫度對總三萜提取量的影響 稱取5份3.00 g軟棗獼猴桃枝條粉末，加入90 mL 60%乙醇溶液。分別設置超聲溫度40、50、60、70、80 ℃，提取時間40 min，超聲功率300 W，考察超聲溫度對AABTT提取量的影響。

1.2.4.4 提取時間對總三萜提取量的影響 稱取5份3.00 g軟棗獼猴桃枝條粉末，加入90 mL 60%乙醇溶液。分別設置提取時間20、30、40、50、60 min，超聲溫度60 ℃，超聲功率300 W，考察提取時間對AABTT提取量的影響。

1.2.4.5 超聲功率對總三萜提取量的影響 稱取5份3.00 g軟棗獼猴桃枝條粉末，加入90 mL 60%乙醇溶液。分別設置超聲功率200、250、300、350、400 W，超聲溫度60 ℃，提取時間40 min，考察超聲功率對AABTT提取量的影響。

1.2.5 響應面試驗 在單因素實驗的基礎上，設計優化軟棗獼猴桃枝條總三萜提取量的響應面試驗，綜合考慮各因素對AABTT的影響可知：超聲溫度的影響最小，因而直接選用超聲溫度為50 ℃，選取乙醇濃度（A）、液料比（B）、提取時間（C）、超聲功率（D）作為試驗因素，以軟棗獼猴桃枝條中總三萜的提取含量為響應值。依據Box-Benhnken Design（BBD）試驗設計原理進行四因素三水平的響應面試驗設計，共29組實驗，中心實驗為12、14、21、23、29組，其余組為非中心實驗。詳情見表1。三維頂點為A、B、C、D的取值，零點為區域中心點，重復5次零點實驗用以估計實驗誤差[17]。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels table of response surface experiment

1.2.6 透明質酸抑制試驗 精密移取濃度0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/mL的樣品溶液各0.5 mL，分別加入305 U/mL的透明質酸酶液0.5 mL，37 ℃恒溫培養20 min，加入CaCl2溶液0.1 mL，37 ℃恒溫培養20 min，加入0.5 mg/mL透明質酸鈉溶液0.5 mL，37 ℃恒溫培養40 min，室溫靜置10 min，加入蒸餾水0.5 mL、NaOH溶液0.1 mL、乙酰丙酮溶液0.5 mL，沸水浴15 min，立即冰浴冷卻10 min，室溫靜置10 min，加入Ehrlich試劑1 mL，振蕩后加入無水乙醇至8 mL，室溫靜置30 min，于530 nm處測定吸光度值，以雙氯芬酸鈉作為對照。

式中：M為透明質酸酶活性抑制率（%）；A為蒸餾水與透明質酸酶、透明質酸鈉混合溶液的吸光度值；B為蒸餾水與醋酸緩沖液的吸光度值；C為樣品與透明質酸酶、透明質酸鈉混合溶液的吸光度值；D為樣品與醋酸緩沖液的吸光度值。

1.2.7 抑制牛血清白蛋白變性試驗 精密移取濃度0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/mL的樣品溶液各0.5 mL，分別加入1 %的牛血清白蛋白溶液各5 mL，使用1 mol/L鹽酸溶液調節pH至6.3，37 ℃恒溫培養20 min，加熱至51 ℃恒溫培養20 min，于660 nm處測定吸光度值，以雙氯芬酸鈉作為對照。

牛血清白蛋白變性抑制率的計算公式為：

式中：N為牛血清白蛋白變性抑制率（%）；E為牛血清白蛋白與樣品混合溶液的吸光度值；F為牛血清白蛋白與蒸餾水的吸光度值。

1.2.8 數據處理 所有實驗數據重復3次，數據結果以平均數（average）±標準差（SD）形式表示，采用SPSS 21.0、Excel 2010、Origin 85軟件分析處理所得數據，采用CalcuSyn Demo軟件計算半抑制率IC50。

2 結果與分析

2.1 齊墩果酸標準曲線

以齊墩果酸質量（mg）為橫坐標，吸光度值為縱坐標，建立標準曲線，作圖得到總三萜濃度（X）與吸光度值（Y）的線性回歸曲線，回歸方程為：Y=6.2925X?0.0787，相關系數r=0.9991，表明總三萜的濃度與吸光度值的標準曲線線性關系良好，如圖1所示。

圖1 齊墩果酸標準曲線Fig.1 Standard curve of Oleanolic acid

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 乙醇濃度對總三萜提取量的影響 由圖2可知，當濃度低于70%時，隨著乙醇濃度的升高，軟棗獼猴桃枝條總三萜提取量隨之增大，當濃度高于70%時，總三萜提取量逐漸下降。可能是因為總三萜的溶解性與溶劑的極性有關，70%乙醇溶液極性可能剛好適合總三萜溶解，因此較低較高的乙醇濃度都不利于其充分的溶解[18]。因而選擇60%、70%、80%作為響應面的優化水平。

圖2 乙醇濃度對總三萜提取量的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on total triterpenes extraction

2.2.2 液料比對總三萜提取量的影響 由圖3可知，當液料比小于30:1 mL/g時，隨著液料比的增大，軟棗獼猴桃枝條總三萜提取量隨之增大，當液料比大于30:1 mL/g時，總三萜提取量逐漸下降。原因可能為溶劑體積過小，總三萜無法徹底溶解，但溶劑體積過大，還會溶出其他的雜質[19]。因而選擇20:1、30:1、40:1 mL/g作為響應面的優化水平。

圖3 液料比對總三萜提取量的影響Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on total triterpenes extraction

2.2.3 超聲溫度對總三萜提取量的影響 由圖4可知，當溫度低于50 ℃時，隨著超聲溫度的升高，軟棗獼猴桃枝條總三萜提取量隨之增大，當溫度高于50 ℃時，軟棗獼猴桃枝條總三萜提取量逐漸下降。原因可能為乙醇是易揮發性溶劑，超聲溫度越高乙醇揮發的速率越快，或者溫度過高會影響總三萜結構的穩定性[20?21]。考慮不同溫度下總三萜提取量的變化不大，因此確定響應面法優化時適宜的超聲溫度為50 ℃。

圖4 超聲溫度對總三萜提取量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on total triterpenes extraction

2.2.4 提取時間對總三萜提取量的影響 由圖5可知，當時間小于30 min時，隨著提取時間的增長，軟棗獼猴桃枝條總三萜提取量隨之增大，當時間大于30 min時，總三萜提取量逐漸下降。原因可能為提取時間過長會破壞總三萜的結構使其結構發生了部分轉化，或者溶出了更多的雜質[22?23]。因而選擇20、30、40 min作為響應面的優化水平。

圖5 提取時間對總三萜提取量的影響Fig.5 Effect of extraction time on total triterpenes extraction

2.2.5 超聲功率對總三萜提取量的影響 由圖6可知，當超聲功率小于350 W時，隨著超聲功率的增大，軟棗獼猴桃枝條總三萜提取量隨之增大，當超聲功率大于350 W時，總三萜提取量逐漸下降。原因可能為超聲功率達到一定強度可以產生更好的空化效果，但功率過大可能會破壞總三萜的結構[24]。因而選擇300、350、400 W作為響應面的優化水平。

圖6 超聲功率對總三萜提取量的影響Fig.6 Effect of ultrasonic power on total triterpenes extraction

2.3 響應面法優化

2.3.1 響應面回歸模型的建立及顯著性檢驗 響應面試驗結果見表2。

表2 Box-Benhnken試驗設計與結果Table 2 Design and results of Box-Benhnken experiment

利用Design-Expert 8.0.6軟件對表2數據進行回歸擬合，得到以軟棗獼猴桃枝條總三萜提取量（Y）為目標函數的二次多項回歸方程：Y=57.31+2.87A+1.42B+0.56C?0.53D+0.38AB+0.65AC+3.63AD+2.45 BC+2.40BD+1.07CD?5.51A2?3.34B2?2.11C2?1.89D2

由ANOVA分析（詳情見表3）可知，模型F=31.52，P＜0.0001，建立的模型極顯著（P＜0.01）；失擬項F=2.77，P=0.1692，失擬項不顯著（P＞0.05）。表明所選用的二次多項模型的擬合程度良好。模型R2=0.9693，表明該回歸方程相關性較好，Radj2=0.9385，表明實驗數據93.85%的變異性可用此回歸模型來解釋。各因素對軟棗獼猴桃枝條總三萜提取量的影響大小為：乙醇濃度（A）＞液料比（B）＞提取時間（C）＞超聲功率（D）。

表3 方差分析結果Table 3 Varivance analysis results

2.3.2 交互因素分析 響應面圖和等高線圖可以直觀的反映出各因素的交互作用對響應值的影響，等高線的形狀反映出兩因素間交互作用的強弱，圓形表示兩因素交互作用不顯著無促進作用，橢圓形表示交互作用顯著存在促進作用[2]。

由圖7可知，乙醇濃度和液料比對軟棗獼猴桃枝條總三萜提取量的影響，提取時間固定在30 min，超聲功率固定在350 W，總三萜的提取量隨乙醇濃度和液料比的增大呈現先增后減的趨勢，乙醇濃度對應的曲面坡度較液料比的陡峭，說明乙醇濃度對總三萜提取量的影響程度大于液料比。等高線呈圓形，表示乙醇濃度和液料比交互作用不顯著，兩因素間無促進作用，與回歸方程中AB項方差分析結果正相符。

圖7 乙醇濃度與液料比對總三萜提取量影響的響應面圖和等高線Fig.7 Response surface and contour plots of the interactive effects of ethanol concentration and liquid-solid ratio on total triterpenes extraction

由圖8可知，乙醇濃度和提取時間對軟棗獼猴桃枝條總三萜提取量的影響，液料比固定在30:1 mL/g，超聲功率固定在350 W，總三萜的提取量隨乙醇濃度和提取時間的增大呈現先增后減的趨勢，乙醇濃度對應的曲面坡度較提取時間的陡峭，說明乙醇濃度對總三萜提取量的影響程度大于提取時間。等高線呈圓形，表示乙醇濃度和提取時間交互作用不顯著，兩因素間無促進作用，與回歸方程中AC項方差分析結果正相符。

圖8 乙醇濃度與提取時間對總三萜提取量影響的響應面圖和等高線Fig.8 Response surface and contour plots of the interactive effects of ethanol concentration and extraction time on total triterpenes extraction

由圖9可知，乙醇濃度和超聲功率對軟棗獼猴桃枝條總三萜提取量的影響，液料比固定在30:1 mL/g，提取時間固定在30 min，總三萜的提取量隨乙醇濃度和超聲功率的增大呈現先增后減的趨勢，乙醇濃度對應的曲面坡度較超聲功率的陡峭，即超聲功率較低時，等高線比較平緩，乙醇濃度對總三萜的提取量影響不太顯著，但超聲功率達300 W時，等高線排列緊密，乙醇濃度對總三萜的提取量有顯著影響。同時發現乙醇濃度對總三萜提取量的影響程度大于超聲功率。等高線呈橢圓形，表示乙醇濃度和超聲功率交互作用顯著，兩因素間存在促進作用，與回歸方程中AD項方差分析結果正相符。

圖9 乙醇濃度與超聲功率對總三萜提取量影響的響應面圖和等高線Fig.9 Response surface and contour plots of the interactive effects of ethanol concentration and ultrasonic power on total triterpenes extraction

由圖10可知，液料比和提取時間對軟棗獼猴桃枝條總三萜提取量的影響，乙醇濃度固定在70%，超聲功率固定在350 W，總三萜的提取量隨液料比和提取時間的增大呈現先增后減的趨勢，液料比對應的曲面坡度較提取時間的陡峭，即提取時間較低時，等高線比較平緩，液料比對總三萜的提取量影響不太顯著，但提取時間達30 min時，等高線排列緊密，液料比對總三萜的提取量有顯著影響。同時發現液料比對總三萜提取量的影響程度大于提取時間。等高線呈橢圓形，表示液料比和提取時間交互作用顯著，兩因素間存在促進作用，與回歸方程中BC項方差分析結果正相符。

圖10 液料比與提取時間對總三萜提取量影響的響應面圖和等高線Fig.10 Response surface and contour plots of the interactive effects of liquid-solid ratio and extraction time on total triterpenes extraction

由圖11可知，液料比和超聲功率對軟棗獼猴桃枝條總三萜提取量的影響，乙醇濃度固定在70%，提取時間固定在30 min，總三萜的提取量隨液料比和超聲功率的增大呈現先增后減的趨勢，液料比對應的曲面坡度較超聲功率的陡峭，即超聲功率較低時，等高線比較平緩，液料比對總三萜的提取量影響不太顯著，但超聲功率達300 W時，等高線排列緊密，液料比對總三萜的提取量有顯著影響。同時發現液料比對總三萜提取量的影響程度大于超聲功率。等高線呈橢圓形，表示液料比和超聲功率交互作用顯著，兩因素間存在促進作用，與回歸方程中BD項方差分析結果正相符。

圖11 液料比與超聲功率對總三萜提取量影響的響應面圖和等高線Fig.11 Response surface and contour plots of the interactive effects of liquid-solid ratio and ultrasonic power on total triterpenes extraction

由圖12可知，提取時間和超聲功率對軟棗獼猴桃枝條總三萜提取量的影響，乙醇濃度固定在70%，液料比固定在30:1 mL/g，總三萜的提取量隨提取時間和超聲功率的增大呈現先增后減的趨勢，提取時間對應的曲面坡度較超聲功率的陡峭，說明提取時間對總三萜提取量的影響程度大于超聲功率。等高線呈圓形，表示提取時間和超聲功率交互作用不顯著，兩因素間無促進作用，與回歸方程中CD項方差分析結果正相符。

圖12 提取時間與超聲功率對總三萜提取量影響的響應面圖和等高線Fig.12 Response surface and contour plots of the interactive effects of extraction time and ultrasonic power on total triterpenes extraction

2.3.3 最佳工藝驗證試驗 試驗得出超聲提取法提取AABTT的理論條件為：乙醇濃度76.83%，液料比39.78:1 mL/g，提取時間40.00 min，超聲功率400.00 W，在此理論條件下，總三萜提取量為59.9151 mg/g。考慮到實際操作性，將試驗條件調整為，乙醇濃度77%，液料比40:1 mL/g，提取時間40 min，超聲功率400 W。為檢驗響應面法所得最優工藝條件的可靠性，重復3次試驗，所得平均提取量為58.42±0.36 mg/g，該結果與理論最大值接近，說明所得最優工藝參數準確可靠，表明該模型可以較好地預測軟棗獼猴桃枝條總三萜提取量。

2.4 透明質酸酶抑制效果

通過透明質酸酶活力抑制實驗評估樣品的抗炎活性[25]。由圖13可知，AABTT對透明質酸酶活力的抑制作用隨其濃度的增大而逐漸增強，質量濃度為4 mg/mL時，透明質酸酶活力抑制率達81.48%±0.48%。用CalcuSyn Demo軟件計算AABTT的透明質酸酶活力抑制率IC50為0.90 mg/mL，陽性對照雙氯芬酸鈉的IC50為0.39 mg/mL。

圖13 AABTT對透明質酸酶活力的抑制效果Fig.13 Inhibitory effects of AABTT on hyaluronidase activity

2.5 牛血清白蛋白抑制活性

以牛血清白蛋白為模型蛋白，通過檢測牛血清白蛋白的變性抑制率，間接反映AABTT的抗炎活性[26]。由圖14可知，AABTT對牛血清白蛋白變性的抑制作用隨其濃度的增大而逐漸增強，質量濃度為4 mg/mL時，牛血清白蛋白變性抑制率達71.09%±0.39%。用CalcuSyn Demo軟件計算AABTT的牛血清白蛋白變性抑制率IC50為1.06 mg/mL，陽性對照雙氯芬酸鈉的IC50為0.42 mg/mL。

圖14 AABTT對牛血清白蛋白變性的抑制效果Fig.14 Inhibitory effects of AABTT on bovine serum albumin degeneration

3 討論與結論

響應面法作為一種能有效解決多變量因素的數據統計方法，彌補了正交試驗只能組合因素水平、無法優化最佳工藝的缺點，本實驗在單因素實驗的基礎上，利用Box-Benhnken響應面法對軟棗獼猴桃枝條總三萜的超聲提取法提取條件進行優化，建立數學模型，研究表明乙醇濃度、液料比、提取時間、超聲功率均對軟棗獼猴桃枝條總三萜的提取量有一定影響，影響大小為，乙醇濃度＞液料比＞提取時間＞超聲功率。利用模型方程最終確定軟棗獼猴桃枝條總三萜的最佳提取工藝條件為，乙醇濃度77%，液料比40:1 mL/g，提取時間40 min，超聲功率400 W，在此條件下實際測得總三萜提取量為58.42±0.36 mg/g。結果與理論值擬合度良好，表明利用響應面法優化軟棗獼猴桃枝條總三萜提取量數據合理可靠，可為后續軟棗獼猴桃枝條總三萜的進一步研究和發展提供依據。

透明質酸酶活力抑制率達到81.48%±0.48%、牛血清白蛋白變性抑制率達到71.09%±0.39%，比陽性對照雙氯芬酸鈉抗炎活性略低，但都表現出了較好的劑量效應關系。數據顯示，軟棗獼猴桃枝條總三萜能夠抑制透明質酸酶的活性，防止透明質酸（玻尿酸）分解，產生炎癥反應；抑制牛血清白蛋白的變性，保護蛋白質復雜的空間結構，防止其生理功能的喪失，初步證實了軟棗獼猴桃枝條總三萜存在一定的抗炎活性，可有效的減少炎癥的產生和發展，維持生命活動的正常生理功能，但其抗炎作用機制還有待研究，為今后研究測定其對各類炎癥因子的抑制作用及相關機制提供了實驗基礎。